F-4600荧光分光光度计(日本日立); JEM-2010高分辨透射电子显微镜(日本); U-3010型紫外可见分光光度计(日本日立); DX-2700型X射线衍射仪(辽宁); WQF-510A傅里叶变换红外光谱仪(北京); 2.5-10型箱式电阻炉(上海)。

紫叶草(使用前, 先用超纯水洗净, 在35 ℃烘箱中烘干, 备用); 10^-3 mol· L^-1 EB(使用时稀释至所需浓度); 培氟沙星(PEFL): 准确称取0.019 5 g PEFL, 用1.0 mL的1.0 mol· L^-1的HCl溶液溶解, 定容至100 mL容量瓶中作储备液; PBS缓冲液: 配制0.10 mol· L^-1的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液, 用pH计调至所需pH值。 除培氟沙星为标准品外, 实验所用试剂均为分析纯, 实验用水均为超纯(UP)水。

1.2.1 碳点的制备

将烘干后的紫叶草破碎, 于箱式电阻炉中300 ℃灼烧2 h, 冷却至室温, 研成粉末。 准确称取0.100 0 g上述粉末, 用12.0 mL超纯水溶解于烧杯中, 超声分散1 h, 用0.22 μ m的滤膜抽滤, 滤液透析10 h得碳点溶液。 保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 PEFL的检测

在10 mL比色管中加入一定量的CDs, EB, PEFL和pH 3.0的PBS缓冲液, 超纯水稀释至刻度, 摇匀, 并在室温下反应10 min。 以340 nm为激发波长, 测定436 nm处的荧光强度F值。 仪器的激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

2.1.1 透射电镜(TEM)分析

图1(a)为CDs的TEM图。 在图中可以观察到CDs的形貌是球形的, 高分辨TEM图中CDs没有明显的晶格条纹[图1(a)中内插图], 说明所制备的CDs为无定形态。 CDs的尺寸分布如图1(b)所示, 平均粒径为2.4 nm。

图1

Fig.1

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	图1 CDs的TEM图像(a)和相应粒径的直方分布图(b)Fig.1 The TEM image of CDs (a) and the corresponding particle size distribution histogram (b)

2.1.2 X射线衍射分析

图2(a)为CDs的X射线衍射谱图(XRD)。 在图中接近ca.21° (2θ )左右, 有一个宽的且强度低的单峰, 进一步表明所制得的CDs为无定型态, 这和TEM的结果相符合。

图2

Fig.2

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	图2 CDs的X射线衍射谱图(a)和CDs的红外光谱(b)Fig.2 XRD (a) and IR (b) of CDs

2.1.3 红外光谱分析

图2(b)为CDs的红外光谱图。 在3 490 cm^-1左右有一个宽的吸收峰, 为— OH/— NH的伸缩振动特征峰。 在1 600 cm^-1左右的吸收峰为— C═O的伸缩振动峰, 该结果表明, 所制得的CDs表面含有— OH和— COOH/— NH基团, 说明CDs在水中具有良好的分散性能。

2.1.4 量子产率

采用参比法来测定CDs的荧光量子产率, 选用硫酸奎宁作为标准物, 其量子产率为0.54, 分别测定了CDs和硫酸奎宁的荧光光谱和吸光度。 CDs的量子产率的计算公式如下

YCDs=YR(dI/dA)CDs(dI/dA)RnCDs2nR2

式中, Y_CDs, Y_R分别是CDs和硫酸奎宁的荧光量子产率, I是荧光光谱积分面积, A是吸光度, n是溶剂的折射率, R表示的是硫酸奎宁的标准值^{[28, 29]}。 相关数值代入上述公式计算得Y_CDs为3.7%。

2.1.5 相关参数

对CDs的荧光光谱和EB的吸收光谱进行了分析, 并计算了相关参数。 根据能量转移Fö rster理论, 相关参数的计算公式如下^{[30, 31]}

J=∫0∞F(λ)ε(λ)λ4dλ∫0∞F(λ)dλE=1-FF0=R06R06+r6R06=8.8×10-25k2N-4JYCDs

式中, J指供体的荧光光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分, F(λ )是荧光供体在λ 处的荧光强度, ε (λ )为受体在λ 处的摩尔吸收系数。 F为加入能量受体后供体的荧光强度, F₀为没有加入受体时供体的荧光强度, k²为偶极空间取向因子, 能量供体和受体在空间分布可认为是随机且均等的, 故k²取2/3, N为水和有机溶剂的平均折射率, E是能量转移效率, R₀为Fö rster半径, 是指能量转移效率为50%时供体和受体之间的距离, r是能量供体和受体之间的能量转移距离。 相关数值代入上述公式通过计算得J为1.22× 10^-12 cm³· L· mol^-1, E=0.15, R₀=3.48 nm, r=4.63 nm, 结果表明, R₀和r在28 nm之间, 故说明CDs能和EB发生荧光共振能量转移(FRET)。

如图3所示, CDs具有荧光, 在420 nm处产生1个较强的荧光峰。 EB的最佳吸收峰位于516 nm, 其与CDs的荧光峰之间相差96 nm。 CDs的荧光光谱(图3, 曲线b)与EB的吸收光谱(图3, 曲线c)有较好的重叠, 并且CDs的吸收峰和EB的发射峰能明显的分开。

图3

Fig.3

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	图3 a: CDs的吸收光谱; b: CDs的发射光谱; c: EB的吸收光谱; d: EB的发射光谱Fig.3 a: Absorption of CDs; b: emission of CDs; c: absorption of EB; d: emission of EB (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6mol· L-1)

为了得到较好的转移效果, 以340 nm处的光激发CDs-EB混合体系, 构建了CDs-EB的FRET体系。 如图4所示, 当固定CDs的浓度, 改变EB的浓度时, 发现随着EB浓度的增加, 供体CDs将能量转移给了受体EB, 导致CDs的荧光强度下降, EB的荧光强度增加。 因此, 在FRET体系中, CDs作为供体, 而EB作为受体。 当固定EB的浓度, 改变CDs的浓度时, 随着CDs浓度的增加, CDs和EB的荧光强度都增加(图5)。 由此表明CDs和EB间发生了有效的FRET。 图6进一步说明CDs与EB之间的确发生了有效的FRET。

图4

Fig.4

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	图4 EB浓度对FRET体系的影响Fig.4 Effect of the concentration of EB on FRET system (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB(a— d): 0, 2× 10-7, 3× 10-7, 5× 10-7, 2× 10-6 mol· L-1)

图5

Fig.5

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	图5 CDs浓度对FRET体系的影响Fig.5 Effect of the concentration of CDs on FRET system(CDs (a— d): 0, 1.7, 5.1, 8.5, 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6mol· L-1)

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 a: CDs的荧光光谱; b: EB的荧光光谱; c: CDs-EB体系的荧光光谱Fig.6 a: Fluorescence spectra of CDs; b: fluorescence spectra of EB; c: fluorescence spectra of CDs and EB. (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2.0× 10-6mol· L-1)

在图7中, 加入PEFL后能明显的增强CDs的荧光, 而对EB的荧光强度影响不大。 且随着PEFL浓度的增大, Δ F在一定范围内与PEFL的浓度呈良好的线性关系, 故建立了一种检测PEFL含量的新方法。

图7

Fig.7

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	图7 PEFL浓度对CDs-EB FRET的影响Fig.7 Effect of PEFL concentration on FRET system (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6mol· L-1; PEFL (a— g): 0.016 8, 0.168, 1.68, 2.69, 3.35, 5.03, 6.71 μ g· mL-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

2.4.1 反应介质及酸度的影响

探究了PBS(磷酸盐), Tris-HCl, NaAc-HAc, NaAc-HCl, B-R(Britton-Robinson)5种缓冲液对CDs-EB的FRET体系的影响。 结果表明, 以PBS缓冲液为反应介质, 体系的线性关系和灵敏度较好, 故选择PBS缓冲溶液为最佳缓冲介质。 在图8中, 当pH 3.0时体系的荧光变化值Δ F最大, 在pH 3.0之后Δ F值开始下降, 在pH 6.0和10.0略有上升, 但都没有pH 3.0变化大, 故确定体系的最佳pH值为3.0。 在图9(a)中, 当用量为1.0 mL时, Δ F值最大, 之后又依次减小, 故1.0 mL为该PBS缓冲液的最佳用量。

图8

Fig.8

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	图8 pH值对CDs-EB-PEFL体系的影响Fig.8 Effect of pH on the CDs-EB-PEFL system (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6mol· L-1; PEFL: 3.35 μ g· mL-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

图9

Fig.9

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	图9 PBS用量的影响(a)和时间扫描(b)Fig.9 Effect of PBS dosage (a) and the time scanning (b) (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6 mol· L-1; PEFL: 3.35 μ g· mL-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

2.4.2 稳定性

在优化的实验条件下, 探究反应时间对CDs-EB的FRET体系测定PEFL含量的影响。 由时间扫描结果可知[图9(b)], 该体系受反应时间影响不大。 为使反应充分, 可定容后放置10 min, 这个时间段体系较稳定, 且放置1 h后体系基本稳定不变, 故说明该体系稳定性较好。

为了证明CDs-EB-PEFL这个体系的选择性, 探究了不同干扰物质对测定3.35 μ g· mL^-1 PEFL的影响, 如图10所示。 常见的阳离子如Fe³⁺, Al³⁺, Ca²⁺, Zn²⁺等13种阳离子对体系不造成影响, 阴离子如Cl^-, N O3-, C O32-, I^-等17种阴离子对该体系也不构成影响, 并且如抗坏血酸(vitamin c, Vc), 异烟肼(isoniazid, INH), 肝素钠(heparin sodium, HS), 三聚氰胺(melamine)这些物质也对该体系无明显影响。 说明该方法的选择性较高。

图10

Fig.10

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	图10 干扰物质的影响Fig.10 Effect of coexistence substance(CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6 mol· L-1; PEFL: 3.35 μ g· mL-1; ions: 5× 10-5mol· L-1; medicines: 10.0 μ g· mL-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

为了进一步探究FRET体系的稳定性, 考察了盐浓度的影响, 结果如图11所示。 在0.02.0 mol· L^-1范围内, 随着NaCl的浓度的增加, CDs的荧光值基本不变, 说明在较高的离子强度下荧光强度变化不大, 该体系较稳定。

图11

Fig.11

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	图11 NaCl浓度的影响Fig.11 Effect of NaCl concentration (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6 mol· L-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

在构建好的CDs-EB的FRET体系中, 在最优的条件下, 以荧光强度改变值Δ F为纵坐标, 以PEFL的浓度为横坐标, 绘制工作曲线(图12)。 体系的荧光改变值Δ F与PEFL的浓度ρ 在0.016 86.71 μ g· mL^-1范围内有良好的线性关系, 线性方程为Δ F=693.54ρ +23.64, 相关系数r为0.998 5, 检出限为0.072 5 ng· mL^-1(3s/k, s为11次平行测定的标准偏差, k为线性方程的斜率)。

图12

Fig.12

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	图12 工作曲线Fig.12 Working curve (CDs: 17.0 μ g· mL-1; EB: 2× 10-6 mol· L-1; PEFL: 0.016 8, 0.168, 1.68, 2.68, 3.35, 5.03, 6.71 μ g· mL-1; PBS pH 3.0 1.0 mL)

为了探究CDs-EB的FRET体系测定培氟沙星的可行性和实用性, 考察了该方法测定甲磺酸培氟沙星胶囊(浙江迪尔药业有限公司, 0.2 g· 粒^-1按培氟沙星计)和片剂(内蒙古通辽制药股份有限公司, 0.1 g· 片^-1按C₁₇H₂₀FN₃O₃计)中的培氟沙星含量。 按照参考文献[32]进行样品预处理: 将甲磺酸培氟沙星胶囊、 片剂研细, 分别准确称取0.100 0 g, 用30 mL 0.10 mol· L^-1的HCl溶解定容至100 mL, 摇匀过滤。 分别准确移取适量滤液, 按2.2.2的实验方法进行测定, 并同时进行加标回收实验。 结果如表1所示, 甲磺酸培氟沙星胶囊、 片剂的回收率分别为100.4%和105.1%, 相对标准偏差分别为0.86%和2.5%。 由此表明了CDs-EB荧光共振能量转移体系测定培氟沙星的方法可行。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 样品的分析结果 Table 1 Analytical results of samples (n=5) 样品 总含量/ (g· 粒-1或片) 测得值/ (μ g· mL-1) RSD/ % 平均值/ (μ g· mL-1) 加入量/ (μ g· mL-1) 平均值/ (μ g· mL-1) 回收率 /% RSD /% 1 0.2404 2.420, 2.502, 2.425, 2.428, 2.402 1.6 2.435 2.482, 2.457, 2.476, 2.430, 2.457 2.460 100.4 0.86 2 0.1298 2.529, 2.560, 2.523, 2.633, 2.650 2.3 2.579 2.729, 2.692, 2.669, 2.654, 2.824 2.714 105.1 2.5

表1 样品的分析结果 Table 1 Analytical results of samples (n=5)