引用本文
万小铭, 曾伟斌, 雷梅, 陈同斌. 蜈蚣草孢子囊元素组成的X射线光谱分析[J]. 光谱学与光谱分析, 2022,42(2): 478-482.
WAN Xiao-ming, ZENG Wei-bin, LEI Mei, CHEN Tong-bin. Micro-Distribution of Elements and Speciation of Arsenic in the Sporangium of Pteris Vittata [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2022,42(2): 478-482.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2022)02-0478-05  
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蜈蚣草孢子囊元素组成的X射线光谱分析
万小铭1,2, 曾伟斌1,2, 雷梅1,2, 陈同斌1,2
1.中国科学院地理科学与资源研究所, 北京 100101
2.中国科学院大学, 北京 100049

作者简介: 万小铭, 女, 1986年生, 中国科学院地理科学与资源研究所副研究员 e-mail: wanxm.06s@igsnrr.ac.cn

收稿日期: 2020-12-23 修回日期: 2021-02-04 接受日期: 2021-02-04
基金: 国家自然科学基金项目(42077136), 中国科学院青年创新促进会项目(2017075)资助
摘要

砷超富集植物蜈蚣草具有超强的砷吸收和富集能力, 生物量大, 被认为是修复砷污染土壤的理想植物材料。 基于砷超富集植物蜈蚣草的植物修复技术已经推广应用到了我国20多个污染区的土壤修复实践中。 目前所报道的所有蜈蚣草均具有砷超富集能力, 并且该特性能够得到稳定遗传。 蜈蚣草是如何通过仅仅几十个微米的孢子将这种砷超富集能力传递给下一代? 与其他微区分析手段相比, 基于同步辐射X射线的荧光光谱和吸收光谱分析灵敏度高、 操作简便, 近年来被广泛应用到超富集植物的研究中, 它也使得研究几十个微米的孢子中砷及其他元素的分布成为可能。 为了揭示砷超富集植物蜈蚣草孢子的化学元素组成, 该研究采用同步辐射X射线荧光探针分析技术首次揭示了蜈蚣草的生殖细胞——孢子中砷、 铜、 锌等微量元素的浓度分布, 以及钾、 钙等大量元素的浓度分布; 并将砷的分布趋势与大量营养元素钾、 钙、 铁、 硫, 以及微量元素铜、 锌的分布趋势进行对比。 蜈蚣草的微区元素分布研究表明, 孢子囊中砷和钙、 砷和硫的分布特征具有相似性, 砷和硫、 钙更有可能同时聚集在孢子中。 这表明, 在孢子产生和萌发过程中, 砷、 硫和钙可能发挥着重要作用。 为了揭示变价元素砷在孢子中的存在形式, 采用同步辐射X射线吸收光谱首次揭示了蜈蚣草孢子中砷的微区形态, 结果表明, 蜈蚣草孢子中砷的存在形态与羽叶一致, 以低价态的AsⅢ为主。 AsⅢ是活性和毒性都相对较强的一种砷存在形式。 这表明蜈蚣草孢子对于高毒性高活性的三价砷具有较强耐性。 通过采用高分辨率低检测限的X射线荧光探针和X射线吸收光谱技术, 揭示砷超富集植物蜈蚣草孢子中砷的分布和存在形式, 研究结果为了解蜈蚣草砷富集能力的遗传特性提供基础信息。

关键词: 同步辐射X射线吸收光谱; X射线荧光探针; 蜈蚣草; 孢子; 砷形态
中图分类号:X53 文献标志码:A
Micro-Distribution of Elements and Speciation of Arsenic in the Sporangium of Pteris Vittata
WAN Xiao-ming1,2, ZENG Wei-bin1,2, LEI Mei1,2, CHEN Tong-bin1,2
1. Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences (CAS), Beijing 100101, China
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract

The arsenic (As) hyperaccumulator Pteris vittata has super As accumulation ability and huge biomass, thus being ideal plant material for the phytoremediation of As-contaminated soil. Phytoextraction technology based on As hyperaccumulator P. vittata has been applied to more than 20 soil remediation projects in China. So far, the reported P. vittata populations all showed strong accumulation ability of As, and this hyperaccumulation ability was able to be stably inherited from the progenitor. How can this fern pass As hyperaccumulation ability on to the next generation through spores (the germ cell of fern plants) with the size of several micrometers? Compared to the traditional chemical analysis methods, Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence Microprobe Analysis and X-Ray Absorption Spectroscopy show high sensitivity and are easy to operate, recently widely used to study hyperaccumulating mechanisms. This study investigated the micro-distribution pattern of As in spores using Synchrotron Radiation X-ray Fluorescence Microprobe Analysis micro-speciation of As in spores using Synchrotron Radiation X-ray Absorption Spectroscopy. The distribution of As was compared to that of potassium, calcium, iron, sulfur, copper and zinc. It has been found that the distribution of As, sulfur, and calcium was similar. It was indicating the role of their interaction in the stable inheritance of As hyperaccumulation. The micro speciation analysis indicated that the main species of As in spores and sporangium was arsenite (AsⅢ). Considering that AsⅢ has higher mobility and toxicity than arsenate in most organisms, the results indicated high tolerance of P. vittata to As throughout its life cycle. Using X-ray Fluorescence Microprobe Analysis and X-ray Absorption Spectroscopy with high resolution, results provide basic information for understanding the genetic characteristics of arsenic hyperaccumulation ability of P. vittata.

Keyword: Synchrotron radiation X-ray absorption spectroscopy; X-ray fluorescence microprobe; Pteris vittata; Spore; Arsenic speciation
引言

中国面临着严峻的土壤重金属污染现状, 其中砷污染由于其分布普遍性和危害严重性受到来自各领域的广泛关注。 砷超富集植物蜈蚣草具有超强的砷吸收和富集能力, 生物量大, 被认为是修复砷污染土壤的理想植物材料。 基于蜈蚣草的砷污染土壤植物修复技术取得良好的修复效果[1]。 蜈蚣草是一种蕨类植物, 具有两个彼此独立生活的世代交替, 即单倍体的原叶体世代和双倍体的孢子体世代。 成熟孢子体进行无性的减数分裂, 产生孢子, 孢子在湿润基质上产生小的线状或叶状的配子体(原叶体)。 原叶体成熟后, 出现性器官— — 精子器和颈卵器, 湿润条件下受精, 发育成具有根、 茎、 叶的孢子体[2]。

目前所报道的所有蜈蚣草均具有砷超富集能力[3, 4], 并且该特性在多个连续世代能够得到稳定遗传。 蜈蚣草是如何通过仅仅几十个微米的孢子将这种砷超富集能力传递给下一代? 同步辐射X射线荧光探针分析技术(synchrotron radiation X-ray fluorescence microprobe analysis)和同步辐射X射线吸收光谱(synchrotron radiation X-Ray absorption spectroscopy)是依托同步加速器产生的高能射线进行微区分析的手段[5, 6]。 与其他微区分析手段相比, SRXRF分析灵敏度高、 操作简便, 近年来被广泛应用到超富集植物的研究中, 它也使得研究几十个微米的孢子中As及其他元素的分布成为可能[7]。 本研究采用同步辐射X射线荧光光谱微区技术研究了蜈蚣草孢子中各种化学元素的组成, 包括大量营养元素钾、 钙、 铁、 硫, 以及微量元素砷、 铜、 锌在孢子囊中的形态分布。 同时, 砷作为一种变价元素, 存在价态显著影响砷的迁移性和植物可利用性[8], 砷在孢子中的主要存在形态目前还鲜有研究, 本文通过同步辐射X射线微区吸收近边结构(synchrotron radiation micro X-ray absorption near edge structure, SR μ-XANES)研究了砷在孢子中的存在形式, 并与羽叶和孢子囊中的砷形态进行对比。

1 实验部分
1.1 样品

温室培养蜈蚣草, 选择成熟羽叶的中部羽片的中部位置, 去离子水淋洗, 立即采用包埋剂包埋后冷冻, 在切片机上切片, 切片厚度选择20 μm, 选择切片时注意选择带孢子羽片, 密封保存在-30 ℃冰箱中待测。

1.2 方法

采用日立S-3000N型扫描电子显微镜获得孢子囊的表面形貌, 选择合适视野进行拍照观察, 加速电压为15 kV。 孢子囊微区元素分布的扫描在北京正负电子对撞机的4W1B同步辐射X射线荧光分析实验站上进行。 测定时贮存环的电子能量为2.2 GeV, 束流强度为78~120 mA。 调节水平和垂直两个狭缝, 将入射白光的光斑限为20 μm× 20 μm, 样品与入射光束成45° 。 探测器为美国PGT Si(Li)固体探测器及能谱仪系统, 探头的铍窗厚度为7.5 μm, 能量分辨率为134 eV(5.89 keV处)。 探测器与样品的距离根据得到的能谱信号进行调整, 样品与探测器的距离分别为50 mm并保持在样品的测试过程中固定不变。 通过450倍光学显微镜监视样品, 微机程控三维样品移动平台, 使X射线照射扫描点上, 移动平台步进精度为1 μm· 步-1。 每个扫描点测量时间为100 s, 测量的荧光信号输入多道能谱仪, 得到同步辐射X射线微束激发植物样品的能谱图。 数据的分析采用WinQXAS软件, 扣除背景值后计算各元素峰面积, 所获得的元素计数用流强和电离室常数做归一化处理。

孢子囊的微区砷形态在上海应用物理研究所上海光源BL15U1-硬X射线微聚焦及应用(微束)光束线站上进行。 测定时贮存环的电子能量为3.5 GeV, 采用荧光模式, 将光斑(约3 μm× 5 μm)固定在孢子上, 进行近边谱的收集。 As参比物质选用液体的亚砷钠、 砷酸二氢钠、 用亚砷酸盐和10倍摩尔比的还原性谷胱甘肽合成的As(Ⅲ )-GSH以及二甲基胂酸钠(DMA), 分别代表As(Ⅲ ), As(Ⅴ ), As(Ⅲ )-SH以及As(Ⅴ )-C, 浓度均为1 000 mg· L-1。 对获得的X射线吸收近边谱进行边前背景扣除以及归一化处理后, 选取能量为11 840~11 940 eV的近边谱进行样品主要组分线性组成分析。

2 结果与讨论

孢子囊群着生在蜈蚣草羽叶背面叶缘, 可以看出孢子囊饱满, 且大部分孢子仍然在孢子囊中, 尚未弹出(图1)。

图1 孢子囊扫描电镜图片Fig.1 SEM photo of sporangia

由图2和图3可以看出, 砷主要分布在孢子中, 最高计数达到1175, 而孢子囊中砷含量仅为200左右, 孢子中砷含量明显高于孢子囊。 孢子中的砷的空间分布鲜有研究, 而本研究表明, 孢子中的砷计数明显高于叶片。 在包括水稻、 小麦等的普通植物中, 重金属往往主要分布在根系, 向地上部转运比例较小, 而向种子中的迁移比例更小[9, 10]。 蜈蚣草孢子具有较高浓度的砷这一现象产生的机制还不清楚。 蜈蚣草是否通过含有高浓度砷的孢子将砷耐性和富集能力传递到后代? 这一问题还需要进一步研究揭示。

图2 蜈蚣草中孢子及孢子囊扫描范围示意图Fig.2 Illustration of the scanned area

图3 蜈蚣草孢子及孢子囊中的砷分布Fig.3 Arsenic distribution in sporangium of P. vittata

进一步通过同步辐射X射线吸收光谱(近边分析)表明, 孢子囊、 孢子中的砷形态与羽叶中一样, 均以AsⅢ 为主(图4)。

图4 蜈蚣草孢子囊、 孢子及羽叶中的砷形态Fig.4 Micro-speciation of As in sporangium, spores and pinnae of P. vittata

已有研究表明, AsⅢ 是蜈蚣草地上部分砷的主要存在形态[11], 但针对蜈蚣草孢子中砷的微区形态的研究还较少。 本研究首次揭示了蜈蚣草孢子中的砷形态也为AsⅢ 。

本研究表明, 孢子和孢子囊中砷同样以AsⅢ 为主。 AsⅢ 是砷形态中活性较强的一种形态。 砷超富集植物将大量的高毒性AsⅢ 转移到生殖细胞是否与其稳定遗传的砷富集能力有关? 据报道, 蜈蚣草的孢子萌发后, 原叶体对砷具有极强耐性, 在添加砷为20 mmol· L-1的时候仍然表现出良好的生长状态, 体内能富集超过2.5%的砷[12]。 在孢子产生和萌发过程中高活性的砷所发挥的作用还有待进一步研究。 钾的分布与砷的分布不完全相似, 在孢子囊中钾的相对计数高于孢子, 右上角由于存在孢子囊和孢子的重叠, 导致砷和钾在图中右上角都含量较高。 有研究认为, 在蜈蚣草中砷和钾的分布呈现高度相似性, 表明砷和钾在蜈蚣草中可能进行协同运输, 这可能是蜈蚣草超富集砷的机理之一[13]。 而对孢子和孢子囊的微区分析表明, 砷和钾在孢子和孢子囊中的分布并不完全相似。 钙的分布与砷的分布具有一定程度的相似性, 孢子中的钙含量明显高于孢子囊。 蜈蚣草是钙质土的指示植物, 中国的蜈蚣草有50%都分布在钙质土壤上, 孢子中也具有相对较高的钙含量。 这表明蜈蚣草孢子的萌发对钙有特殊需求, 钙可能在孢子萌发过程中对其极化分裂具有重要意义。 同时, 钙的添加能够促进原叶体的生长和对砷的累积[12]。 砷和钙的微区沉淀以及砷在毛状体的聚集是蜈蚣草解砷毒的重要方式[14]。 钙在蜈蚣草生命周期中所发挥的作用及其与砷累积过程的交互作用还需进一步研究。 研究还对植物必需元素铁、 硫、 铜和锌在孢子和孢子囊中的微区分布进行了测定, 结果表明, 硫在孢子囊的局部区域集中分布, 与砷的分布具有一定程度的相似性。 其他元素均无明显规律。

对蜈蚣草孢子囊中砷(图3)和其他元素的分布研究表明, 与成熟植株中砷和钾具有相似分布的趋势不一样[13], 孢子囊中砷和硫[图5(a)]的分布没有明显相似性, 相反, 砷和钙[图5(b)]、 砷和硫[图5(d)]具有更多的相似性, 砷和硫、 砷和钙更有可能同时聚集在孢子中。 这表明, 在蜈蚣草产生孢子, 和孢子萌发过程中, 砷、 硫和钙可能都发挥着重要作用。 这为我们后续研究提供了重要的思路。

图5 蜈蚣草孢子及孢子囊中的元素分布
(a): 钾元素分布; (b): 钙元素分布; (c): 铁元素分布; (d): 硫元素分布; (e): 铜元素分布; (f): 锌元素分布Fig.5 Elements distribution in sporangium of P. vittata
(a): K distribution; (b): Ca distribution; (c): Fe distribution; (d): S distribution; (e): Cu distribution; (f): Zn distribution

3 结论

蜈蚣草的微区元素分布研究表明, 孢子囊中砷和钙、 砷和硫具有相似性, 砷和硫、 砷和钙更有可能同时聚集在孢子中。 在微区砷形态方面, 与羽叶一致, 孢子和孢子囊中砷都以AsⅢ 为主。 AsⅢ 是砷形态中活性较强的一种形态。 砷超富集植物将大量的高毒性AsⅢ 转移到生殖细胞的过程与其稳定遗传的砷富集能力之间的关系, 以及孢子萌发过程中高活性的砷所发挥的作用还有待进一步研究。

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