引用本文
郑名, 曹思敏, 刘阳依, 曹潇丹, 陈壮, 闫姝君, 李昊阳, 陈缙泉, 徐建华. 基于胆红素荧光增强效应的锌离子探针特性研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2020,40(3): 813-816.
ZHENG Ming, CAO Si-min, LIU Yang-yi, CAO Xiao-dan, CHEN Zhuang, YAN Shu-jun, LI Hao-yang, CHEN Jin-quan, XU Jian-hua. Study on Characteristics of Zinc Ion Probe Based on Fluorescence Enhancement of Bilirubin[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2020,40(3): 813-816.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2020)03-0813-04  
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基于胆红素荧光增强效应的锌离子探针特性研究
郑名, 曹思敏, 刘阳依, 曹潇丹, 陈壮, 闫姝君, 李昊阳, 陈缙泉, 徐建华*
华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室, 上海 200062
*通讯联系人 e-mail: jhxu@phy.ecnu.edu.cn

作者简介: 郑 名, 1995年生, 华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室硕士研究生 e-mail: 864345429@qq.com

收稿日期: 2019-02-20
基金: 国家自然科学基金委面上项目基金(11674101, 21873030)资助
摘要

锌离子Zn2+对胆红素BR有着显著的荧光增强效应, 基于该荧光特性, 利用紫外可见光吸收和稳态荧光光谱技术提出了一种BR作为荧光探针用于Zn2+浓度检测的新方法, 特别是首次采用在波长663和600 nm处的稳态荧光强度比值方法系统地研究了其与锌离子浓度在0~90 μmol·L-1范围内变化的关系, 与常用的单波长荧光强度探测方法比较, 有效地避免了探针浓度变化及激发光强度变化等非目标因素的影响。 实验研究结果发现BR荧光探针对Zn2+的识别行为在0~20 μmol·L-1范围内, 探针BR 的荧光强度比值 I663 nm/ I600 nm与 Zn2+的浓度之间具备线性增长关系, 尤其是0~10 μmol·L-1有非常好的线性关系, 线性相关系数 r=0.999 87, 同时Zn2+检测限为0.1 μmol·L-1 。 在20~90 μmol·L-1范围内, 荧光强度比值 I663 nm/ I600 nm趋于饱和。 研究发现对实时检测人体内的Zn2+具有很好的应用前景。

关键词: 胆红素; 锌离子探针; 荧光光谱技术
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Study on Characteristics of Zinc Ion Probe Based on Fluorescence Enhancement of Bilirubin
ZHENG Ming, CAO Si-min, LIU Yang-yi, CAO Xiao-dan, CHEN Zhuang, YAN Shu-jun, LI Hao-yang, CHEN Jin-quan, XU Jian-hua*
State Key Laboratory of Precision Spectroscopy, East China Normal University, Shanghai 200062, China
*Corresponding author
Abstract

Based on the fluorescence enhancement effect of Zn2+ on bilirubin (BR), this work proposes a new method for the detection of Zn2+ concentration, and a systematically investigation of BR as a Zn2+ probe by using ultraviolet-visible light absorption and steady-state fluorescence spectroscopy has been conducted. Compared with the general single-wavelength fluorescence intensity method, this new detection method eliminates the impacts of the non-target effects of factors such as concentration variation of BR and the excitation light intensity, etc., and achieves a more accurate measurement capability in Zn2+ detection. Especially, for the first time we adopt the BR fluorescence intensities ratio at the emission wavelengths 663 and 600 nm, and investigate the dependence between this ratio and the Zn2+ concentration in the range from 0 to 90 μmol·L-1. The recognition behavior of BR probe to Zn2+ indicates that the BR fluorescence intensity ratio I663 nm/ I600 nm increases linearly with the Zn2+ concentration in the range of 0~20 μmol·L-1. In particular, in the range 0~10 μmol·L-1 of Zn2+ concentration, the linear correlation coefficient r is 0.999 87, which demonstrates the linear dependence, and the detection limit is 0.1 μmol·L-1. In the Zn2+ concentration range from 20 to 90 μmol·L-1, the probe BR fluorescence intensity ratio is saturated. Accordingly, there is a positive prospect of BR fluorescence in the real-time human body Zn2+ detection.

Keyword: Bilirubin; Zinc probe; Fluorescence spectroscopy
引 言

胆红素(Bilirubin, BR)是一种黄色的线性四吡咯, 是动物胆汁的主要色素[1], 可以直接从动物胆汁中提取。 研究表明, BR能与金属离子形成络合物, 且其络合物的光谱性质与BR本身存在显著的差异。 金属离子对BR荧光性质的影响可以分为三种不同的情况: 大多数金属离子, 如Li+, Ba2+, Mn2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Pb2+, La3+, Ce3+和Zr4+等, 对BR的荧光性质无明显影响; 一些金属离子, 如Cu2+和Hg2+, 对BR有着显著的荧光淬灭作用; 而锌离子Zn2+和Cd2+则对BR有着显著的荧光增强作用[2], 并且BR对Zn2+有着较好的选择性。

Zn2+在生命及生产活动中具有重要作用[3, 4], 因此对Zn2+的检测目前已成为最受关注的研究之一。 快速、 高效、 准确地检测存在于人体和生活环境中的Zn2+, 对保障人类健康, 以及医学和植物学应用上具有重要的应用价值。 由于Zn2+具有稳定的3d10电子构型[5], 传统地检测方法例如: 原子吸收光谱法(AAS)[6]、 滴定法[7]、 电化学法[8]等并不适用于高效检测Zn2+。 随着科学技术的发展, 利用分子荧光探针技术检测Zn2+已经获得大量成果。 这些探针分子主要包括喹啉衍生物[9]、 荧光素[10]、 香豆素衍生物[11]等, 它们具有高选择性和高灵敏度等优点[12], 但是, 这些探针的分子量一般较大, 且合成步骤多。 BR作为荧光分子探针无需繁杂的合成步骤, 本文在Zn2+对BR的荧光增强效应的基础上, 通过分析Zn2+与BR混合后的紫外-可见光吸收和稳态荧光光谱特征, 结合双波长荧光比值法, 构建了BR作为Zn2+荧光探针的检测方法。 其中, 作者首次采用BR在波长663和600 nm处稳态荧光强度比值的方法系统地研究了BR与锌离子浓度在0~90 μ mol· L-1范围内变化的关系。 该方法与常用的单波长荧光强度探测方法比较, 有效地避免了探针BR浓度变化及激发光强度变化等非目标因素的影响, 能够实现更准确地对Zn2+进行检测。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

稳态吸收光谱数据的采集是使用紫外可见分光光度计(TU1901, 北京普析通用仪器有限责任公司)。 仪器可在190~900 nm波长范围内进行探测, 波长准确度± 0.3 nm。

稳态荧光光谱采用的是Horiba公司生产的FluoroMax-4型荧光光谱仪。 因为不同的波长光源的发射功率不一样, 且探测器在不同波长下的探测效率也不一样, 所以我们在检测样品的稳态荧光光谱时选用S1c/R1c。

本研究所使用的所有化学试剂, 均来源于商业购买, 且未经过任何的提纯处理。 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO), 光谱级, > 99.9% GC, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; BR, B4126-1G, ≥ 98%(EmM/453=60), powder, 西格玛奥德里奇中国; 无水乙酸锌, 99.5%, 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

用BR粉末和无水乙酸锌粉末分别配制2 mmol· L-1的BR储备液与2 mmol· L-1的Zn2+储备液, 溶剂均为DMSO。 准确量取BR溶液于不同的离心管中, 分别在每一个不同的离心管中依次滴加梯度浓度的Zn2+溶液, 混合均匀后, 使得探针BR在离心管中的最终浓度为10 μ mol· L-1, Zn2+与探针BR的摩尔比为1~9倍。

将每个离心管中的混合样品分别移取至各个石英比色皿中, 使用紫外可见分光光度计, 以空气为参比, 进行稳态吸收光谱数据的采集; 采用稳态荧光光谱仪, 分别测量样品的稳态荧光光谱, 激发波长为355 nm, 狭缝宽度设为3 nm/ 3nm。

2 结果与讨论
2.1 Zn2+对BR的紫外-可见吸收光谱特性的影响

室温下, BR(10 μ mol· L-1)在DMSO溶液中随着Zn2+浓度增加的紫外-可见吸收变化曲线如图1所示。 实验数据表明, 探针BR在455 nm处有一个吸收峰, 随着Zn2+浓度的升高, 在455 nm处的吸收峰强度逐渐减弱, 而在525 nm出现新的吸收峰, 并且其强度逐渐增强, 证实探针BR与Zn2+不断结合, 形成了新的金属配合物[13]。 在355和475 nm处明显的等吸收点也充分证明了探针BR与Zn2+已经形成稳定的配合物。

图1 BR(10 μ mol· L-1)随Zn2+(0~90 μ mol· L-1)浓度增加的紫外-可见吸收光谱变化图Fig.1 UV-Visible absorbance spectra of BR (10 μ mol· L-1) in the presence of an increasing Zn2+ concentration (0~90 μ mol· L-1)

2.2 Zn2+对BR的稳态荧光光谱特性的影响

室温下, 将BR的浓度控制为10 μ mol· L-1, 向其中逐渐加入Zn2+, 从BR的荧光发射光谱图(图2)中可以看出, 当激发波长为355 nm时, 探针BR本身在525 nm处的荧光强度较弱。 随着Zn2+浓度的逐渐增加(0~90 μ mol· L-1), 525 nm处荧光强度逐渐减弱。 在663 nm处产生新的发射峰, 发射峰值波长红移了138 nm, 并且其强度随着Zn2+的加入逐渐增强。 探针BR荧光增强的可能原因是在光诱导下, 探针BR与Zn2+之间发生了电荷转移作用[14]。

图2 BR(10 μ mol· L-1)随Zn2+(0~90 μ mol· L-1)浓度增加的荧光发射光谱变化图Fig.2 Fluorescence spectra of BR (10 μ mol· L-1) in the presence of an increasing Zn2+ concentration (0~90 μ mol· L-1)

图2是探针BR的稳态荧光强度随着锌离子浓度的变化关系, 实验发现探针BR与Zn2+的混合物在600 nm处没有吸收, 如图1所示, 而且在600 nm处的荧光基底强度随着加入的锌离子浓度增加只是有微小的变化。 因此, 我们使用比率型荧光探测方法, 选择探针BR在发射波长663和600 nm处稳态荧光强度比值I663 nm/I600 nm, 其随Zn2+浓度变化曲线图如图3所示。 从图中可以看出, 在0~20 μ mol· L-1范围内, I663 nm/I600 nm值随Zn2+浓度变化逐渐增大, 其线性相关系数为r=0.940 87。 进一步增加Zn2+浓度, 其荧光强度比值趋于饱和不再有明显变化, 表明此时溶液中探针BR与Zn2+的结合达到了平衡状态。 另外, Zn2+的加入可以使探针BR的溶液颜色由黄色变为粉红色, 用肉眼即可直接观察识别过程, 这种明显的颜色和荧光强度的变化, 表明BR对Zn2+有良好的识别作用, 可以实现对Zn2+的可视化检测。

图3 BR(10 μ mol· L-1)在663和600 nm处荧光强度比随Zn2+(0~90 μ mol· L-1)浓度变化图Fig.3 Ratio (663 nm/600 nm)in the fluorescence intensities of BR (10 μ mol· L-1) at 663 and 600 nm in the presence of an increasing Zn2+ concentration (0~90 μ mol· L-1)

2.3 探针BR对Zn2+的检测限

如图4和图5所示, Zn2+在0~10 μ mol· L-1浓度范围内, 探针BR在发射波长663和600 nm处发射荧光强度比值I663 nm/I600 nm与Zn2+的浓度之间存在非常好的线性相关。 图5中的线性回归方程y=0.829 23x+0.573 79, 相关系数r=0.999 87, 以10次空白样品的发射荧光强度比值I663 nm/I600 nm作为标准差, 以3倍标准差计算[15]得到探针BR对Zn2+的检测限为0.1 μ mol· L-1。 这表明BR可以用来定量检测Zn2+浓度。

图4 BR(10 μ mol· L-1)荧光曲线对Zn2+浓度的响应关系图Fig.4 Fluorescence spectra of BR (10 μ mol· L-1) vs Zn2+ concentration

图5 BR在663和600 nm处的荧光强度与Zn2+浓度线性拟合图Fig.5 Linear fit curve of ratio of BR (10 μ mol· L-1) fluorescence intensities at 663 and 600 nm with respect to Zn2+ concentration

3 结 论

我们发现在探针BR的DMSO溶液中加入Zn2+后荧光强度显著增强, 最大荧光发射波长红移了138 nm, 从525 nm移动到663 nm。 探针BR对Zn2+的检测范围0~10 μ mol· L-1, 检测限达到0.1 μ mol· L-1, 探针BR用双波长荧光比值法可以被用来检测环境中的Zn2+浓度, 即已知BR浓度便可测定出Zn2+浓度。 同时, 探针BR是动物体中的一种胆汁色素, 没有复杂的合成步骤, 且其与Zn2+结合后的荧光发射峰位于生物组织的透明窗口[16], 因此其对生物活体成像也具有潜在的应用前景。

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