二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC, 美国Sigma公司, 纯度> 99%); 吴茱萸碱(上海源叶生物科技有限公司, 纯度≥ 98%); 其他国产试剂均为分析纯。

傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo-Nicolet公司); DSC3型差示扫描量热仪(瑞士梅特勒-托利多公司); XSE105DU 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣); DZF6050型真空干燥设备(上海一恒)。

1.3.1 吴茱萸碱脂质体的制备

参照文献[9]制备脂质体: 按计量比例称取DPPC和吴茱萸碱, 溶解于氯仿中, 通过旋转蒸发除去氯仿, 至烧瓶内

壁形成均匀透明的薄膜, 后置于真空干燥箱中过夜以除去残留的有机溶剂。 而后加入超过量的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液, 置于65 ℃水浴1 h, 经旋涡混合后室温放置20 min, 如此循环3次, 至体系均匀分散, 得吴茱萸碱摩尔百分比(x)分别为0, 2, 5, 10, 15和20的吴茱萸碱脂质体。 由于用蒸馏水配置的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液制备的脂质体在进行红外光谱测定时会对DPPC的羰基吸收峰造成影响, 因此, 本实验采用由重水配置的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲溶液制备脂质体进行红外光谱羰基吸收峰的测定。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱实验

波数范围为4 000~900 cm^-1, 扫描次数为64次, 对涂抹在CaF₂窗片上的样品进行红外扫描。 实验结果见图2、 图3与表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同摩尔百分比的吴茱萸碱脂质体的红外特征吸收带的峰位置 Table 1 The peak-position of infrared characteristic absorption bands for DPPC liposomes containing different molar percentage of evodiamine 吴茱萸碱摩尔 百分比/mol% 波数/cm-1 ν asCH3 ν asCH2 ν sCH2 ν asP O2- hydrogen-bonded ν C═O non-hydrogen-bonded ν C═O 0 2 954.5 2 917.8 2 848.4 1 242.0 1 726.0 1 737.6 2 2 956.4 2 917.8 2 850.3 1 242.0 1 728.0 1 737.6 5 2 956.4 2 917.8 2 850.3 1 242.0 1 731.8 1 737.6 10 2 956.4 2 917.8 2 850.3 1 236.3 1 728.0 1 737.6 15 2 954.5 2 917.8 2 850.3 1 236.2 1 727.9 1 737.6 20 2 954.5 2 917.8 2 850.3 1 236.2 1 728.0 1 737.6 ν : Stretching band; as: asymmetric; s: symmetric

表1 不同摩尔百分比的吴茱萸碱脂质体的红外特征吸收带的峰位置 Table 1 The peak-position of infrared characteristic absorption bands for DPPC liposomes containing different molar percentage of evodiamine

图2

Fig.2

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	图2 不同摩尔百分比的吴茱萸碱/DPPC脂质体的FTIR吸收光谱Fig.2 FTIR absorption spectra of DPPC liposomes containing different molar percentage of evodiamine

图3

Fig.3

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	图3 DPPC不同基团红外吸收波数的移动值与吴茱萸碱摩尔百分比的关系曲线Fig.3 The relationship between the infrared wave number shift of different group of DPPC and the molar percentage of evodiamine

1.3.3 差示扫描量热(DSC)实验

采用高灵敏度传感器HSS8⁺, 实验气氛为N₂, 以空白坩埚做参比。 为了保证样品在升温过程中处于相平衡的状态, 选择较低的升温速率1 ℃· min^-1。 实验结果见图4、 图5与图6。

图4

Fig.4

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	图4 升温速率为1 ℃· min-1时不同浓度的吴茱萸碱/DPPC脂质体的DSC图谱为了清晰地显示前相变, 含吴茱萸碱10 mol%的脂质体的DSC曲线的纵坐标扩大了四倍Fig.4 DSC curves of evodiamine/DPPC liposomes encapsulating different molar percentage of evodiamine collected at a scan rate of 1 ℃· min-1 The DSC curve of liposomes containing 10 mol% of evodiamine has been expanded fourfold to show the pre-transition more clearly

图5

Fig.5

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	图5 脂质体相变温度与吴茱萸碱摩尔百分比的关系图 ●: 主相变; ■: 前相变Fig.5 The relationship between phase transition temperature and molar percent age of evodiamine among liposomes ●: Main phase transition; ■: Pre-transition

图6

Fig.6

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	图6 脂质体相变焓与吴茱萸碱摩尔百分比的关系图 ●: 主相变; ■: 前相变Fig.6 The relationship between enthalpy of phase transition and molar percentage of evodiamine among liposomes ●: Main phase transition; ■: Pre-transition

FTIR光谱是在亚分子水平上表征药物与脂质体相互作用的有力手段。 外源分子与磷脂分子的相互作用会引起磷脂官能团红外振动频率的变化。 DPPC分子极性的头部区域、 界面区域和非极性的疏水尾部区域代表性的基团分别为P O2-, C═0 CH₂和CH₃。 通过傅里叶变换红外光谱可以研究不同量吴茱萸碱的加入对这几个基团的红外特征振动谱带的影响, 从而探讨吴茱萸碱分子与这几个基团间的相互作用。 图2给出了不同浓度的吴茱萸碱/DPPC脂质体的红外吸收光谱图, 表1列出了上述基团红外特征吸收振动带的位置。 图3选择性地给出了一些特征基团吸收波数的移动值随药物浓度增大而变化的情况。

磷酸基团的不对称伸缩振动(ν _asP O2-)可用来研究药物对DPPC头部基团的影响^{[10, 11]}。 由图2和表1可知, 纯DPPC的ν _asP O2-峰位位于1 242.0 cm^-1处。 在x< 10 mol%时, 吴茱萸碱的加入对磷酸基团的不对称伸缩带并未造成明显的影响, 说明, 在此浓度范围内, 吴茱萸碱分子没有进入脂质体的头部区域。 但当x≥ 10 mol%时, 该伸缩振动带开始向低频方向移动, 由最初的1 242.0 cm^-1处移动到1 236.3 cm^-1附近(波数移动值随药物浓度的变化见图3), 说明在此浓度范围内, 药物进入了DPPC的头部区域, 与磷酸基团发生了相互作用。 这一结果可由后文DSC实验的结果进行进一步验证。

羰基的伸缩振动C═0可用来研究药物对DPPC界面区域的影响^[11]。 由于水的红外吸收峰会对羰基吸收峰造成影响, 因此, 采用由重水配置的缓冲溶液制备的脂质体进行红外光谱羰基吸收峰的测定。 在高度水化的脂质体膜中, 羰基的伸缩振动带常分裂为两个峰, 分别为游离的羰基峰(non-hydrogen-bonded C═0和水化的羰基峰(hydrogen-bonded C═0 不同的药物对DPPC的羰基的伸缩振动谱带的影响不同, 在脂质体界面区域, DPPC分子中羰基会与H₂O分子形成氢键, 形成水化的羰基峰, 可见位于界面区域的羰基基团, 是一个潜在的氢键形成中心^[12]。 由图2和表1可知, 纯DPPC游离的羰基和水化的羰基的伸缩振动带的峰位分别位于1 737.6和1 726.0 cm^-1处, 吴茱萸碱的加入对游离的羰基峰未造成明显的影响, 其峰位基本保持不变, 但是却对水化的羰基峰造成了明显的影响。 在0 mol%< x< 5 mol%浓度范围内, 随着药物浓度的增大, 水化的羰基峰的吸收频率增大, 由最初的1 726.0 cm^-1处移动到1 731.8 cm^-1附近, 波数移动值为5.8 cm^-1(波数移动值随药物浓度的变化见图3), 说明在此浓度范围内, 有部分药物进入了DPPC分子的界面区域, 并与界面区域的羰基结合, 使羰基的水化程度减小。 在10 mol%≤ x< 20 mol%范围内, 水化的羰基峰又向低频方向移动, 峰位位于1 728.0 cm^-1附近, 说明在此浓度范围内, 吴茱萸碱分子与DPPC界面区域的羰基的结合程度有所降低。 这与前文ν _asP O2-基团红外光谱数据已经得到的“ x≥ 10 mol%时药物主要作用于DPPC分子头部区域” 的结论是一致的, 后文DSC数据结果也能进一步验证这一结论的正确性。

亚甲基的不对称(ν _asCH₂)和对称伸缩振动(ν _sCH₂)以及甲基的不对称伸缩振动(ν _asCH₃)可用来分析吴茱萸碱的加入对DPPC酰基链的影响。 由图2和表1可知, 纯DPPC的ν _asCH₂, ν _sCH₂和ν _asCH₃的峰位分别位于2 917.8, 2 848.4和2 954.5 cm^-1处, 与Beré nyi和Kamiń ski等的报道相一致^{[13, 14]}。 各浓度吴茱萸碱的加入使得载药脂质体的ν _sCH₂谱带的峰位均移动到了2 850.3 cm^-1处, 说明各浓度载药脂质体中DPPC的疏水尾链区都有药物分子存在, 这一结论与之后DSC实验结论相一致。 Wu等报道胆碱类磷脂分子疏水尾链混乱度增大将导致ν _sCH₂吸收谱带的蓝移^{[15, 16]}。 本实验ν _sCH₂谱带峰位的蓝移, 说明药物的加入使DPPC疏水酰基链的混乱度增大, 进而将导致主相变温度降低, 这一点可由之后DSC实验证实。 虽然吴茱萸碱对ν _asCH₂谱带峰位的影响较小, 但是却对其谱带的带宽具有明显的影响。 ν _asCH₂谱带宽度的变化可以间接反映药物分子对生物膜流动性的影响^[17]。 在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 图2显示ν _asCH₂谱带明显展宽, 预示着生物膜的流动性增加, 说明在此浓度范围内有药物分子作用于DPPC疏水尾链区; 当x> 10 mol%时, ν _asCH₂谱带的带宽又开始减小, 说明此时疏水尾链间的药物浓度开始减少, 药物对生物膜的流动性的影响也减弱。 此后DSC实验也可验证这一结论。 药物的加入对ν _asCH₃谱带位置也有明显的影响。 由图2和表1可知, 在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 载药脂质体的ν _asCH₃谱带的峰位发生了明显的移动, 从最初的2 954.5 cm^-1处移动到了2 956.4 cm^-1处, 波数移动值为1.9 cm^-1(见图3), 说明在此浓度范围内, DPPC的疏水尾链末端区域含有大量的吴茱萸碱分子。 但当x> 10 mol%时, 载药脂质体的ν _asCH₃谱带的频率又与纯DPPC脂质体的ν _asCH₃谱带的频率相等, 说明在此浓度范围内DPPC的疏水尾链“ 末端区域” 几乎不再有药物分子。

作为生物膜的模型膜, 脂质体与生物膜一样, 在温度、 pH等外界条件的影响下, 会呈现不同的相态, 如层状凝胶相(L_{β '})、 波动凝胶相(P_{β '})和层状液晶相(L_α )等。 随着温度的升高DPPC脂质体一般会经历两个相变, 分别为前相变和主相变^{[18, 19]}。 在本实验中, 采用DSC曲线的起始温度(onset temperature, 用DSC仪器自带的STARe 软件确定)作为各脂质体的相变温度。 由图4可知, 纯DPPC脂质体在34.2和41.3 ℃, 分别发生了前相变和主相变。

主相变代表着P_{β '}相向L_α 相的转变^[18], 与DPPC分子中碳氢链的变化有关。

根据图5与图6 主相变温度和主相变焓随浓度的变化可知, 在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 主相变温度与主相变焓随着药物浓度的增加均呈现逐渐减小的趋势。 有文献报道药物作用于磷脂分子疏水尾链将减弱疏水尾链之间的相互作用, 使主相变温度和主相变焓下降^{[7, 18, 20, 21]}。 本实验结果说明在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 吴茱萸碱分子主要作用于DPPC分子疏水尾链区, 减小了DPPC分子疏水尾链间的相互作用, 使得DPPC分子的疏水尾链变的更加的无序, 致使载药脂质体更易发生主相变, 因而主相变温度和主相变焓均随药物浓度的增大而减小, 这一结论与2.1节红外光谱数据得到的结论一致。

根据图5与图6, 在10 mol%≤ x< 20 mol%浓度范围内, 随着吴茱萸碱药物浓度的增加, 主相变温度与主相变焓均呈增加趋势。 且当x≥ 15 mol%时, 载药脂质体的主相变焓已经明显高于纯DPPC脂质体的主相变焓, 而载药脂质体的主相变温度则始终低于纯DPPC脂质体的主相变温度。 这可能与主相变过程中DPPC头部和疏水尾链区域存在不同步的变化有关: Wu等报道DPPC脂质体的主相变过程是由疏水尾链启动的^[15]。 因此主相变温度主要取决于DPPC分子疏水尾链周围的环境^[7]。 而主相变焓代表着DPPC分子在主相变过程中尾部和头部分子所吸收的热量的总和, 因此主相变焓与DPPC分子疏水尾链周围的环境和头部基团周围的环境都有关^[7]。 前已述及, 药物与DPPC疏水尾链区域结合, 会使得DPPC尾链间的相互作用减小, 从而使主相变焓减少。 由图1可知, 吴茱萸碱的分子结构中含有亚氨基, 可能与DPPC分子头部的活性基团形成氢键, 使DPPC头部区域分子间作用力增大, 从而导致主相变焓增加。 由载药保留脂质体的主相变温度随药物浓度增大而逐渐升高, 却始终低于纯DPPC脂质体的主相变温度这一现象可知, 在此浓度范围内, DPPC的疏水尾链周围一直存在吴茱萸碱, 但是, 随着药物浓度的逐渐增大, 处于DPPC疏水尾链间的药物含量逐渐减少。 由载药脂质体的主相变焓随药物浓度增大而逐渐增加并最终明显高于纯DPPC脂质体的主相变焓这一现象可知, 在此浓度范围内, 有吴茱萸分子进入了DPPC的头部区域, 并与DPPC的头部区域的基团发生了相互作用。 由以上的分析可知, 在10 mol%≤ x< 20 mol%浓度范围内, 随着吴茱萸碱药物浓度的增加, 新增加的药物会进入DPPC的头部区域, 同时位于疏水尾链中的部分药物也有部分向头部转移。 这一结论与前文红外光谱数据得到的结论一致。

前相变是指L_{β '}到P_{β '}的转变。 通过前相变温度和前相变焓随药物浓度的变化也可得到上述结论。 由图5和图6可知, 在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 载药脂质体前相变温度与前相变焓均低于纯DPPC脂质体的前相变温度与前相变焓, 且二者随药物浓度的增加而逐渐减小。 前相变与DPPC分子头部基团的变化密切相关。 前已述及, 吴茱萸碱的亚氨基可能与DPPC分子头部的活性基团形成氢键, 使得脂质体发生前相变时的相变温度和相变焓均增加, 因此在此浓度范围内吴茱萸碱分子不可能大量进入DPPC分子的头部区域。 但当药物作用于DPPC的疏水尾链时, 药物的加入会使得DPPC疏水尾链间的相互作用力减少, 使得疏水尾链变的更加的无序。 DPPC分子作为一个整体, 尾链间的混乱也会对头部基团产生一定的影响, 使得脂质体发生前相变时, 相变温度降低, 相变焓减小。 结合图5和图6数据可知, 在0 mol%< x< 10 mol%的浓度范围内, 吴茱萸碱分子主要进入DPPC分子的疏水尾链区域而不是头部极性区域, 与前文根据主相变量热数据得到的结论一致。 在10 mol%≤ x< 20 mol%浓度范围内, 载药脂质体的前相变温度和前相变焓均随药物浓度的增大呈现逐渐增加的趋势, 因此在该浓度范围内, 吴茱萸碱分子主要进入DPPC分子头部的极性区域, 也与前文根据主相变量热数据得到的结论一致。

生物膜的流动性是其生命活动的重要保证。 在0 mol%< x< 10 mol%浓度范围内, 图2显示ν _asCH₂谱带明显展宽, 预示着生物膜的流动性增加; 当x> 10 mol%时, ν _asCH₂谱带的带宽又开始减小, 说明此时药物对生物膜的流动性的影响也减弱。 研究药物对脂质体模拟生物膜相变温度的影响, 也可揭示药物对生物膜流动性的影响^{[6, 22]}。 相变温度越低, 说明生物膜流动性越强。 由图5可知, 随着药物浓度的增加, 载药脂质体的相变温度始终低于纯DPPC脂质体的相变温度, 这说明吴茱萸碱分子可以使生物膜的流动性增加。 同时, 实验数据也表明, 当x=10 mol%时, 载药脂质体的前相变温度和主相变温度均达到最小值, 预示着在此药物浓度下, 吴茱萸碱分子使生物膜流动性增加的程度最大。

吴茱萸碱具有抗炎的药理作用^[2], 在炎症反应中, 细胞膜会发生脂质过氧化反应, 造成细胞膜流动性的降低。 Nunes 等的研究表明, 生物膜流动性的增加将使之不易被氧化^[23]。 本实验由FTIR和DSC实验结果显示, 吴茱萸碱具有增大生物膜流动性的作用, 并且, 当药物浓度为10 mol%时, 吴茱萸碱对生物膜流动性的增加最为明显。 这一结论将有助于进一步揭示吴茱萸碱的抗炎作用机制。