由于氧化锌纳米粒子(ZnO NPs)具有大比表面积效应和较强的氧化还原能力, 因此ZnO NPs已经被广泛地用于化妆品、 橡胶、 医学、 化学纤维、 电子工业和其他领域^[1]。 人们将ZnO NPs加入到防晒霜中, 使其能有效地吸收长波紫外线^[2]。 ZnO NPs有抗衰老、 抗摩擦、 低消耗和长寿命等优点, 因此它可以作为高速耐磨橡胶制品的添加剂^[3]。 ZnO NPs有抗菌、 脱臭和自清洁等特点, 被用于卫浴产品当中^[4]。 然而, 在生产、 使用和处理过程中, ZnO NPs不可避免地释放到环境当中。 据统计, ZnO NPs每年的生产总量在550~5 550 t, 其产量大约是任何其他纳米材料的10~100倍^[5]。 在欧洲, 天然水和海水中ZnO NPs的含量分别是10和430 ng· L-1[5]。 有研究表明, ZnO NPs能够抑制大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌的生长^[6], 能明显地抑制黑麦草、 萝卜和油菜根的生长^[7], 影响斑马鱼的发育^[8]。 ZnO NPs对植物的毒性主要表现在抑制种子的萌发、 产生基因毒性从而影响DNA的表达、 影响光合系统、 降低叶绿素的含量和减少植物的生物量^[9]。 ZnO NPs对水生高等植物的毒性研究相对较少^[10], 细叶蜈蚣草(Egeria najas)属于水蟹科蜈蚣草属, 是广泛分布在南美一带的沉水植物, 后作为一种观赏性水草引入中国。 很多研究已经证实细叶蜈蚣草具有净化水质的功能。 我们采用细叶蜈蚣草作为受试植物, 研究ZnO NPs对其光合作用的影响。

叶绿素a荧光检测在过去的几十年已经被广泛地应用到光合作用研究中, 对于分析光合生物对各种因素的生理反应。 这一技术是具有便捷、 可靠、 对生物体没有影响的优点。 叶绿素a荧光检测是通过测量光系统Ⅱ 发出的叶绿素a荧光的变化来分析植物光合作用受到的影响^[11]。 光系统Ⅱ 的荧光产量主要受到两方面的影响, 一方面是光系统Ⅱ 反应中心绑定的醌受体的氧化还原(光化学荧光猝灭, qP), 另一方面是在光系统天线色素分子中发生的热能耗散。 在适应光照的过程中, 这种耗散性能的增强来源于非光化学荧光猝灭(NPQ)。 目前, 人们一般用两种不同的方法来测量叶绿素a荧光: (1) 经过暗适应处理后, 用一个短的饱和脉冲光来测量快速荧光动力学曲线。 (2) 在几分钟的光化光适应后, 叶绿素a荧光达到稳态, 通过加饱和脉冲光的方法测量荧光产量从而分析稳态下的光合作用情况^[12]。 通过用脉冲振幅调制荧光仪(PAM)测量非光化学荧光猝灭可以得到发生在光系统Ⅱ 中的调节性能量耗散量子产量、 非调节性能量耗散量子产量和实际光化学效率^[13]。 通过用植物效率分析仪(PEA)测量快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)可以获得更多的信息。 OJIP曲线反应了光系统Ⅱ 受体侧电子从微秒级到秒级的电子传递情况, 曲线中可以得出一些重要信息。 例如在光系统Ⅱ 中的能量捕获、 电子传递、 天线复合体上的激发能依靠质子梯度的热能耗散等^[14]。 因此本文就通过这两种叶绿素a荧光检测法研究ZnO NPs对细叶蜈蚣草光合作用的影响。

有研究者认为ZnO NPs的毒性是由其悬浮液中溶解释放的Zn²⁺造成的^{[9, 10, 15]}, 故配置了相应浓度的Zn²⁺用来处理细叶蜈蚣草, 检测Zn²⁺对细叶蜈蚣草光合作用的影响, 并与ZnO NPs作对照。 结果表明ZnO NPs在某些方面促进了细叶蜈蚣草的光合作用, 而当Zn²⁺浓度为0.4 mg· L^-1时, Zn²⁺就已经抑制了细叶蜈蚣草的光合作用。

通过对去离子水中培养的细叶蜈蚣草进行叶绿素a荧光的探测, 经统计分析后, 发现反映植物光合作用的一系列荧光参数并没有发生明显的变化且显著性水平p均大于0.05。 从而说明同一根细叶蜈蚣草不同部分的光合作用情况并没有明显的差别。

细叶蜈蚣草在经过ZnO NPs和Zn²⁺处理6 d之后, 光合作用的变化如图2所示, 我们可以看到O, J, I和P点大致发生在20 μ s, 2, 30和400 ms处。 在图2(a)中可以明显看出, 细叶蜈蚣草经过ZnO NPs处理之后, 初始荧光的斜率和J点的相对可变荧光强度随着浓度的增加有减小的趋势。 在图2(b)中, 当细叶蜈蚣草经过Zn²⁺处理之后, 初始荧光的斜率和J点的相对可变荧光强度随着浓度的增加有增大的趋势。

图2

Fig.2

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	图2 经过ZnO NPs(a)和Zn2+(b)处理6 d后的细叶蜈蚣草快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP), 将叶绿素a荧光强度在O和P之间进行归一化处理, 记作V=(Ft-FO)/(FM-FO)Fig.2 Chl-a fluorescence transient(OJIP)of Egeria najas exposed six days to ZnO NPs (a) and Zn+(b), Chl-a fluorescence level normalized between O ane P fluorescence levels as V=(Ft-FO)/(FM-FO)

通过JIP测定计算出相应的荧光参数来分析ZnO NPs和Zn²⁺对光系统Ⅱ 的影响。 从图3(a)中可以看出, 当ZnO NPs的浓度处于20~80 mg· L^-1, 光系统Ⅱ 关闭的净速率(M_O)和J点的叶绿素a相对可变荧光强度(V_J)有明显降低的趋势(p< 0.05), 当浓度处于80 mg· L^-1时, M_O降低了33.4%, V_J降低了20.5%, 但是当浓度达到100 mg· L^-1, M_O和V_J降低的趋势并不明显(p> 0.05)。 这可能是由于ZnO NPs处于高浓度时, 团聚增强, 从而影响了其对细叶蜈蚣草的作用^{[8, 18]}。 在图3(b)中, 当Zn²⁺浓度处于0.4~2.0 mg· L^-1时, M_O和V_J会随着浓度的增加有明显增加的趋势(p< 0.05), 当Zn⁺浓度处于2.0 mg· L^-1时, M_O增加了89%, V_J增加了47.6%。

图3

Fig.3

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	图3 ZnO NPs(a)和Zn2+(b)对光系统Ⅱ 关闭的净速率和J点的叶绿素a相对可变荧光强度的影响Fig.3 Effect of ZnO NPs (a) and Zn2+ (b) on the net rate of PSⅡ closure and chl-a relative variable fluorescence at J-step

图4描述了经过ZnO NPs和Zn²⁺处理之后, 单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、 捕获的光能(TR₀/RC)、 用于电子传递的能量(ET₀/RC)和用于热耗散的能量(DI₀/RC)都有不同程度的变化。 在图4(a)中, ABS/RC, TR₀/RC和DI₀/RC随着ZnO NPs的浓度增加有降低的趋势。 当ZnO NPs浓度处于40和60 mg· L^-1时, ABS/RC降低明显(p< 0.05); TR₀/RC只在浓度处于60 mg· L^-1时有明显的降低(p< 0.05); 当ZnO NPs的浓度处于20~80 mg· L^-1时, DI₀/RC有明显的降低(p< 0.05)。 但是经过ZnO NPs处理后, ET₀/RC几乎保持恒定, 没有发生明显变化(p> 0.05)。 在图4(b)中, ABS/RC, TR₀/RC和DI₀/RC随着Zn²⁺浓度的增加有明显的增加的趋势(p< 0.05); 而ET₀/RC仍然几乎保持恒定, 并没有发生明显的变化(p> 0.05)。 当Zn²⁺浓度处于2.0 mg· L^-1时, ABS/RC增加了45.8%, TR₀/RC增加了28.6%, DI₀/RC增加了107.7%。

图4

Fig.4

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	图4 经过ZnO NPs(a)和Zn2+(b)处理后, 细叶蜈蚣草光系统Ⅱ 的能量流发生的变化Fig.4 Change in the energy fluxes within PSⅡ for Egeria najas exposed to ZnO NPs (a) and Zn2+(b)

图5描述了经过ZnO NPs和Zn²⁺处理之后, 细叶蜈蚣草光系统Ⅱ 能量利用率的变化。 在图5(a)中, 随着ZnO NPs浓度的增加, 最大光化学量子效率(Φ _P0)、 捕获的激子中用来推动电子传递的效率(Ψ ₀)和电子传递的量子产额(Φ _E0)有上升的趋势, 浓度在20~80 mg· L^-1之间有明显的上升趋势(p< 0.05), 当浓度处于80 mg· L^-1时, Φ _P0, Ψ ₀和Φ _E0分别上升了5.6%, 12.8%和19%。 在图5(b)中, 随着Zn²⁺浓度的增加, Φ _P0, Ψ ₀和Φ _E0有明显的下降的趋势(p< 0.05)。 当Zn²⁺浓度在2.0 mg· L^-1时, Φ _P0, Ψ ₀和Φ _E0分别下降了11.9%, 23.1%和32.3%。

图5

Fig.5

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	图5 经过ZnO NPs(a)和Zn2+(b)处理后, 细叶蜈蚣草光系统Ⅱ 能量利用率的变化Fig.5 Changce of energy fluxes ratios of PSⅡ in Egeria najas exposed to ZnO NPs (a) and Zn2+(b)

图6描述了经过ZnO NPs(a)和Zn²⁺(b)处理后, 细叶蜈蚣草单位面积含有活性反应中心的数量(RC/CS)发生的变化。 在图6(a)中, 随着ZnO NPs浓度的增加, RC/CS几乎保持恒定, 没有发生明显的变化(p> 0.05)。 在图6(b)中, 随着Zn²⁺浓度的增加, RC/CS有明显的下降趋势(p< 0.05), 当浓度在2.0 mg· L^-1时, RC/CS降低了66.1%。

图6

Fig.6

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	图6 经过ZnO NPs(a)和Zn2+(b)处理后, 细叶蜈蚣草单位面积含有活性反应中心的数量发生的变化Fig.6 Change of the amount of active PSⅡ reaction centers per cross section for Egeria najas exposed to ZnO NPs (a) and Zn2+(b)

通过脉冲瞬态荧光动力学曲线的测量, 我们可以得到光系统Ⅱ 吸收光能的耗散分配的几个参数, 其中包括光化学能量耗散的方式、 调节性能量耗散方式和非调节性能量耗散方式。 图7描述了经过ZnO NPs(a)和Zn²⁺(b)处理后, 细叶蜈蚣草光系统Ⅱ 吸收能量的耗散过程的变化。 在图7(a)中, 随着ZnO NPs浓度的增加, 光系统Ⅱ 的实际光化学量子效率(ϕ '_PSⅡ )有增加的趋势, 当浓度处于40~100 mg· L^-1时, 增加的趋势比较明显(p< 0.05); 而调节性能量耗散量子产量 (ϕ '_NPQ)和非调节性能量耗散量子产量(ϕ '_NO)有降低的趋势, 但降低趋势不明显。 在图7(b)中, 随着Zn²⁺浓度的增加, ϕ '_PSⅡ 降低明显(p< 0.05), ϕ '_NO升高明显(p< 0.05), 而ϕ '_NPQ有先增加后降低的趋势。

图7

Fig.7

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	图7 经过ZnO NPs(a)和Zn2+(b)处理后, 细叶蜈蚣草光系统Ⅱ 吸收能量的耗散过程的变化Fig.7 Change of energy dissipation processes for PSⅡ in Egeria najas exposed to ZnO NPs (a) and Zn2+ (b)

经过快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和脉冲瞬态荧光动力学曲线的测量以及相应光合作用荧光参数的统计分析, 可以得出ZnO NPs和Zn²⁺对细叶蜈蚣草光合作用的影响。 当细叶蜈蚣草经过ZnO NPs处理后, 光系统Ⅱ 关闭的净速率和J点的叶绿素a相对可变荧光强度有明显的下降趋势, 最大光化学量子效率、 电子传递的量子产额、 捕获的激子中用来推动电子传递的效率煌光系统Ⅱ 的实际光化学量子效率有明显的上升趋势, 这表明在电子传递和吸收光能的利用方面, ZnO NPs对细叶蜈蚣草的光合作用有促进的作用; 当细叶蜈蚣草经过Zn²⁺处理后, 通过分析光系统Ⅱ 受体侧的变化、 光系统Ⅱ 单位反应中心能量流的变化和光系统Ⅱ 能量耗散的变化, 得到Zn²⁺抑制了细叶蜈蚣草光合作用的影响。

已有研究表明, ZnO NPs会对植物产生有毒的影响。 这些影响可能来源于氧化锌纳米粒子产生的活性氧(ROS)对细胞产生氧化胁迫, ZnO NPs悬浮液中Zn²⁺的释放以及氧化锌纳米粒子对细胞造成的物理损伤^[19]。 Lin等^[18]用ICP的方法测得100 mg· L^-1的ZnO NPs悬浮液中Zn²⁺的浓度大约在1 mg· L^-1。 Shaymurat等^[20]对浓度在10~50 mg· L^-1的ZnO NPs悬浮液中的Zn²⁺浓度进行了检测, 结果表明, 其浓度为0.353~1.936 mg· L^-1。 所以本实验将Zn²⁺溶液的浓度配置成0.4, 0.8, 1.2, 1.6和2.0 mg· L^-1。 分别用ZnO NPs和Zn²⁺对细叶蜈蚣草(Egeria najas)进行处理, 通过快速荧光动力学曲线和脉冲瞬态荧光动力学曲线的测量, 分析比较二者对细叶蜈蚣草光合作用的影响。

首先, OJIP曲线反映了光系统Ⅱ 电子受体库的一系列变化。 很多实验结果和理论模拟已经表明, J点与 QA-Q_B形式的积累有关。 相应地, I和P点分别与 QA-QB-和 QA-QB2-形式的积累有关。 因此, OJIP曲线可以用来检测电子传递的状态。 通过JIP测定参数的分析, 发现经过ZnO NPs和Zn²⁺的处理, 光系统Ⅱ 受体侧的电子传递发生了不同的变化。 V_J反应了光照2 ms时活性反应中心关闭的程度, M_O反应了光系统Ⅱ 反应中心关闭的净速率。 在图3中可以看出, 细叶蜈蚣草经过ZnO NPs处理后, 光系统Ⅱ 受体侧的电子传递和光系统Ⅱ 反应中心之间的连通性得到了增强, 而Zn²⁺则抑制了光系统Ⅱ 受体侧的电子传递和降低了光系统Ⅱ 反应中心之间的连通性。 Φ _P0反映了暗适应后光系统Ⅱ 的最大光化学量子效率; Ψ ₀反映了在光系统Ⅱ 反应中心捕获的激子中, 用来推动电子传递链中位于Q_A下游的其他电子受体还原的激子数目与推动Q_A还原的激子数目的比率, 即开始光照2 ms时活性反应中心的开放程度; Φ _E0表示反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额, 即反应中心吸收的光能有多少用于将电子传递到电子传递链中Q_A下游的其他电子受体。 在图5中可以看出ZnO NPs促进了光系统Ⅱ 对吸收光能的利用, 而Zn²⁺则抑制了光系统Ⅱ 对吸收光能的利用。 图6可看出ZnO NPs并没有改变活性反应中心数量(RC/CS), 而Zn²⁺则在很大程度上减少了活性反应中心数量, 失活的反应中心只是作为一个能量陷阱, 它们吸收了光能, 但并不能将吸收的光能用于电子传递。 结合图4和图6, 经过ZnO NPs处理后, 单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)和捕获的光能(TR₀/RC)都有减少的趋势, 可能是由于ZnO NPs抑制了叶绿素的合成, 这与赵桂琦等报道的ZnO NPs降低了叶绿素含量的结果相一致^[9]; 单位反应中心用于热能耗散的能量(DI₀/RC)的减少可能是由于ZnO NPs增加了吸收光能的利用率。 由于Zn²⁺减少了活性反应中心的数量, 因此单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)和捕获的光能(TR₀/RC)有增加的趋势。 单位反应中心用于热能耗散的能量的增加可能是由于Zn²⁺降低了吸收光能利用率的关系。 经过ZnO NPs和Zn²⁺处理之后, 单位反应中心用于电子传递的能量没有发生明显的变化。 当ZnO NPs浓度在100 mg· L^-1时, 这个浓度没有使很多荧光参数相对于对照组发生明显的变化, 这可能是由于纳米粒子在高浓度下发生团聚所致^{[8, 18]}。

其次, 通过脉冲瞬态荧光动力学曲线的测量, 我们可以发现, 光系统中的电子传递经过光合机构的一系列调控, 进入了平稳状态, 即叶绿素a荧光达到了稳态。 这些调控机制包括叶黄素循环和卡尔文循环等。 结合图6和图7, 经ZnO NPs处理后, 反应中心并没有失活, 实际光化学量子效率(ϕ '_PSⅡ )增加而调节性能量耗散量子产量(ϕ '_NPQ)和非调节性能量耗散量子产量(ϕ '_NO)有不同程度的减少, 说明ZnO NPs促进了光系统Ⅱ 反应中心将吸收的光能用于光合电子传递的效率; 经过Zn²⁺处理后, 一些光系统Ⅱ 反应中心失活, 而非调节性能量耗散量子产量(ϕ '_NO)的增加也反映了光系统Ⅱ 反应中心受到了损伤, 可见这两者的结果是相一致的, 而非调节性能量耗散量子产量(ϕ '_NO)出现先增加后降低的趋势, 这可能是由于调节性能量耗散这种保护机制不能应对更高浓度的锌离子。 实际光化学量子效率(ϕ '_PSⅡ )的减少就说明了Zn²⁺抑制了光系统Ⅱ 反应中心将吸收的光能用于光合电子传递的效率。

用去离子水、 ZnO NPs和Zn²⁺分别培养细叶蜈蚣草(Egeria najas), 然后对其进行快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和脉冲瞬态荧光动力学曲线的测量。 经过去离子水培养后, 细叶蜈蚣草不同部分光合作用情况没有明显差异。 经过ZnO NPs处理后, ABS/RC和TR₀/RC降低, 表明ZnO NPs抑制了细叶蜈蚣草叶绿素a的合成, 从而影响了其对光能的吸收; M_O, V_J降低表明ZnO NPs增强了光系统Ⅱ 反应中心之间的连通性并促进了光系统Ⅱ 受体侧的电子传递; DI₀/RC的降低, Φ _P0, Ψ ₀, Φ _E0和ϕ '_PSⅡ 的上升, 表明ZnO NPs促进了光系统Ⅱ 对吸收光能的利用。 所以ZnO NPs在某些方面促进了细叶蜈蚣草的光合作用。 经过Zn²⁺处理后, ABS/RC, TR₀/RC和ϕ '_NO增加, 表明部分光系统Ⅱ 反应中心失活, 这与RC/CS随Zn²⁺的浓度的升高而减少一致。 M_O, V_J上升, 表明Zn²⁺降低了光系统Ⅱ 反应中心之间的连通性, 并且抑制了光系统Ⅱ 受体侧的电子传递。 DI₀/RC的升高, Φ _P0, Ψ ₀, Φ _E0和ϕ '_PSⅡ 的降低, 表明Zn²⁺抑制了光系统Ⅱ 对吸收光能的利用。 因此Zn²⁺抑制了细叶蜈蚣草的光合作用。

很多研究已经表明, ZnO NPs对植物的影响除了来自ZnO纳米粒子自身的性质, 还有可能来自ZnO NPs悬浮液中Zn²⁺的释放。 从本工作结果来看, 尽管Zn²⁺对细叶蜈蚣草的光合作用有明显的抑制, 但暴露于ZnO NPs悬浮液中的细叶蜈蚣草的光系统Ⅱ 反应中心电子传递效率依然得到了增强, 从而促进了其光合作用。 这可能是由于ZnO NPs对光合作用的促进要强于其释放的Zn²⁺对光合作用的抑制。