第一批香蕉, 品种为广东1号, 总重量300 kg, 于2019年4月8日购于超市。 第二批香蕉, 品种为威廉斯, 总重量300 kg, 于2019年5月6日购于超市。 考虑到贮藏条件仅起到加快或延迟香蕉的品质变化过程, 因此为了减少试验时间, 两批香蕉均常温贮藏。 在香蕉贮藏过程中, 每天测量记录贮藏库的温湿度, 第一批香蕉在贮藏期间温度波动范围在20~24 ℃, 相对湿度波动范围在90%~93%; 第二批香蕉贮藏期间温度波动范围在20~25℃, 相对湿度波动范围在89%~94%。 两批香蕉贮藏过程中每天均采集三维荧光数据以及pH、 相对电导率数据。 同时, 为了保证腐败基准确定的可靠性, 试验数据不仅仅截止到感官上出现腐败为止(约为第6个贮藏日), 还应持续到完全腐败, 使试验数据能够覆盖贮藏过程中香蕉品质变化的全部, 为此贮藏试验均持续了8 d。

采用上海雷磁生产的PHS-3E型pH计与DDS-307型电导率仪, 广东环凯微生物科技有限公司生产的HKM-Ⅱ 型空气浮游微生物采样器, 上海卢湘仪离心仪器有限公司生产的TG16A台式高速离心机, 以及江苏强盛功能化学股份有限公司生产的分析纯氯化钠。

采用美国安捷伦Cary eclipse荧光光谱仪采集3维荧光光谱。 激发波长λ _ex范围设置为200~300 nm, 步长为5 nm, 共包含21个激发波长, 狭缝宽度为5 nm; 发射波长λ _em范围设置为260~800 nm, 步长为2 nm, 共包含271个发射波长, 狭缝宽度为5 nm, 扫描速度为fast, 电压为900 V, 激发光源为氙灯, 在2 mm× 2 mm的石英荧光比色皿中测量。

香蕉贮藏过程中能表征其腐败的指标很多, 鉴于pH值测量操作简便, 相对电导率又可以表征香蕉贮藏过程中细胞受损伤程度。 因此, 选取pH值以及相对电导率值作为理化表征指标。 pH值测定: 试验当天从贮藏库随机选取3根香蕉, 做3个平行样本。 将每根香蕉剥皮, 取中间段果肉10 g, 放入匀浆机, 加入蒸馏水90 mL, 每次匀浆时间60 s, 然后用4层纱布过滤以去除浮沫及滤渣。 用pH计依次测量每个样本的pH值。 每个样本测3次, 以消除仪器误差, 以这3个香蕉样本的pH平均值作为该贮藏日香蕉样品的pH值。

相对电导率测定: 试验当天从贮藏库随机选取3根香蕉, 做3个平行样本。 每根香蕉取约2.5 cm× 2 cm的香蕉皮10片, 放于锥形瓶中, 加入蒸馏水100 mL, 用保鲜膜封口, 置于常温摇床中震荡30 min后取出, 依次测量煮前电导率α ₁。 将测量好的样本重新盖上薄膜密封, 用电炉煮沸10 min, 冷却至室温, 测得煮后电导率α ₂。 相对电导率α 用式(1)计算。 两批香蕉样品pH和相对电导率数据结果如表1和表2所示。

α=α1α2×100(1)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 第一批香蕉pH值和相对电导率 Table 1 pH value and relative conductivity of the first batch of banana 贮藏天数/d pH值 相对电导率 1 5.03 14.83 2 5.13 15.77 3 5.29 14.61 4 5.35 19.72 5 5.50 24.74 6 5.54 28.53 7 5.69 30.10 8 5.68 30.49

表1 第一批香蕉pH值和相对电导率 Table 1 pH value and relative conductivity of the first batch of banana

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 第二批香蕉pH值和相对电导率 Table 2 pH value and relative conductivity of the second batch of banana 贮藏天数/d pH值 相对电导率 1 4.91 12.18 2 5.12 13.19 3 5.16 13.21 4 5.21 14.64 5 5.42 13.92 6 5.40 13.96 7 5.55 18.17 8 5.53 20.15

表2 第二批香蕉pH值和相对电导率 Table 2 pH value and relative conductivity of the second batch of banana

用超纯水配置0.9%的生理盐水, pH值为6.66。 将5 mL 0.9%的生理盐水均匀覆盖在玻璃培养皿中。 将采样器放置于贮藏库中央位置, 放入培养皿, 启动采样器。 采样量为1 000 L, 采样时间10 min。 采样结束后, 将样品收集到离心管中, 并用生理盐水定容至4 mL。 考虑到从空气中采集到的水溶性物质为微量级, 对样品进行离心浓缩处理。 离心机采用10 000 r· min^-1转速离心1 min, 弃去上清液2 mL。 将剩余2 mL样品混匀, 进行三维荧光检测。 荧光仪每次使用前预热30 min。

将采集到的三维荧光数据经过预处理及特征波长的选择之后, 利用系统聚类分析法(systematic cluster analysis, SCA)及主成分分析(principal component analysis, PCA)进行香蕉的腐败预警。 本文采用的主要方法及流程如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 处理方法流程图Fig.1 Processing method flowchart

1.5.1 基线漂移去除

由于样品在进行三维荧光检测时其数值会出现漂移现象, 也就是相对于坐标轴轴线荧光数据整体会出现上浮(正值)或者下移(负值)。 由于仪器本身设置的最大荧光强度量程为1 000 a.u., 且由于瑞利散射的强度较大, 容易出现满量程现象(两批香蕉试验所有检测样本的瑞利散射荧光强度均达到满量程), 则可根据瑞利散射的变化情况及满量程来确定漂移校正值。 具体为: 计算某检测样本荧光强度最大值(瑞利散射值)与1 000的差值(分正差值和负差值), 然后将该样本的荧光数据全部加上该差值, 使瑞利散射的荧光强度达到1 000, 从而达到去漂移的效果。 例如某个检测样本的瑞利散射荧光强度值范围为-10~990, 便对该样本的整体荧光数据值加上10, 以达到去漂移的效果。

1.5.2 散射去除及平滑处理

荧光漂移校正完成后, 用Matlab 2014a中eemscat工具箱对瑞利散射及拉曼散射进行去除处理^[8]。 为减少环境及仪器噪声对数据的影响, 对每个激发波长下的发射光谱再进行SG卷积平滑处理。

1.5.3 荧光波长初选

由于三维荧光光谱数据量较大且存在冗余信息, 因此需要对原始光谱数据进行特征波长的选择, 提取出最能够表达香蕉贮藏期间品质变化的特征波长, 以减少分析变量个数和冗余信息。 根据三维荧光数据连续性的特点^[9], 使用三阶高斯混合分布对每个激发波长下的发射光谱曲线拟合。 拟合效果越差, 表明该波长下的数据离散性、 波动性较大, 因此其不能代表被检测样本, 或者说与被检测样本不匹配。

1.6.1 特征激发波长选择

在多元统计分析中, Wilks Λ 统计量^[10]可以对不同样本中各变量的区分能力进行评估。 Λ 值越大, 表示变量间相似性越大; Λ 值越小表示变量间越有差异。 由于Wilks Λ 统计量要求输入变量之间无相关性, 因此对原始数据不同激发波长的主成分得分进行Λ 值计算。 再根据从小到大排序的Λ 值来挑选出最合适的特征激发波长。 Wilks Λ 值的计算表达式如式(2)所示。

Λ=|D||T|(2)

式(2)中, T为三维荧光数据矩阵分析过程中主成分得分矩阵的总离差, D为矩阵中每列数据的组内离差。 将检测样本在不同激发波长下的发射光谱数据划分为一组。 Λ 值越小, 说明对应的激发波长越能反应香蕉贮藏期间品质的变化。

实际上, 在特征激发波长的选择过程中可分为初选和再选两步, 由上述方法初选激发波长后按下面1.6.2给出的方法选择特征发射波长, 然后根据选出的发射波长再用Wilks Λ 统计量反选出更少更具有代表性的特征激发波长。

1.6.2 特征发射波段选择

考虑到荧光光谱数据的整体性, 特征波段更能体现样本信息, 因此根据选出的特征激发波长的全发射光谱, 使用间隔偏最小二乘法(interval partial least squares, iPLS)对其进行特征发射波段的选择。 该方法通过将全发射光谱分为若干等间隔的子区间, 在每个子区间上运用PLS分析, 在不同子区间由交叉验证得到的交叉验证均方根误差(root mean square error of cross validation, RMSECV)来衡量区间回归模型的精度。

1.7.1 腐败基准界定

香蕉在贮藏过程中, 随着贮藏过程的进行, 相邻两天或几天的相关距离越小, 相关性越强, 说明这两天的香蕉品质越相似; 相邻两天的相关距离越大, 相关性越差, 说明这两天香蕉的品质变化大, 因此根据不同贮藏时间的香蕉品质相似性来实现香蕉腐败基准的确定。 为了确定腐败基准, 先将每天试验样本自成一类, 然后根据基于欧氏距离的系统聚类^[11]将最接近的两类并成一个新类; 通过计算新类与其他各类间的相似性, 再选择最接近的两类合成新类, 直到所有的样本都并成一类。 最后, 根据聚类结果可判别腐败基准。

1.7.2 早期预警初探

主成分分析(PCA)^[12]是一种信息融合方法, 也是一种数据分析空间的变换方法。 对选出的特征波长进行PCA处理, 初步探索了利用PCA的第1主成分的变化来度量香蕉贮藏期间可能出现的腐败接近度, 以此实现早期预警。

2.1.1 散射去除及平滑结果

为去除瑞利及拉曼散射, 减少噪声影响, 对三维荧光光谱进行去瑞利及SG平滑处理, 图2给出了荧光数据预处理前后情况。 由两图对比发现, 图2(b)已经有效的消除了三维荧光光谱数据中瑞利散射及拉曼散射的不利影响, 同时图2(b)比图2(a)的荧光光谱等高线图区域边际线平滑, 说明已经减少了噪声等环境因素的影响, 有利于后续数据的分析。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 散射去除及平滑处理前后荧光光谱图 (a): 处理前; (b): 处理后Fig.2 Fluorescence spectrum before and after scatter removal and SG smoothing (a): Before processing; (b): After processing

2.1.2 荧光光谱初选结果

在进行数据分析时发现, 样品在发射波长600~800 nm的波段基本不产生荧光, 其荧光强度接近于0, 因此去除后100个发射波长(Em: 600~800 nm)。 同时对检测样本21个激发波长下的发射光谱进行三阶高斯混合分布拟合, 结果如表3、 图3所示。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 三阶高斯拟合结果 Table 3 Third-order Gaussian fitting result Ex/nm 高斯拟合R2 Ex/nm 高斯拟合R2 200 0.81 255 0.98 205 0.68 260 0.92 210 0.74 265 0.90 215 0.81 270 0.93 220 0.78 275 0.96 225 0.90 280 0.97 230 0.95 285 0.97 235 0.96 290 0.97 240 0.94 295 0.97 245 0.98 300 0.96 250 0.98

表3 三阶高斯拟合结果 Table 3 Third-order Gaussian fitting result

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 初步筛选前后的荧光激发波长下的发射光谱 (a): 初选前; (b): 初选后Fig.3 Emission spectrum at the fluorescence excitation wavelengths before and after preliminary filtering (a): Before preliminary filtering; (b): After preliminary filtering

由表3可以看出前5个激发波长的拟合效果不够理想, 表明其离散性较大, 数据不够稳定, 或许是这些激发波长本身不匹配要检测的对象, 因此去除前5个激发波长。 经过预处理后的荧光数据去除了杂乱信息的干扰和与检测样本不匹配的数据。 图3给出了预处理前后的荧光数据不同激发波长下的发射光谱图。

2.2.1 特征激发波长选取结果

对两批香蕉预处理后试验数据采取Wilks Λ 值进行特征激发波长选取, Λ 值排序后对应的激发波长如表4。 由表4可以看出, 综合两批次香蕉试验, 初步选取5个Λ 值较小且共有的特征激发波长为225, 230, 235, 240和 255 nm。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 两批香蕉试验Λ 值排序后的激发波长(Ex) Table 4 Excitation wavelengths sorted by Λ values of two batches of banana Λ 值由低 到高排序 第一批香蕉 试验Ex/nm 第二批香蕉 试验Ex/nm 1 225 230 2 240 235 3 255 240 4 230 250 5 235 225 6 260 285 7 280 255 8 270 245 9 250 260 10 300 290 11 285 275 12 290 280 13 295 300 14 245 270 15 265 265 16 275 295

表4 两批香蕉试验Λ 值排序后的激发波长(Ex) Table 4 Excitation wavelengths sorted by Λ values of two batches of banana

2.2.2 特征发射波段选取结果

将初选出的特征激发波长看作不同的变量, 结合每批次试验各自的pH值、 相对电导率值, 利用iPLS进行特征发射波段的选取。 发射光谱在260~600 nm间共包括171个波长点, 发射波长变量编号为1— 171, 采用试凑法, 将发射光谱划分为13个等间距的子区间, 交互值为12。 图4给出了两批香蕉试验发射光谱特征波段选取情况。 横坐标代表发射波长变量编号, 纵坐标代表不同子区间的交互验证均方根误差值(RMSECV)。

图4

Fig.4

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	图4 两批香蕉发射光谱特征发射波段 (a): 第一批香蕉; (b): 第二批香蕉Fig.4 Emission spectrum feature bands of the two batches of banana (a): The first batch; (b): The second batch

由图4(a)可以看出第一批香蕉试验的第2, 3, 4, 5和6个子区间的RMSECV值较低, 模型精度较高, 说明这几个子区间能够体现不同贮藏日期香蕉的品质变化。 由图4(b)可以看出第二批香蕉试验的第3个子区间的RMSECV值较低。 考虑到选出的特征波长要能够表征品种不同、 贮藏日期不同的香蕉品质变化, 因此选取两批香蕉试验共有的特征发射波段作为特征区间, 即第3个子区间: 316~342 nm, 包含14个发射波长。 因此共选出5个激发波长下各14个发射波长, 共70个特征波长。

为进一步减少分析变量个数, 根据筛选出的14个特征发射波长, 使用Wilks Λ 统计量对荧光数据预处理筛选出的16个激发波长再选, 结果如表5所示。 由表5可以看出, 最后共选出了3个Λ 值较小的特征激发波长: 225, 230和235 nm。 因此对应此3个特征激发波长下各选14个特征发射波长, 共42个特征波长。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 两批香蕉试验Wilks再选Λ 值排序后的激发波长(Ex) Table 5 Excitation wavelengths sorted by Λ values of reselected Wilks of two batches of banana Λ 值由低 到高排序 第一批香蕉 试验Ex/nm 第二批香蕉 试验Ex/nm 1 225 225 2 235 235 3 240 230 4 230 250 5 260 245 6 245 275 7 280 255 8 265 260 9 300 265 10 275 270 11 250 285 12 285 295 13 290 290 14 270 300 15 255 280 16 295 240

表5 两批香蕉试验Wilks再选Λ 值排序后的激发波长(Ex) Table 5 Excitation wavelengths sorted by Λ values of reselected Wilks of two batches of banana

2.3.1 腐败基准确定

对选出的42个特征波长的光谱数据进行系统聚类分析, 根据类与类之间的相似性来对两批香蕉进行贮藏期间的腐败基准确定。 图5给出了两批香蕉试验聚类分析的结果。

图5

Fig.5

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	图5 两批香蕉聚类分析结果 (a): 第一批香蕉; (b): 第二批香蕉Fig.5 Cluster analysis results of the two batches of banana (a): The first batch; (b): The second batch

由图5可以看出, 两批香蕉虽然品种不同, 但系统聚类分析可以实现对其贮藏进程中的品质分类, 从而确定腐败基准。 由图5(a)可以看出, 根据选出的特征波长信息, 第一批香蕉在贮藏的第1, 2, 3, 4天信息相似性高, 因此将其归为一类, 说明前4天香蕉的品质相近, 而第5天没有与前4天归成一类, 说明香蕉在第5天品质发生变化。 因此第一批贮藏试验选用第5天的贮藏库气体荧光信息来表征香蕉腐败基准信息。 由图5(b)可以看出, 由于香蕉品种的不同, 第二批贮藏试验的类间距离与第一批有差异, 但使用系统聚类分析还是可以实现对贮藏期间香蕉的品质分类, 从而确定香蕉的腐败基准信息。 同理, 选用第5天的贮藏库气体荧光信息作为第二批贮藏试验的香蕉腐败基准信息。

2.3.2 预警实现

对选出的特征波长的光谱数据进行PCA处理, 结果如图6所示。

图6

Fig.6

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	图6 两批香蕉PCA结果 (a): 第一批香蕉; (b): 第二批香蕉Fig.6 PCA results of the two batches of banana (a): The first batch; (b): The second batch

由图6给出了两批香蕉特征波长PCA处理的第1主成分与第2主成分结果, 通过两批次贮藏试验数据对比可以看出两批香蕉虽然品种不同, 但是存在相同的腐败阈值。 由图6(a)和(b)可以看出腐败前4天与腐败后2天可以从第1主成分明显分开, 因此可以初步确定第1主成分的值在0作为香蕉腐败的阈值, 达到该值即意味着香蕉出现腐败。 由此可以推断即便是不同品种、 不同成熟度的香蕉在贮藏进程中都会达到该腐败阈值, 从而确定贮藏库内香蕉的腐败情况, 实现对香蕉的腐败预警。