试验地点在中国农业大学曲周长期定位实验站(36° 52'N, 115° 01'E)内, 实验站于2002年3月建立, 位于河北省邯郸市曲周县北部, 属温带半湿润季风气候区, 年均降雨量604 mm。 试验在进行蔬菜生产的日光温室中开展, 日光温室采用拱圆式的钢架结构, 长52 m, 宽7 m, 占地面积约0. 04 hm²。 温室土壤为盐化潮褐土, 砂粒含量54.11%, 粉粒含量28.45%, 粘粒含量17.44%。 试验前土壤有机质16.94 g· kg^-1, 全氮1.24 g· kg^-1, 全磷1.61 g· kg^-1, pH为7.68。

试验设计3个处理, 共3个温室大棚, 每个大棚内包括3次重复。 2018年温室内采用番茄-芹菜轮作。 试验处理如下: (1)F1: 化肥为主(70%), 少量施用有机肥(30%), (2)F2: 50%化肥+50%有机肥, (3)F3: 100%有机肥。 施肥量为(1)F1, 7 t· hm^-1· year^-1化学肥料, 26.7 t· hm^-1· year^-1的生物有机肥, (2)F2: 3.8 t· hm^-1· year^-1化学肥料, 52.3 t· hm^-1· year^-1的生物有机肥, (3)F3: 105 t· hm^-1· year^-1生物有机肥。 供试肥料: 试验用化肥为尿素(N 46%)、 普通过磷酸钙(P₂O₅ 12%), 氯化钾(K₂O 50%)。 生物有机肥为自制(N 1.21%, P₂O₅ 0.6%, K₂O 1.58%), 其主要原料为牛粪、 鸡粪、 棉仔饼、 农作物秸秆等农业废弃物, 经微生物发酵、 充分腐熟处理, 加工而成。

试验地于2018年5月在大棚内进行土壤样品采集, 取样深度为0~20 cm。 取样时按S 型路线进行取样, 每7个点为一个混合样。 土样取回后, 经风干、 研磨和过筛后进行测定。

1.3.1 腐殖质组分提取及纯化

将土壤样品腐殖质组分进行提取并测定其含量。 土壤腐殖质组分的提取方法遵循国际腐殖酸协会(IHSS)的标准方法。 取0.25 mm过筛的风干土样, 将0.1 mol· L^-1 NaOH和0.1 mol· L^-1 Na₂P₂O₇混合液(pH=13)按照水土比10∶ 1震荡、 提取24 h后, 3 000~4 000转离心15~20 min, 上清液为腐殖酸溶液。 收集的上清液使用0.5 mol· L^-1 H₂SO₄调节pH为1.0~1.5, 静置过夜, 然后离心进行固液分离, 溶液即为FA, 沉淀为胡敏酸。 然后将得到的粗胡敏酸和富里酸分别进行纯化并进行红外光谱测定。 将沉淀的HA置于透析袋内透析一周进行HA的纯化, 以除去可溶性矿物盐; FA溶液则需要倒入树脂柱, 将溶液通过树脂柱并收集滤液, 此滤液为纯化后的FA。 最后, 将纯化后的HA和FA进行冷冻干燥。 然后利用重铬酸钾氧化法测定HA和FA含量。

1.3.2 元素分析

采用 Vario EL Ⅲ (Hanau, Germany)元素分析仪测定样品中的C, H和N的含量, O含量通过差减法得到。

1.3.3 红外光谱测定

将冷冻干燥的土壤腐殖质样品进行红外光谱测定。 样品粉碎研细至0.2 μ m, 然后将微量纯样品放在金刚石上压平后测试。 所用仪器型号为: Nicolet 750 显微红外仪。 测试范围为4 000~500 cm^-1, 检测器MCT/A, 分束器KBr, 扫描次数128次, 分辨率设为8 cm^-1。

1.3.4 核磁共振

采用Bruker AV 300型核磁共振仪测定, 运用交叉极化魔角自旋(CP-MAS)技术获得了固体样品的¹³C核磁共振(¹³C-NMR)谱。 ¹³C的共振频率为75.4 MHz, 魔角自旋的频率为12 kHz, 接触时间为3 ms, 循环延迟时间为5 s。 积分面积由机器自动给出, 各类型碳的相对含量用某化学位移区间面积比占总面积的比值表示。

1.3.5 数据统计分析

采用SPSS 20.统计分析软件对土壤腐殖质碳组分含量进行方差分析。 将红外光谱和核磁共振数据利用Origin 8.0软件进行绘图。 红外光谱数据统一采用Origin 8.0软件进行归一化处理。

图1所示, HA和FA含量均在F3处理内最高, 分别为11.01和10.51 g· kg^-1。 与F1相比, F3使HA提高了106.01%, FA提高了180.22%, F2则分别提高了53.55% 和44.70%(图1)。 我们的研究结果表明单施有机肥对于提升腐殖质组分含量优于化肥和有机肥混施。 有研究表明有机肥对于提高土壤腐殖质组分含量的效果毋庸置疑^[6]。 本研究结果与之相同, 有机肥显著提高了土腐殖质组分含量, 其中高量有机肥的效果最好。 也有研究者认为有机肥与化肥配施对于提高土壤腐殖酸含量优于单施有机肥(见本刊39卷第三期845页), 这可能与有机肥的数量密切相关。

图1

Fig.1

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	图1 不同比例有机无机肥配施土壤HA和FA的含量Fig.1 HA and FA contents of soil under different ratios of organic and inorganic fertilizers

土壤胡敏酸(HA)和富里酸(FA)元素组成中C和O的占比最大, 其次是H和N, HA中的C含量最高, FA中则O含量最高, 并且HA中C、 H和N的含量远高于FA, 说明HA的缩合度较高、 分子结构较复杂。 不同配比的有机无机肥对HA和FA各元素含量及原子比影响不同。 F3处理的HA中的C、 H和N的含量最高, O含量最低, H/C, O/C和(N+O)/C的比值最低, 说明单施有机肥HA中的芳香类物质最多, 脂肪烃类物质和羧酸类物质最低。 F1处理中C的含量最低, O的含量最高, H/C, O/C和(N+O)/C的比值最高, 说明低量有机肥与化肥配施脂肪烃类和羧酸类物质最多(表1)。 与F1相比, F2和F3降低了H/C, O/C和(N+O)/C的比值, 说明有机肥的施用提高了HA的缩合度, 降低了其氧化度和极性。 C/N的比值在F2和F3中同样表现增加的趋势, 并在F2中的值最大, 说明有机肥能够促进HA中含氮化合物的形成, 而有机无机肥配施的效果最好。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 HA和FA各种元素含量和原子比 Table 1 Elemental concentration and atom ratio of humic acids and fulvic acid 施肥处理 元素含量/% 摩尔比 C H N O H/C O/C C/N (N+O)/C F3 51.61 5.53 5.31 37.55 1.29 0.55 11.34 0.63 HA F2 49.20 5.29 5.01 40.50 1.29 0.62 11.46 0.70 F1 48.49 5.34 5.03 41.14 1.32 0.64 11.25 0.73 F3 12.03 3.04 1.03 83.90 3.03 5.23 13.63 5.30 FA F2 13.58 3.07 1.15 82.20 2.71 4.54 13.78 4.61 F1 10.80 3.09 0.95 85.16 3.43 5.91 13.26 5.99

表1 HA和FA各种元素含量和原子比 Table 1 Elemental concentration and atom ratio of humic acids and fulvic acid

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同比例有机无机肥配施土壤HA和FA红外光谱主要吸收峰的吸光度比值 Table 2 Ratio between main absorbance peaks of IR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers 处理 HA FA 3 330 2 930 1 630 1 030 2 930 1 710 1 030 960 F1 0.53 0.41 1.00 0.84 0.17 0.16 0.60 1.00 F2 0.54 0.38 1.00 0.91 0.19 0.20 0.95 1.00 F3 0.56 0.42 1.00 0.91 0.21 0.21 0.74 1.00

表2 不同比例有机无机肥配施土壤HA和FA红外光谱主要吸收峰的吸光度比值 Table 2 Ratio between main absorbance peaks of IR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

三种处理中, F2和F3处理提高了FA中C和N的含量, 降低了H和O的含量, 使FA的H/C, O/C和(N+O)/C的比值下降, 而C/N的比值增加, 表明了有机肥的施用同样提高了FA的缩合度而降低了氧化度和极性, 促进了含氮化合物的形成, 并且在F2处理中尤为明显(表1)。 研究结果表明, 有机无机肥混施对于FA结构的影响更加明显。 综上所述, 虽然有机肥的施用提高了HA和FA的缩合度, 降低了氧化度和极性, 然而不同比例有机无机肥配施对HA和FA的元素含量影响并不相同。

如图2所示, 各处理土壤提取的HA具有相似的红外图谱, 但主要吸收峰的吸收强度在不同处理间有明显差异, 说明不同施肥处理对HA结构和官能团数量影响显著。 3 330 cm^-1代表酚、 乙醇和有机酸中的羟基振动吸收, 说明形成了以H键相连的多聚体, 此信号强度在F1中最小, F3中最大, 说明有机肥提高了HA中脂肪族化合物含量, 并且施用量越大含量越高。 2 930 cm^-1是脂肪族C— H伸缩振动, F2处理脂肪烃含量最低, 说明有机无机肥混施降低了HA中的脂肪烃含量。 1 630 cm^-1 代表芳香C=O伸展, 三种施肥处理土壤胡敏酸均在1 630 cm^-1出现了羰基化合物的尖锐且强度最大的C=O伸缩振动峰。 1 030 cm^-1代表碳水化合物或多糖结构中的C— O伸展以及硅酸盐Si— O伸缩振。 F1处理1 030 cm^-1吸收强度均低于F2和F3, 说明有机肥增加了HA中碳水化合物和多糖类物质的含量。

图2

Fig.2

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	图2 不同比例有机无机肥混施土壤HA的红外光谱Fig.2 IR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

与HA红外光谱图相比较, FA红外光谱的吸收峰相对较少。 如图3所示, 在2 930 cm^-1(脂肪族C— H伸缩振动)、 1 710 cm^-1(羧基中的C=O伸展)、 1 030 cm^-1(糖或脂族C— O伸缩振动)处有明显吸收峰, 表明FA和HA具有相似的骨架结构和官能团组成, 但是主要吸收峰的位置及官能团数量不同。 F2和F3处理的2 930和1 710 cm^-1吸收峰强度均高于F1处理, 说明有机肥的施用增加了FA的羧基基团和脂肪基团。 这表明友机肥的施用不仅提高了土壤FA的含量, 还通过增加其结构中羧基基团和脂肪基团的方式提高了FA的稳定性, 有研究表明, 长期施用化学肥料降低了FA腐殖化程度, 其结构趋于简单化, 而有机肥与化肥混施显著增加了FA的芳构化程度, 结构趋于复杂化。 1 030 cm^-1受施肥方式影响显著, F2和F3在该处的吸收峰强度明显高于F1, 特别是F2处理增加的效果尤为显著, 说明高量有机与无机肥混施对于FA中的碳水化合物, 多糖类和醇类物质增加更为明显。

图3

Fig.3

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	图3 不同比例有机无机肥混施土壤FA的红外光谱Fig.3 IR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

一般将腐殖质的CPMAS ¹³C-NMR波谱分为5个主要的共振区, 分别是烷基C区(δ 0~50)、 烷氧C区(δ 50~110)、 芳香C区(δ 110~165)、 羧基C区(δ 165~190)和羰基C区(δ 190~230)^[7]。 图4为HA的固态CPMAS ¹³C-NMR波谱, 不同施肥处理的HA在30 ppm处吸收峰明显并且在不同处理间的差异较大, 30 ppm则代表长链烷烃或环烷烃结构中的亚甲基C。 HA的烷氧C的峰主要在55 ppm处, 归属为甲氧基C和碳水化合物C的吸收。 芳香C区中, 130 ppm主要是被羧基和羧甲基取代的芳香C; 150 ppm代表的是酚羟基C。 羰基C区中, 170 ppm的峰代表的是羧基C。 羰基C中, 220 ppm处较弱的吸收峰代表的主要是醛基和酮基^[8]。 三种处理相对比, F2和F3处理提高了HA中烷基C和烷氧基C的含量, 降低了芳香C、 羧基C和羰基C的含量, 从而提高了HA的脂化度而降低了芳化度, 特别是在F2处理中烷氧C的含量达到了最高, 而芳香C的含量最低(表3)。 与F1相比, F3使脂化度提高了3.21%, 芳化度降低了6.42%, F2则分别为14.26%和28.54%, 说明F2和F3都能提高HA的脂化度, 降低其芳化度, 但F2处理对于HA官能团的影响更加显著。

图4

Fig.4

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	图4 不同比例有机无机肥配施土壤HA的CPMAS 13C-NMR波谱Fig.4 CPMAS 13C-NMR spectra of HA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同比例有机无机肥配施HA和FA 的CPMAS 13C-NMR图的各官能团面积相对比例 Table 3 Intensity distribution in the CPMAS 13C-NMR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers 处理 烷基C δ 0~50 烷氧C δ 50~110 芳香C δ 110~165 羧基C δ 165~190 羰基C δ 190~230 Aliphaticity Aromaticity F3 31.45 24.37 25.29 14.55 4.34 68.82 31.18 HA F2 30.90 35.9 20.87 7.64 4.69 76.19 23.81 F1 29.85 22.65 26.23 16.03 5.24 66.68 33.32 F3 37.05 22.38 21.59 13.27 5.71 73.35 26.65 FA F2 29.45 28.59 21.36 13.36 4.24 73.10 26.90 F1 36.19 21.08 23.06 12.58 7.10 71.29 28.71 Aliphaticity=C%(δ 0~110)/C%(δ 0~165); Aromaticity=C%(δ 110~165)/C%(δ 0~165)

表3 不同比例有机无机肥配施HA和FA 的CPMAS 13C-NMR图的各官能团面积相对比例 Table 3 Intensity distribution in the CPMAS 13C-NMR spectra of HA and FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

FA与HA核磁共振图谱分区相同, 可划分为5个主要共振区(图5)。 在烷基C区中, 20~30 ppm处吸收峰代表了支链和短链烷基C^[9]。 烷氧C区中, 71 ppm为碳水化合物C的吸收峰。 126 ppm(芳香C区)附近主要是被羧基或羧甲基取代的芳香C的吸收峰, 176 ppm(羧基C区)代表的是羧酸、 酯和酰胺C的吸收峰。 羧基C区中, 225 ppm较弱的吸收峰主要是酮, 醌或乙醛。 如表3所示, 相较于F1处理, F3处理提高了FA的烷基C、 烷氧C和羧基C的含量, 降低了芳香C和羰基C的含量, F2处理则增加了烷氧C和羧基C的含量, 而降低了烷基C、 芳香C和羰基C的含量。 在三种处理中, F3和F2处理都提高了FA的脂化度而降低了其芳化度。

图5

Fig.5

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	图5 不同比例有机无机肥配施土壤FA的CPMAS 13C-NMR波谱Fig.5 CPMAS 13C-NMR spectra of FA under different ratios of organic and inorganic fertilizers

在F2和F3处理中, 脂化度分别提高了2.89%和2.54%, 芳化度则分别降低了7.18%和6.30%, 说明F3处理对于提高FA的脂化度, 降低其芳化度的效果更优。 综上所述, 有机肥的施用能够提高HA和FA的脂化度降低其芳化度, 但是不同施用量有机肥土壤HA和FA的形成机制不同。