FLS900型多功能型光谱仪(Edinburgh Instruments), 激发光光源为氙灯, 波长为289 nm, 发射光谱扫描范围为310~550 nm。 摇床(米欧, GS-20), 离心机(赛洛捷克)。

大肠杆菌(固体, ATCC25922标准菌株, 5 ℃保存), LB液体培养基[干粉, Tryptone(胰蛋白胨)], 柠檬酸钠(分析纯), 硝酸银(分析纯), 生理盐水, 和去离子水。

将0.02 g柠檬酸钠溶解于2 mL去离子水中, 待用。 将0.018 g硝酸银溶解于100 mL去离子水中, 加热至90 ℃后, 逐滴滴入已配好的柠檬酸钠溶液, 保持90 ℃, 30 min后冷却至室温, 得到均匀分布的、 平均半径约为28 nm的银纳米颗粒。

(1)一代大肠杆菌溶液配制: 在无菌环境中将0.024 g大肠杆菌菌种接种至2 mL配制好的无菌培养液中, 37 ℃环境下, 用摇床(120 r· min^-1)震荡培养24 h, 然后放入离心机, 2 000 r· min^-1离心10 min, 用无菌吸管吸除上层液体, 得到一代大肠杆菌溶液。

(2)二代大肠杆菌溶液配制: 将500 μ L一代大肠杆菌溶液, 加入50 mL无菌培养液中, 37 ℃环境下, 用摇床(120 r· min^-1)震荡培养24 h, 得到二代大肠杆菌溶液。 取2 mL二代大肠杆菌溶液放入到4 mL离心管中, 在离心机中2 000 r· min^-1离心10 min, 无菌吸管吸除上层液体, 加入4 mL生理盐水, 重复3次, 即制成所需的大肠杆菌溶液。

用289 nm的激发光照射配好的大肠杆菌溶液, 得到大肠杆菌的荧光光谱, 如图1所示。 从图中可以看出332 nm附近有一个非常宽的强发射峰, 425 nm附近有一个非常弱的发射峰。 通过查阅文献得知332 nm附近处的发射峰是由蛋白质中氨基酸的酪氨酸和色氨酸相互叠加产生的, 425 nm附近的发射峰是由核酸和NADH叠加产生的^[12]。

图1

Fig.1

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	图1 大肠杆菌荧光发射光谱Fig.1 Fluorescence emission spectra of E. coli

为了更好的研究大肠杆菌浓度与荧光发射强度之间的关系, 实验得到了11个不同浓度的大肠杆菌溶液的荧光光谱, 荧光光谱的形状与图1相似, 但峰值略有不同。 图2给出了332和425 nm处荧光特征峰的强度随大肠杆菌浓度变化的关系, 其中, (a)为332 nm的荧光特征峰强度随大肠杆菌浓度变化的关系, (b)为425 nm的荧光特征峰随大肠杆菌浓度变化的关系。 从图中可以看出, 随大肠杆菌浓度的增加, 332和425 nm处特征峰的强度也随之增大。

图2

Fig.2

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	图2 大肠杆菌浓度与荧光特征峰强度的关系 (a): 332 nm; (b): 425 nmFig.2 Relationship between concentration of E. coli and fluorescence intensity (a): 332 nm; (b): 425 nm

利用软件ORIGIN8.5对图2中的数据进行拟合, 得到大肠杆菌浓度和荧光强度间的关系曲线, 如图3所示。 图3(a)为大肠杆菌浓度在1%~100%之间变化时, 332 nm荧光特征峰强度随大肠杆菌浓度变化的曲线, 拟合公式为: y=20 709.33+15 107.26x-73.04x², 相关系数r=0.996 94。 从拟合公式可以看出, 当大肠杆菌浓度较低时, 大肠杆菌的特征峰强度与浓度呈线性关系。 任取大肠杆菌的浓度为10%, 此时, x=10, y=20 709.33+151 072.6-7 304, 由此可见, 73.04x²对(a)的拟合公式的影响可以忽略不计。 当大肠杆菌浓度较高时, 大肠杆菌的特征峰强度与浓度呈非线性关系。 任取大肠杆菌的浓度为60%, 此时x=60, y=20 709.33+906 435.6-262 944, 此时73.04x²的数值不可忽略不计。 当大肠杆菌浓度在1%~20%区间变化时, 332 nm荧光特征峰强度随大肠杆菌浓度变化的曲线拟合公式可写为: y=11 430.92+15 726.03x, 相关系数r=0.995 09, 拟合公式所对应的曲线如图3(a)中的插图所示, 表明大肠杆菌浓度在1%~20%区间变化时, 大肠杆菌的特征峰强度与浓度呈线性关系。 图3(b)为大肠杆菌浓度在1%~100%之间变化时, 425 nm荧光特征峰强度随大肠杆菌浓度变化的曲线, 拟合公式为: y=4 766.41+1 484.09x, 相关系数r=0.993 73。 可以看出, 425 nm处峰值与大肠杆菌浓度整体呈线性关系。

根据朗伯-比耳吸收定律

Ia=I0(1-10-εlc)(1)

式中, I_a为吸收的光量, ε 为摩尔吸光系数, l为液池的厚度, c为样品的摩尔浓度。 得出荧光发射强度I_f与入射光强度I₀及荧光量子产率Φ 的关系

If=IaΦ=ΦI0(1-10-εlc)=ΦI0(1-e-2.303εlc)(2)

可知: 当荧光物质含量较低时, 荧光强度与物质的浓度成正比。 大肠杆菌浓度的大小与溶液中大肠杆菌活体的数量有关, 当大肠杆菌浓度较低时, 大肠杆菌溶液总的荧光强度可以看成由溶液中每个大肠杆菌个体发出的荧光叠加而成, 因此, 20%浓度以下大肠杆菌在332 nm处特征峰强度和425 nm处特征峰强度与大肠杆菌活体数量呈线性关系。 当大肠杆菌浓度增加到一定值以后, 即使大肠杆菌浓度继续增加, 在光斑照射范围以外的大肠杆菌无法直接接收光的照射, 且332 nm处的荧光特征峰是蛋白质中的氨基酸发射的, 蛋白质在细胞中含量较多, 荧光发射谱可能会受到大肠杆菌内蛋白质以外的其他物质的影响, 因此, 荧光强度与浓度间不再呈线性关系。 而发射425 nm荧光特征峰的是辅酶和酶类物质, 在细胞中存在的量很少, 荧光强度较弱, 当大肠杆菌浓度增加时, 荧光强度也随之增加, 但整体强度较低。

图3

Fig.3

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	图3 荧光特征峰强度随大肠杆菌浓度变化的拟合曲线, (a) 332 nm, 插图为大肠杆菌浓度小于20%时, 332nm处峰值强度与大肠杆菌浓度的关系, (b) 425 nmFig.3 Fitting curve of fluorescence spectrum peak intensity changing with E. coli concentration; (a) Peak intensity at 332nm, and the illustration is the relationship between the peak intensity at 332nm and the E. coli concentration when the E. coli concentration is less than 20%; (b) Peak intensity at 425 nm

2.2.1 时间对银纳米颗粒灭菌的影响

取1 mL配制好的大肠杆菌溶液, 加入3 mL生理盐水, 确保大肠杆菌浓度低于20%。 记样品1, 作为空白对照组。 取1 mL配制好的大肠杆菌溶液, 加入2.5 mL生理盐水和0.5 mL银纳米颗粒溶液, 记样品2。

样品1和样品2各配制6份, 放置在37℃环境中, 每间隔1h测量一份样品1和样品2在310~550 nm范围内的荧光光谱。 两种样品中的大肠杆菌荧光光谱的形状与图1相似, 但峰值略有不同, 如图4所示。

图4

Fig.4

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	图4 (a)未加入银纳米颗粒的大肠杆菌荧光光谱; (b)加入银纳米颗粒的大肠杆菌荧光光谱Fig.4 (a) Fluorescence spectra of E. coli without silver nanoparticles; (b) Fluorescence spectra of E. coli with silver nanoparticles

从图4(a)可以看出, 随着时间的延长, 332和425 nm处特征峰的强度变化不大。 从图4(b)可以看出, 加入银纳米颗粒后, 大肠杆菌在332 nm处的荧光特征峰强度随着时间的延长而逐渐降低, 而425 nm处特征峰的强度变化不大。

在图4(b)所给出的荧光光谱中, 溶液中不仅含有大肠杆菌, 而且含有一定量的银纳米颗粒, 因此, 有必要在图4(b)中去除银纳米颗粒的荧光光谱。 银纳米颗粒溶液的荧光光谱图如图5所示。 从图中可以看出, 银纳米颗粒溶液在321和425 nm处有发射峰, 将影响大肠杆菌在332和425 nm处特征峰的强度。 因此, 加入银纳米颗粒的大肠杆菌真实的荧光光谱I, 应该用加入银纳米颗粒的大肠杆菌的荧光强度I₀, 减去银纳米颗粒的荧光强度I_n, 即 (I=I₀-I_n)。

图5

Fig.5

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	图5 银纳米颗粒溶液的荧光光谱图Fig.5 Fluorescence spectra of silver nanoparticles solution

因为大肠杆菌浓度较低时, 其荧光特征峰的强度和大肠杆菌的浓度成正比, 因此, 可以用特征峰的强度表征大肠杆菌的浓度, 进而计算银纳米颗粒的灭菌率(%)=(I_e-I)/I_e, 其中I_e为大肠杆菌荧光强度, I为加入银纳米颗粒后大肠杆菌真实荧光强度。 图6给出了332和425 nm特征峰对应的银纳米颗粒的灭菌率随时间的变化, 从图6中可以看出: 银纳米颗粒溶液与大肠杆菌反应4 h内, 灭菌率与反应时间成正比; 4~6 h内, 灭菌率趋于平稳, 不再增长。 灭菌过程中大肠杆菌332 nm处的特征峰的强度变化比425 nm处的要大, 说明银纳米颗粒主要破坏蛋白质中的氨基酸, 而对核酸和NADH的破坏作用较小。

图6

Fig.6

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	图6 银纳米颗粒的灭菌率随时间的变化Fig.6 The relationship between sterilization rate of silver nanoparticle and time

2.2.2 银纳米颗粒浓度及温度对灭菌的影响

取1 mL配制好的大肠杆菌溶液, 分别加入0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3 mL银纳米颗粒溶液, 和3, 2.5, 2., 1.5, 1, 0.5, 0 mL生理盐水, 配制方法如表1所示, 得到不同浓度的银纳米颗粒溶液, 其中样品1是空白对照组。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同浓度银纳米颗粒溶液实验样品配制表 Table 1 Sample preparation table with different concentrations of silver nanoparticles 样品编号 大肠杆菌 溶液/mL 生理盐水 /mL 银纳米颗粒 溶液/mL 样品总量 /mL 1 1 3 0 4 2 1 2.5 0.5 4 3 1 2 1 4 4 1 1.5 1.5 4 5 1 1 2 4 6 1 0 3 4

表1 不同浓度银纳米颗粒溶液实验样品配制表 Table 1 Sample preparation table with different concentrations of silver nanoparticles

参照表1配制实验样品, 每个样品配制3份, 分别放置在20, 30和37 ℃环境下反应4 h, 然后按照样品编号逐一测量其在310~550 nm范围内的荧光光谱。 用332 nm处特征峰强度表征相应浓度的大肠杆菌, 灭菌率随银纳米颗粒加入量的变化关系如图7所示。 从图7 中可以看出, 银纳米颗粒的加入量及银纳米颗粒与大肠杆菌相互作用时的温度都对灭菌率有影响。 即随银纳米颗粒溶液加入量的增加, 灭菌效果也随之增大; 温度越高, 银纳米颗粒的灭菌率越大, 本实验中灭菌效果最好的是37 ℃。

图7

Fig.7

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	图7 不同温度下大肠杆菌的灭菌率随银纳米颗粒加入量的变化关系Fig.7 The relationship between the sterilization rate of E. coli and the amount of silver nanoparticles at different temperature

生物体内有很多酶, 这些酶是功能型蛋白质, 参与细胞生命代谢活动, 催化细胞体内的各种生化反应, 是活细胞生命活动的必需物质。 有研究表明, 酶的活性与直接相关的氨基酸有关, 这些氨基酸被称为酶的活性中心。 酶活性中心实现催化作用的必需氨基酸基团, 主要包括: 羟基、 巯基、 咪唑基、 酚羟基、 氨基。 若通过化学修饰改变这些基团, 则酶活性丧失, 这将影响细胞正常生命活动, 致使细胞死亡。

银纳米颗粒遇到大肠杆菌后, 能吸附在细胞壁表面, 甚至穿过大肠杆菌细胞壁进入菌体, 与体内蛋白酶中半胱氨酸的巯基中的S离子结合, 使得巯基中的H离子游离出去, 改变了半胱氨酸的结构, 破坏了蛋白酶必需活性基团, 致使蛋白酶丧失活性, 从而使大肠杆菌的呼吸代谢被阻断, 最终窒息死亡。 在这个过程中, 引起了整个蛋白质的构象变化, 从而引起色氨酸、 酪氨酸的荧光光谱降低。