蛋白质的空间结构及其变化一直是生命科学的研究热点, 高压诱导产生的蛋白质折叠与变性, 近年来受到许多学者的关注。 光谱技术可通过检测蛋白质的酰胺带以及外侧链氨基酸的光谱信息, 对蛋白质的α -螺旋、 β -折叠、 无规则圈以及外侧构象等二级结构信息进行分析^{[1, 2, 3]}, 也可以利用对应的光谱相对强度变化对蛋白质二级结构定量分析^{[4, 5, 6, 7]}。 高压拉曼是目前高压下分析物质结构变化的光谱技术之一, 有学者在高压下对胰岛素空间结构变化进行研究^[6]。 由于蛋白质结构复杂, 且蛋白质的拉曼信号来自构成它的氨基酸侧链, 因此对氨基酸结构变化的拉曼光谱研究有利于研究蛋白质结构变化; 而以晶体形式存在的氨基酸固体被认为是肽的生物模拟, 且可以通过氨基酸晶体结构来了解固体的多样性^[7], 因此研究压力对氨基酸晶体结构的影响吸引了研究人员的关注。

近年来, 不少学者利用高压拉曼研究在不同压力下氨基酸晶体结构的变化。 Abagaro等利用高压拉曼在05 GPa之间对DL-亮氨酸结构变化进行研究。 研究结果表明, DL-亮氨酸晶体晶胞和内模振动模式在2.43.2 GPa之间出现了异常现象, 表明了DL-亮氨酸在2.43.2 GPa之间发生了结构性相变。 通过调研, 我们发现大多数氨基酸晶体在较低的压力下主要发生由晶格振动变化引起的结构相变。 Holanda等在8.5 GPa内利用高压拉曼技术对D-苏氨酸结构变化进行研究。 研究结果表明, D-苏氨酸在2.4 GPa时位于50和95 cm^-1处的两个振动峰消失, 在大于5 GPa时位于100 cm^-1处的振动峰消失, 因此D-苏氨酸分别在1.92.4 GPa之间和5.16.0 GPa之间由于晶格振动的改变而发生了结构相变^[9]。 也有学者利用高压拉曼光谱研究了丝氨酸在高压下分子结构的变化。 Zakharov等利用拉曼光谱对L-丝氨酸和DL-丝氨酸在高压下分子结构的变化进行研究。 研究结果发现, 由于氢键结构的变化, 导致丝氨酸分别在12 GPa和23 GPa内发生结构相变, 同时DL-丝氨酸在34 GPa内由于N— H…O— C层内氢键的变化而发生结构相变^[7]。 目前人们对高压下丝氨酸结构变化的拉曼光谱研究, 最高压力仅达到8.7 GPa^{[7, 10, 11]}, 对于10 GPa以上的压力还未有人涉及。 但是, 目前已有多种氨基酸^{[12, 13, 14]}的高压拉曼光谱研究压力超过20 GPa, 并且在10 GPa以上发现了新的结构相变。 如Luz-Lima等采用高压拉曼技术在21.5 GPa以内对L-谷氨酸进行原位高压拉曼研究。 他们对拉曼光谱进行分析, 在13.915.2 GPa之间发现一些新峰的出现以及旧峰的消失, 同时CO₂摇摆振动峰出现分裂等现象, 由此可以推测L-谷氨酸在13.915.2 GPa之间发生结构相变, 该结构性相变可能与分子重排有关^[12]。 因此, 在10 GPa以上研究L-丝氨酸结构相变具有一定的实验意义。

为了探索L-丝氨酸晶体在更高压力范围下的结构变化情况, 本文在常温下采用原位高压拉曼技术, 在22.6 GPa以内对L-丝氨酸晶体进行了原位高压拉曼研究, 为后续其他氨基酸的结构相变及蛋白的高压折叠与变性研究提供参考。

实验在四川大学原子与分子所极端条件光谱平台上完成。 实验采用的L-丝氨酸晶体购于上海伯奥生物科技有限公司, 纯度为98%; 实验中采用的光谱平台为532 nm固态激光器(RGB lasersytem NovaPro, 300 mW), 光谱检测CCD(Andor Newton DU970P-UVB), 并配有1 800 g· mm^-1光栅的单色光谱(Andor Shamrock SR-303i-B), 系统空间分辨率达到1 μ m。 实验前使用单晶硅520 cm^-1拉曼峰校准系统, 光谱精确度为0.1 cm^-1。 实验采用金刚石对顶砧(DAC)砧面为300 μ m的金刚石, T301不锈钢片作为高压密封垫, 预压到50 μ m厚度, 在中心位置钻一个直径为100 μ m的孔作为样品腔。

本实验采用红宝石荧光压标测压, 实验数据采用Labspec, Peakfit以及origin等软件处理。

表1为L-丝氨酸晶体的拉曼振动峰指认表, 该表主要是在之前学者对L-丝氨酸晶体的拉曼光谱研究的基础上进行总结的^[15]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 L-丝氨酸晶体拉曼振动峰指认表 Table 1 L-serine Raman characteristic peak assignment table 基团振动类型 拉曼特征峰位置/cm-1 CCN弯曲振动 260 CCC弯曲振动 300 NCC弯曲振动 363 CO2摇摆振动 515 CO2弯曲振动 611 C— C伸缩振动 815 C— C伸缩振动 855 C— C伸缩振动 925 CH2摇摆振动 970 C— N伸缩振动 1 010 C— O伸缩振动 1 090 NH3反对称摇摆振动 1 133 HO弯曲振动 1 228 CO2对称伸缩振动 1 414 CH2弯曲振动 1 462 NH3反对称弯曲振动 1 599 NH3反对称弯曲振动 1 628 CH2对称伸缩振动 2 956 CH2反对称伸缩振动 2 994

表1 L-丝氨酸晶体拉曼振动峰指认表 Table 1 L-serine Raman characteristic peak assignment table

L-丝氨酸晶体分别在12, 34, 5.3以及7.8 GPa等压力处发生结构相变^{[7, 11]}。 通过本次实验, 我们发现, 在2.7 GPa时位于102 cm^-1[图1(a)中1所示]处出现新峰, 位于1 123 cm^-1(NH₃反对称摇摆振动)处的特征峰出现劈裂, 位于1 138 cm^-1处出现新峰[如图1(b)中2所示]; 同时在0.12.7 GPa之间, 2 8003 100 cm^-1之间的拉曼振动峰发生蓝移现象, 但是在2.73.2 GPa范围内, 随着压力的升高这些振动峰都发生了红移现象; 该波数范围对L-丝氨酸结构变化非常敏感。 当压力达到5.4 GPa时, L-丝氨酸晶体在574 cm^-1处出现新峰[如图1(b)中3所示], 同时原来164 cm^-1处峰消失[图1(a)]。 当压力达到7.9 GPa时, 在外模振动模式[图1(a)]中发现, 分别在145和151 cm^-1处出现新峰[如图2(a)中4和5所示], 其中151 cm^-1处新峰是由159 cm^-1处旧峰劈裂出来的峰。 在2501 300 cm^-1光谱范围[图1(b)]内, 我们发现, CO₂摇摆振动峰的肩峰531 cm^-1消失。 在2 8003 100 cm^-1范围[图1(d)]内在2 946 cm^-1处出现新峰[如图1(d)中6所示]。 后续我们分别在1.37, 2.2, 5.3和7.46 GPa等压力点处做了补充实验, 并通过分析拉曼光谱波数随压力变化关系(图4)发现, 分别在1.37, 2.2, 5.3以及7.46 GPa等压力点前后两部分拉曼波数变化明显不连续。 由此推测, L-丝氨酸晶体分别在0.11.37, 2.22.7, 5.3, 7.467.9 GPa等压力区间发生结构相变, 这一实验结果与文献[7, 11]等所提的实验结果一致。

图1

Fig.1

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	图1 L-丝氨酸在0.110.1 GPa之间的拉曼光谱图 (a): 波数范围为35250 cm-1; (b): 波数范围为2501 300 cm-1; (c): 波数范围为1 4001 700 cm-1; (d): 波数范围为2 8003 100 cm-1Fig.1 Raman spectra of L-Serine between 0.1 and 10.1 GPa (a): Wavenumber between 35 and 250 cm-1; (b): Wavenumber between 250 and 1 300 cm-1; (c): Wavenumber between 1 400 and 1 700 cm-1; (d): Wavenumber between 2 800 and 3 100 cm-1

图2

Fig.2

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	图2 L-丝氨酸晶体在6.0 GPa处发生结构变化示意图Fig.2 Schematic diagram of the structure change of L-serine crystal at 6.0 GPa

图4

Fig.4

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	图4 L-丝氨酸在11.022.6 GPa之间的拉曼光谱图 (a): 波数范围为35250 cm-1; (b): 波数范围为2501 300 cm-1; (c): 波数范围为1 4001 700 cm-1; (d): 波数范围为2 8003 100 cm-1Fig.4 Raman spectra of L-Serine between 11.0 and 22.6 GPa (a): Wavenumcer between 35 and 250 cm-1; (b): Wavenumber between 250 and 1 300 cm-1; (c): Wavenumber between 1 400 and 1 700 cm-1; (d): Wavenumber between 2 800 and 3 100 cm-1

当压力达到6.0 GPa时, 我们发现以下现象: (1)在L-丝氨酸晶体外模振动模式[图1(a)]中, 我们发现在66 cm^-1处峰的宽度窄, 位于226 cm^-1处出现新峰[如图1(a)中7所示]; (2) 在2 8003 100 cm^-1波数范围[图1(d)]内发现在2 968 cm^-1处发现新峰[如图1(d)中8所示], 同时CH₂对称伸缩振动峰强度急速减弱; (3) 拉曼光谱波数在2501 300 cm^-1范围[图1(b)]内, 877 cm^-1处的L-丝氨酸晶体的CC伸缩振动峰发生劈裂, 产生894 cm^-1新峰[如图1(b)中9所示], 同时在770 cm^-1(CO₂面内弯曲振动)和456 cm^-1(骨架振动)等处出现新峰[如图1(b)中10和11所示]。 以上现象均表明L-丝氨酸晶体在6.0 GPa处发生结构相变。

同时我们发现在5.46.0 GPa之间, CO₂摇摆振动峰、 CO₂弯曲振动峰、 CH₂反对称摇摆振动峰以及CO₂对称伸缩峰等振动峰强度急速减弱。 同时CO伸缩振动峰、 NH₃反对称摇摆振动峰以及CH₂弯曲振动峰等峰强度增强, 由此推测L-丝氨酸在6.0 GPa处发生了分子重排导致氢键重排, 引起了分子结构相变(如图2所示)。

当压力在10.111.0 GPa范围内, 在拉曼光谱图中, 我们发现所有振动峰强度随着压力的增加而急速减弱。 当压力达到11.0 GPa时, 在35250 cm^-1之间[图4(a)], 位于249 cm^-1处的振动峰开始劈叉, 在241 cm^-1处形成新峰[如图4(a)中12所示]。 在2501 300 cm^-1[图4(b)]拉曼波数范围内, 原位于391和431 cm^-1处的峰消失。 在2 9003 100 cm^-1[图4(d)]拉曼波数范围内, 我们发现, 当压力达到11.0 GPa时, 位于2 979 cm^-1的CH₂对称伸缩振动峰发生劈叉, 在2 956 cm^-1出现新峰[如图4(d)中13所示]。

同时, 在波数随压力变化关系中(图5), 我们发现在11.0 GPa前后拉曼波数变化明显不连续, 因此L-丝氨酸晶体在10.111.0 GPa之间发生结构相变; 该结构相变可能与分子的晶格振动变化产生了新的氢键有关。

图3

Fig.3

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	图3 L-丝氨酸晶体在10.111.0 GPa 之间发生结构变化示意图Fig.3 Schematic diagram of the structural changes of L-serine crystals between 10.1 and 11.0 GPa

图5

Fig.5

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	图5 拉曼波数随压力变化关系图 (a): 波数范围为0600 cm-1; (b): 波数范围为6001 200 cm-1; (c): 波数范围为1 2001 500 cm-1; (d): 波数范围为2 9003 100 cm-1Fig.5 Observed wavenumbers versus pressure in the spectra of monoclinic L-Serine (a): Wavenumber between 0 and 600 cm-1; (b): Wavenumber between 600 and 1 200 cm-1; (c): Wavenumber between 1 200 and 1 500 cm-1; (c): Wavenumber between 2 900 and 3 100 cm-1

随着压力的升高, 拉曼波峰的信噪比降低, 导致一些基团振动出峰不明显。 在15.517.5 GPa之间, 随着压力的升高, 我们发现所有的特征峰强度减弱, 并且都向高波数方向移动。 当压力达到17.5 GPa时, 在35250 cm^-1范围[图4(a)]内, 在200 cm^-1处出现新峰[如图4(a)中14所示]。 由于信噪比降低, 导致一些不属于L-丝氨酸晶体振动峰的出现, 因此无法在拉曼光谱中找到一些新的证据证明其发生结构相变。 进一步分析拉曼波数与压力的变化关系时发现, 在17.5 GPa处明显出现拐点, 因此, 在15.517.5 GPa压力区间可能发生结构相变。

采用金刚石对顶砧结合拉曼光谱装置, 在常温下对L-丝氨酸晶体进行原位高压拉曼光研究, 压力达到22.6 GPa。 实验结果表明: L-丝氨酸晶体分别在0.11.37 GPa之间、 2.22.7 GPa之间、 5.3, 6.0, 7.467.9 GPa之间、 10.111.0 GPa之间以及15.517.5 GPa处发生结构相变。 其中L-丝氨酸晶体在6.0 GPa处发生结构相变可能与分子间结构重排导致氢键重排有关, 在10.111.0 GPa之间发生结构相变可能与L-丝氨酸晶体的晶格振动变化产生新的氢键有关。