F-2500(HITACHI, Japan)荧光分光光度计; Cary Series(Agilent, USA)紫外-可见分光光度计; FL-SP920(Edinburgh Instruments, UK)荧光光谱仪用于荧光寿命的测定; J-815(JASCO, Japan)圆二色谱仪。

HSA(Sigma公司, USA); CQDs为实验室自行制备; 保泰松(phenylbutazone)、 乙酸对硝基苯酯(pNPA)、 硫黄素T(Th T)、 新亚铜试剂、 CuCl₂、 Ellman试剂(阿拉丁公司, 中国); 布洛芬(ibuprofen)(麦克林, 中国)。 实验所用试剂均为分析纯, 且使用前未经过进一步纯化。 实验用水均为超纯水。

1.2.1 CQDs的制备

根据文献通过水热法制备得到CQDs^[6], 并检测其中各元素含量占比以确定CQDs的大致分子量, 从而计算其摩尔浓度。

1.2.2 储备液制备

配制0.02 mol· L^-1, pH≈ 7.4的Tris-HCl缓冲溶液(含0.1 mol· L^-1 NaCl溶液)。 称取一定量HSA, 用缓冲液配制浓度为2.0× 10^-5 mol· L^-1的HSA储备溶液, 于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 荧光光谱

比色管中加入一定体积HSA, 然后加入不同体积CQDs储备液, 用缓冲液定容至刻度, 使溶液中CQDs最终浓度为0, 0.27, 1.08, 2.71, 5.42, 10.84, 16.27, 21.69, 27.11× 10^-6 mol· L^-1。 激发波长为285 nm, 激发和发射狭缝均为10 nm, 扫描295~500 nm范围内的发射光谱。 为消除内滤效应, 使用式(1)对荧光强度F进行校正^[7]。

Fcor=FobseAex+Aem2(1)

其中F_obs和F_cor分别为校正前后的荧光强度, A_ex和A_em为混合体系在激发和发射波长处的吸光度。

在波长差Δ λ 为15和60 nm条件下分别扫描260~310和250~300 nm波长范围内的同步荧光光谱。

以激发波长280 nm, 发射波长340 nm检测HSA荧光寿命, 所得时间分辨荧光光谱根据多指数衰变函数关系[式(2)]进行拟合^[8], i值一般取2。

$I(t)=\sum_{i}A_{i}e^{-t/\tau_{i}}$(2)

三维荧光测定时激发波长扫描范围在200~450 nm, 发射波长为200~500 nm。

在λ _ex=λ _em的条件下测定220~700 nm波长范围HSA的共振光散射光谱。

1.2.4 紫外-可见吸收光谱

溶液配制同1.2.3, 以缓冲溶液为参比扫描200~400 nm波长范围的吸收光谱。

1.2.5 圆二色谱

扫描波长范围190~260 nm时HSA的圆二色光谱, 平行扫描三次求其平均值。

1.2.6 HSA生理功能测定

1.2.6.1 类酯酶活性测定

将HSA与不同浓度CQDs混合培养30 min, 然后加入pNPA, 于400 nm处测定反应产物吸光度。

1.2.6.2 自由基清除能力测定

操作同1.2.6.1, 将pNPA(乙酸对硝基苯酯)改为Ellman试剂, 室温下混合培养, 测定体系在412 nm处的吸光度。

荧光光谱是研究蛋白质与小分子相互作用的重要手段, 可帮助理解HSA与CQDs结合的作用机制。 HSA的内源性荧光主要源于其组分中的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr), 且其分子结构中仅含有一个色氨酸(Trp-214), 位于蛋白质Ⅱ A亚结构域的疏水腔中^[9]。

2.1.1 荧光猝灭机制

图1显示了随着CQDs浓度增加HSA荧光光谱的变化。 可以看出, CQDs会引起HSA的荧光猝灭, 且随着浓度增加猝灭程度逐渐增大, 最大发射波长发生338→ 335 nm(3 nm)的蓝移。 由此判断CQDs与HSA发生了相互作用, 导致蛋白质氨基酸残基所处微环境发生一些改变。

图1

Fig.1

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	图1 CQDs与HSA相互作用的荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra for the interaction between HSA and CQDs

荧光猝灭通常包括动态、 静态以及动静态结合猝灭机制^[10], 其中动态猝灭由激发态荧光分子与猝灭剂之间扩散碰撞导致, 而静态猝灭则由荧光团与猝灭剂结合形成无荧光复合物引起。 通过Stern-Volmer方程对其进行描述^{[7, 9]}

F0F=1+Kqτ0[Q]=1+KsvQ(3)

其中, F₀与F分别为猝灭剂加入前后体系的校正荧光强度, K_q为猝灭速率常数, K_sv为Stern-Volmer猝灭常数, [Q]为猝灭剂浓度, τ ₀为无猝灭剂时生物大分子的平均寿命(一般取10^-8 s)。 猝灭机制可根据K_sv对温度的不同依赖关系以及蛋白质荧光寿命的变化加以判断。 温度升高会导致扩散碰撞粒子数增加, 使蛋白质荧光寿命减小, 动态猝灭常数增大, 但猝灭过程的最大扩散碰撞速率常数不会超过2.0× 10¹⁰ L· mol^-1· s。 发生静态猝灭时, 升高温度会降低所形成复合物的稳定性, 荧光寿命基本不变, 但猝灭常数将减小^[11]。 为判断猝灭机制, 做不同温度下F₀/F对[CQDs]的Stern-Volmer曲线, 结果见表1。 曲线线性关系良好且随温度升高斜率减小, 由此判断猝灭过程主要为静态猝灭。 且所得猝灭速率常数均大于动态猝灭的最大扩散碰撞速率常数, 同样表明猝灭机制属于静态猝灭。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同温度下HSA-CQDs体系的猝灭常数(Ksv)和猝灭速率常数(Kq) Table 1 The Stern-Volmer quenching constants (Ksv) and quenching rate constants (Kq) of HSA-CQDs system at different temperatures 温度T /K 猝灭常数Ksv /(L· mol-1) 猝灭速率常数Kq /(L· mol-1· s-1) 相关系数 r 293 1.33× 104 1.33× 1012 0.999 298 1.22× 104 1.22× 1012 0.999 303 1.19× 104 1.19× 1012 1 310 1.10× 104 1.10× 1012 1

表1 不同温度下HSA-CQDs体系的猝灭常数(Ksv)和猝灭速率常数(Kq) Table 1 The Stern-Volmer quenching constants (Ksv) and quenching rate constants (Kq) of HSA-CQDs system at different temperatures

蛋白质荧光寿命的变化也能有效反映猝灭机制, 图2为不同条件下HSA的荧光衰变曲线。 加入CQDs前后HSA的平均荧光寿命分别4.25, 4.47和4.53 ns, 荧光寿命没有明显改变, 表明CQDs与HSA的猝灭机制属于静态猝灭。

图2

Fig.2

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	图2 CQDs存在前后HSA的荧光衰变曲线Fig.2 Fluorescence decay curves of HSA in the absence and presence of CQDs

2.1.2 结合常数与结合位点数

根据Scatchard方程计算CQDs与HSA之间的结合常数K_A与结合位点数n^{[7, 9]}

lgF0-FF=lgKA+nlgQ(4)

式(4)中, F₀, F与[Q]的含义与2.1.1中相同, K_A为结合常数, n为结合位点数。 计算结果见表2, 随温度升高K_A逐渐减小, 符合静态猝灭过程。 n≈ 1, 说明CQDs在HSA上仅有一个结合位点。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同温度下HSA与CQDs相互作用的结合常数(KA)和结合位点数(n) Table 2 Binding constant (KA) and number of binding site (n) for CQDs-HSA interaction at different temperatures 温度T /K 结合常数KA /(L· mol-1) 结合位 点数n 相关系数 r 293 3.01× 104 1.074 8 0.997 0 298 1.61× 104 1.027 2 0.999 1 303 1.60× 104 1.028 3 0.999 1 310 1.48× 104 1.028 6 0.999 9

表2 不同温度下HSA与CQDs相互作用的结合常数(KA)和结合位点数(n) Table 2 Binding constant (KA) and number of binding site (n) for CQDs-HSA interaction at different temperatures

2.1.3 CQDs与HSA的结合区域

HSA上有两个主要结合位点(位点Ⅰ 和Ⅱ ), 位于蛋白质Ⅱ A和Ⅲ A亚结构域的疏水腔中^[12]。 phenylbutazone和ibuprofen对位点I和位点Ⅱ 具有特异性亲和力, 且在HSA的荧光检测范围内它们均不发出荧光^[13], 因此实验选用这两种试剂作为位点标志物, 通过竞争结合实验来大致判断CQDs在HSA上的结合位置。 将CQDs逐渐加入到已与分子探针结合的HSA溶液中, 结果如图3(a, b)所示。 可以看出, CQDs的存在仍会导致体系荧光猝灭, 但其对ibuprofen体系的猝灭程度更显著, 这说明ibuprofen对CQDs与HSA结合的干扰小, CQDs在蛋白质上的结合位点更靠近phenylbutazon。 计算加入位点探针后CQDs与HSA之间结合常数的变化, 得到phenlybutazone存在时K_A为6.23× 10³ L· mol^-1, ibuprofen存在时K_A为1.28× 10⁴ L· mol^-1。 加入phenylbutazone后结合常数明显下降, 说明CQDs会与phenylbutazone竞争HSA上的结合位点Ⅰ , 表明其在HSA上的结合位置更接近蛋白质的Ⅱ A亚结构域。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 位点探针对CQDs结合HSA的影响 (a): 保泰松; (b): 布洛芬Fig.3 Effect of the site-specific probes on the binding of CQDs to HAS (a): Phenylbutazone; (b): Ibuprofen

通过HSA的同步荧光光谱, 可进一步判定相互作用的结合位点。 当波长差Δ λ 为60和15 nm时, 分别获得色氨酸和酪氨酸的荧光光谱^[5], 结果如图4(a, b)。 色氨酸和酪氨酸的荧光均被CQDs猝灭, 且随着浓度增加, 猝灭程度不断增大。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 HSA的同步荧光光谱 (a): Δ λ =60 nm; (b): Δ λ =15 nmFig.4 Synchronous fluorescence spectra of HAS (a): Δ λ =60 nm; (b): Δ λ =15 nm

但两者相比, 色氨酸荧光猝灭程度更加显著, 由此判断CQDs与HSA的结合位点更接近色氨酸残基。 HSA仅含一个色氨酸, 位于Ⅱ A亚结构域的髓水腔中, 这验证了上述实验的结果。

2.1.4 作用距离

根据Fö rster提出的偶极-偶极非辐射能量转移理论, 当供体的荧光光谱与受体的吸收光谱足够重叠, 且两者之间的距离不超过8 nm时, 就可能发生非辐射能量转移^[7]。 HSA的荧光光谱与CQDs的吸收光谱部分重叠, 根据Fö rster非辐射能量转移公式, 对两者之间的作用距离r进行计算。 计算时取向因子K²取平均值2/3, 折射指数n取水和有机物的平均值1.336, Φ 取0.15, 得到J=1.01× 10^-15 cm³· L· mol^-1, R₀=1.74 nm, E=0.045 8, r=2.89 nm。 r< 8 nm, 说明HSA与CQDs之间很可能发生非辐射能量转移, 导致荧光猝灭。

2.1.5 热力学参数及作用力类型

通过计算作用过程的热力学参数, 可以判断参与CQDs与HSA结合过程的主要作用力。 当温度变化较小时Δ H可视为常数, 根据Van’ t Hoff方程[式(5)和式(6)]以lnK对1/T作图, 由曲线的截距和斜率计算出反应的Δ H, Δ S和Δ G, 相应结果列于表3中^{[12, 13, 14]}。 Δ G< 0, 表明HSA与CQDs的结合是自发进行的; Δ H< 0和Δ S< 0, 说明结合过程主要由焓驱动; 根据Ross等^[13]总结出的通过热力学参数判断作用力类型的规律, 确定氢键和范德华力是参与结合过程的主要作用力。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 HSA-CQDs体系的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters for the HSA-CQDs system 温度T /K 结合常数KA /(L· mol-1) 自由能变Δ G /(kJ· mol-1) 焓变Δ H /(kJ· mol-1) 熵变Δ S /(J· mol-1· K) 293 1.27× 104 -4.66 -13.08 -28.75 298 1.09× 104 -4.51 - - 303 1.08× 104 -4.37 - - 310 0.92× 104 -4.17 - -

表3 HSA-CQDs体系的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters for the HSA-CQDs system

lnK=-ΔHRT+ΔSR(5)

ΔG=ΔH-TΔS(6)

其中, K为相应温度下的结合常数, R为通用气体常数。

2.2.1 共振光散射(RLS)

散射光强度与粒子尺寸有关, 颗粒尺寸越大散射光越强, 因此RLS可用来研究生物大分子聚集状态的变化^[14]。 图5(a, b)为加入CQDs前后HSA的RLS光谱。 可以看出随着CQDs浓度增大, HSA的RLS强度呈现逐渐下降的趋势, 说明相互作用过程中HSA结构发生变化, 蛋白质尺寸减小, 聚集程度下降。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 HSA聚集状态变化 (a): HSA的RLS光谱; (b): HSA的RLS强度变化与[CQDs]浓度的相关性Fig.5 Changes in HSA’ s aggregation state (a): RLS spectra of HSA; (b): Relative RLS variation of HSA as a function with the concentration of CQDs

2.2.2 三维(3D)荧光光谱

3D荧光光谱可以较好地反映蛋白质的荧光信息, 了解蛋白质构象变化或结构损伤。 图6(a, b)分别为作用前后HSA的3D荧光光谱(已扣除CQDs的背景荧光), 其中Peak A主要反映与蛋白质三级结构相关的氨基酸残基的光谱信息; Peak B反映的是与蛋白质二级结构相关的HSA骨架结构的荧光特征^{[9, 13, 14]}。 实验发现加入CQDs后, 两荧光峰的荧光强度均明显猝灭并发生蓝移, 其中Peak B荧光猝灭程度更强(见表4)。 根据实验结果得出, CQDs与HSA的相互作用影响着蛋白质的二级和三级结构, 令蛋白质多肽骨架结构发生改变, 导致氨基酸残基周围微环境的疏水性增加。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 HSA及HSA-CQDs体系的三维荧光光谱Fig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of HSA (a) and HSA-CQDs system (b)

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 CQDs-HSA体系的三维荧光特征 Table 4 Three-dimensional fluorescence characteristics of CQDs-HSA system Systems Peak A (λ ex/λ em) Δ λ /nm Intensity (peak A) Peak B (λ ex/λ em) Δ λ /nm Intensity (peak B) Intensity (A∶ B) HSA 275/342 67 926.4 230/335 105 925.0 1.002∶ 1 HSA-CQDs 275/337 62 634.1 230/330 100 524.8 1.208∶ 1

表4 CQDs-HSA体系的三维荧光特征 Table 4 Three-dimensional fluorescence characteristics of CQDs-HSA system

2.2.3 圆二色(CD)光谱

CD光谱常用于研究蛋白质二级结构变化。 HSA的圆二色谱在208和222 nm存在两个负吸收峰, 反映了蛋白质的α -螺旋结构特征^{[9, 12, 13, 14]}。 加入CQDs前后HSA的CD光谱如图7所示, 计算得到HSA二级结构的百分含量。 加入CQDs后HSA在208和222 nm处的吸收峰明显增强, α -螺旋含量由34.1%增加到43.1%, β -拐角由27.2%降至17.3%, 无规则卷曲无明显变化。 α -螺旋增加说明相互作用改变了蛋白质所形成的氢键网络, 导致其卷曲折叠程度增大。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 加入CQDs后HSA的圆二色谱Fig.7 Circular dichroism spectra of HSA after adding CQDs

2.2.4 紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱

UV-Vis吸收光谱也可用于研究相互作用过程中蛋白质结构变化。 随CQDs浓度增加HSA的吸收光谱如图8所示, 其中在约208 nm有一强吸收峰, 这是多肽骨架结构的特征峰; 在约278 nm处的较小吸收峰, 可提供蛋白质氨基酸残基微环境的相关信息^{[9, 13]}。 可以发现当CQDs浓度增加时, HSA在208 nm处的吸收峰强度逐渐降低, 278 nm处的吸收峰也缓慢减小, 说明相互作用后HSA酰胺键周围微环境受到了干扰, 多肽骨架结构发生改变, 导致氨基酸残基周围微环境也发生变化。 吸收光谱的改变还证明HSA与CQDs之间发生的是静态猝灭, 与2.1.1中的结论一致。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 CQDs存在时HSA的紫外-可见吸收光谱Fig.8 UV-Vis Absorption spectra of HSA in the presence of CQDs

根据以上实验结果, 分析相互作用导致蛋白质二级和三级结构发生改变的可能原因: CQDs由于尺寸较小, 可以通过氢键和范德华力的作用结合到蛋白质Ⅱ A亚结构域的疏水腔附近甚至进入疏水腔中, 从而导致蛋白质α -螺旋含量增加, HSA进一步卷曲折叠, 使得位于Ⅱ A亚结构域中的色氨酸残基所处微环境的疏水性增大。 由于HSA在水溶液中以一种更加稳定的状态存在, 因此通过团聚保持自身结构稳定的程度减小。

蛋白质构象变化可能影响其生理功能, 因此对HSA的重要功能特性进行了检测。

2.3.1 类酯酶活性检测

HSA具有类酯酶活性, 可以水解pNPA并产生在400 nm处有最大吸收的对硝基苯酚^[15], 通过测定产物吸光度变化即可得到CQDs对HSA类酯酶活性的影响。 如图9(a)所示, 随着CQDs浓度增加HSA的类酯酶活性缓慢下降。 这一结果产生的原因可能是: CQDs的加入导致HSA折叠程度增大, 其结构中一些可水解pNPA的基团不再暴露于蛋白质表面, 因此HSA的类酯酶活性下降。

图9

Fig.9

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图9 HSA生理功能变化情况 (a): 随CQDs浓度增加HSA的相对酯酶活性; (b): CQDs对HSA自由基清除能力的影响Fig.9 Changes in HSA’ s physiological functions (a): Relative esterase activity of HSA with increasing concentration of CQDs; (b): Effect of CQDs on the free radical scavenging capability of HSA

2.3.2 自由基清除能力

HSA中处于游离状态的半胱氨酸(Cys34), 在自由基清除方面发挥着重要作用^{[12, 15]}。 Ellman试剂可以与游离巯基反应, 生成在412 nm有最大吸收的黄色络合物, 通过检测络合物吸光度变化就可以判断CQDs对HSA自由基清除能力的影响。 图9(b)显示了CQDs含量与产物吸光度之间的关系, 发现在高纳米颗粒浓度下吸光度稍有增强, 表示HSA的抗氧化能力可能有所提高。 这可能是由于高浓度CQDs导致HSA结构发生较大改变, 使得自由巯基与Ellman试剂之间接触机会增加所致。