癫痫是影响所有年龄段的慢性脑功能障碍。 世界卫生组织的统计结果表明: 人群中患有癫痫的比例在4‰ ~10‰ 。 癫痫是一种由多病因所致的发作性疾病, 癫痫发生的主要特征为整个或局部脑区神经元异常同步化高频群集动作电位发放, 临床主要表现为肢体的强直痉挛^{[1, 2]}。 近年来, 虽然精确的临床诊断技术不断提高, 对抗癫痫药的临床使用进行密集监控新的抗癫痫药不断地投入临床应用的情况下, 但仍有至少30%的癫痫病人的发作不能有效控制, 发展成为难治性或慢性癫痫^[3]。

即使目前关于难治性癫痫的相关研究报道很多, 但其确切病理机制尚不明确。 经典的观点认为, 癫痫发生是一个过程, 发生进程分为三个阶段: 急性期: 脑损伤发生; 之后进入潜伏期: 在此阶段时期, 病人不出现癫痫发作; 最后进入慢性癫痫期即: 表现为未受任何刺激的情况下也会产生自发性惊厥发作。 在癫痫急性— 潜伏— 慢性期发展进程中, 发生许多生物学改变包括一系列分子、 细胞、 神经环路水平的变化, 最终出现大脑神经元异常同步化电发放^{[4, 5]}。 揭示癫痫发展进程的生物化学分子变化, 有助于人们进一步了解癫痫的发病机制。

红外光谱可以通过对探测样品中所含化学分子成分的特征性振动模式来确定样品中化学分子空间分布信息和结构组成^[6]。 在进行红外光谱检测时, 将显微镜和傅里叶变换红外光谱仪耦合, 从而在微小尺度进行测量。 在生物科学领域, 红外光谱可以原位检测生物组织细胞中的生物化学分子包括核酸、 脂类、 蛋白质和碳水化合物的含量、 分布, 尤其可以准确分析组织细胞中蛋白质二级结构的改变, 提供不同病理生理条件下细胞或组织中各种生物化学分子的结构、 分布和浓度^{[7, 8, 9, 10]}。 与传统热红外光源相比, 同步辐射光源在中红外光区段比传统红外光源亮100~1 000倍。 同步辐射红外光谱显微成像技术(synchrotron radiation based-Fourier transform infrared microspectroscopy, SR-FTIR)能够在细胞水平对生物组织或细胞中包含的各种生物化学分子的代谢状态进行分析。 例如SR-FTIR显示阿尔兹海默氏症特征性病理改变老年斑中蛋白质构象β -sheet含量上升^[8]。 本文通过将化学致癫药物海人藻酸(kainic acid, KA)立体定位注射入大鼠海马, 诱导大鼠发生癫痫持续状态, 建立癫痫大鼠模型。 对癫痫大鼠海马CA1区神经元进行同步辐射红外显微光谱测量和同步辐射显微光谱成像, 初步研究癫痫发生初期海马神经元是否存在胞内生化分子的分布和代谢改变。

单侧海马注射致癫剂海人藻酸(kainic acid, KA)会导致大鼠注射侧大脑呈现同步化群集高频放电, 高兴奋性的神经元细胞内生物化学分子的结构、 浓度、 定位可能会出现变化。 图1(a)为KA注射癫痫大鼠和正常对照大鼠海马切片在可见光显微镜下的形态图。 图1(b)显示KA注射癫痫大鼠和正常对照大鼠的大脑海马CA1区神经元的同步辐射显微红外吸收光谱, 红外光斑面积大约可以覆盖单个神经元胞体。 图1(b)中红外光谱特征吸收峰所属功能基团振动模式指认见表1。 在表1中, 属于脂质基团的吸收区域集中在红外3 000~2 800和1 750~1 720 cm^-1区段, 对这些区段的显微光谱进行分析能够判断脂类功能集团的浓度^{[7, 11]}。 分析结果显示癫痫大鼠KA注射侧海马神经元胞体在属于CH₂反对称拉伸振动的2 930 cm^-1的积分吸收面积比正常大鼠海马神经元样增加了约9%。 位于1 655 cm^-1附近的酰胺Ⅰ 和位于1 545 cm^-1附近的酰胺Ⅱ 是构成蛋白质的主要成分, 其中位于1 655 cm^-1附近的酰胺Ⅰ 对蛋白质的二级结构变化较敏感, 主要包含CO的拉伸振动, CN拉伸振动以及NH弯曲振动(图1, 表1)^{[12, 13]}。 为进一步明晰酰胺Ⅰ 的光谱结构, 我们对1 655 cm^-1的光谱区段进行了二级导数分析(图2)。 相对于正常大鼠海马样品, 癫痫大鼠KA注射侧海马神经元胞体的酰胺Ⅰ 在1 653 cm^-1附近多出一个额外的负峰, 提示癫痫大鼠大脑高兴奋性放电活动可能会损伤神经元的蛋白质二级结构。 位于1 236 cm^-1附近的的PO₂反对称拉伸振动和位于1 086 cm^-1附近的PO₂对称拉伸振动能够反映核酸的浓度。 对红外显微光谱的分析显示癫痫大鼠KA注射侧海马神经元胞体在位于1 086 cm^-1 PO₂的吸收积分强度较正常大鼠显著下降。

图1

Fig.1

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图1 (a): 正常对照大鼠和癫痫大鼠海马光镜形貌图, 黑色方框区域为红外光斑覆盖区; (b): 正常对照大鼠和癫痫大鼠海马CA1神经元的红外吸收光谱 (a): 正常对照大鼠海马; (b): 癫痫大鼠海马的KA未注射侧; (c): 癫痫大鼠海马的KA注射侧Fig.1 (a): Microphotographs of the CA1 neurons in the hippocampus of epilepsy and control rats; (b): FTIR spectra of the CA1 neurons in the hippocampus of epilepsy and control rats (a): Control hippocampus; (b): KA unlesioned hippocampus in a epilepsy rat; (c): KA lesioned hippocampus in a epilepsy rat

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 图1所示红外吸收光谱的各生化分子集团频率指认 Table 1 The bands frequencies assigned for the IR spectra shown by Fig.1 resource indicated in Fig.1 频率/cm-1 振动模式指认 ~996 CO拉伸振动(碳水化合物) ~1 085 PO2对称拉伸振动(核酸) ~1 170 CO— O— C反对称弯曲振动(脂类) ~1 236 PO2反对称拉伸振动(核酸) ~1 300 酰胺Ⅲ : CN拉伸振动, NH弯曲振动, CO拉伸振动, O=C=N弯曲振动(蛋白质) ~1 380 CH3对称弯曲振动(脂类) ~1 460 CH2剪切振动; CH3反对称弯曲振动(脂类) ~1 545 酰胺Ⅱ : NH弯曲振动, CN拉伸振动(蛋白质) ~1 655 酰胺Ⅰ : CO拉伸振动, CN拉伸振动, NH弯曲振动(蛋白质) 1 750~1 720 C=O拉伸振动(脂类) ~2 850 CH2对称拉伸振动(脂类) ~2 924 CH2反对称拉伸振动(脂类) ~2 960 CH3反对称拉伸振动(脂类) 3 400~3 200 OH拉伸振动(碳水化合物)

表1 图1所示红外吸收光谱的各生化分子集团频率指认 Table 1 The bands frequencies assigned for the IR spectra shown by Fig.1 resource indicated in Fig.1

图2

Fig.2

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	图2 正常对照大鼠和癫痫大鼠海马CA1神经元红外光谱中属于amide I吸收振动频率的二级导数分析 a: 正常对照大鼠海马; b: 癫痫大鼠海马的KA未注射侧; c: 癫痫大鼠海马的KA注射侧Fig.2 The secondary derivative spectra and the absorption spectra for amide Ⅰ for the CA1 neurons in the hippocampus of the control epilepsy rats a: Control hippocampus; b: KA unlesioned hippocampus in a epilepsy rat; c: KA lesioned hippocampus in a epilepsy rat

对于正常对照大鼠和癫痫大鼠海马CA1区神经元的主要生化分子在神经元胞体内的空间分布情况进行定位, 我们做了同步辐射红外光谱显微二维平面成像分析。 构建细胞显微成像的数据采集自代表性海马CA1神经元的红外显微光谱, 代表性海马CA1神经元的光学图像叠加区域见图3。 在对样品进行光栅扫描后, 对主要生化分子功能集团的积分强度进行计算。 图3为正常对照大鼠和癫痫大鼠海马KA未注射侧和KA注射侧CA1区代表性神经元的光学图像和主要生化分子功能集团的红外光谱显微成像图谱。 位于1 055~1 054 cm^-1的PO₂反对称拉伸振动属于核酸吸收区域, 因此主要位于神经元的细胞核区域^[14]。 核酸如DNA也是胞内线粒体基因组的主要组成成分, 因此位于1 055~1 054 cm^-1的振动频率也许反映出细胞核或线粒体内的核酸在神经元内的空间定位。 如图3显示在正常对照和癫痫海马神经元中在1 055~1 054 cm^-1的振动频率最大浓度都位于细胞核和胞体中, 提示在癫痫高兴奋性放电活动发生24 h后神经元核酸分布没有变化。 反映蛋白质二级结构的酰胺Ⅰ 的吸收位于1 655 cm^-1的振动频率附近^{[12, 13]}。 同步辐射红外光谱显微二维平面成像显示1 655 cm^-1的振动频率在正常对照大鼠海马CA1神经元胞体内呈高浓度, 但在癫痫大鼠海马KA未注射侧和KA注射侧CA1神经元胞体内呈低浓度分布, 在细胞核内分布浓度最低, 但在神经元胞体外围区域分布浓度较高。 提示在癫痫大鼠神经元内的蛋白二级结构异常, 这可能是癫痫发生过程中大脑海马神经元的陆续死亡的重要分子基础。 在2 800~3 000 cm^-1区间主要为脂类的CH₂和CH₃拉伸振动。 同步辐射红外光谱显微二维平面成像显示2 800~3 000 cm^-1振动频率在正常对照海马CA1神经元胞体内呈高浓度分布, 在癫痫海马KA未注射侧和KA注射侧CA1神经元呈现胞体内低浓度分布而胞体外区域高浓度分布的趋势。 由于细胞体膜和细胞器膜的主要成分为磷脂, 因此这种癫痫海马神经元的脂类功能集团分布改变可能与癫痫高兴奋性放电造成的细胞体膜和细胞器膜的结构和功能改变有关^[15]。

图3

Fig.3

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	图3 正常对照大鼠和癫痫大鼠海马CA1神经元同步辐射红外显微光谱生化集团图像Fig.3 Synchrotron radiation Fourier transform infrared microsectroscopic maps of the CA1 neurons in the hippocampus of the control and epilepsy rats

同步辐射红外显微光谱检测和同步辐射红外显微成像初步研究癫痫大鼠海马CA1区神经元生物化学成分的结构和细胞内定位特异性变化。 实验结果显示相对于正常海马神经元, 癫痫大鼠神经元的蛋白质二级结构和脂类功能集团在胞内的分布出现改变, 表现为反应蛋白质二级结构的酰胺Ⅰ 和脂质在癫痫大鼠神经元胞体内呈低浓度分布, 但在神经元胞体周围分布相对较高。 表明癫痫大鼠高兴奋癫痫放电活动会改变神经元生物化学成分的结构和分布, 从而导致神经元损伤, 并且这些生化分子的改变早于细胞形态的改变。