RF-5301PC型荧光光度计, Hitachi F-4600荧光光谱仪; JASCO-810圆二色光谱仪, FL3-P-TCSPC时间分辨荧光仪。

BDE47和鸡蛋清溶菌酶(分别购于美国AccuStandard、 Sigma公司), pH 7.40的Tris-HCl缓冲溶液(含0.15 mol· L^-1 NaCl), 其他试剂为分析纯, 实验用水为二次蒸馏水。

用pH 7.40的Tris-HCl缓冲液配制浓度为5.0× 10^-4 mol· L^-1的溶菌酶贮备液和1.0× 10^-6 mol· L^-1的BDE47贮备液, 并置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.1 计算模拟

溶菌酶的晶体结构(1aki.pdb, 1.5 Å )从Brookhaven蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)获得。 首先, 对溶菌酶进行除水、 加氢、 加电荷等前处理, 利用AutoDock 4.2将BDE47对接进入溶菌酶分子的活性口袋中。

将对接后的蛋白和小分子导入GROMACS 4.6.5程序中, 采用正则系统(NVT)和等温等压系统(NPT)平衡体系, 并进行50 ns的分子动力学模拟。 然后, 用分子力学泊松玻尔兹曼表面积(MM-PBSA)方法计算分析溶菌酶与BDE47之间的结合自由能^{[14, 15]}。

1.2.2 光谱法

荧光光谱: 在291, 298, 306和310 K 4个温度下, 以280 nm为激发波长, 激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm, 测定溶菌酶-BDE47体系在290~450 nm范围内的荧光光谱。

三维荧光: 激发波长和发射波长均设为200~500 nm, 步长和狭缝分别为5和2.5 nm, 测定溶菌酶与溶菌酶-BDE47体系的三维荧光光谱。

时间分辨荧光: 激发和发射波长分别为280和346 nm, 激发和发射狭缝均为6 nm, 计数峰值counts为4 000, 记录溶菌酶荧光寿命的变化。

圆二色谱: 用Tris-HCl缓冲液做基线校正, 扫描速度为200 nm· min^-1, 响应时间为2 s, 在波长为190~260 nm范围内扫描样品液的圆二色谱。

利用分子对接软件AutoDock 4.2将小分子BDE47对接进入溶菌酶的活性口袋, 得到10种构象。 10种构象的对接结果均表明, 溶菌酶与BDE47结合的主要作用力为范德华力和氢键, 而静电作用能非常小, 可忽略不计。 选取结合自由能较低的一种构象进行分析, 如图1。 溶菌酶中与BDE47发生相互作用的氨基酸残基有: TRP62, TRP63, ARG61, ASN59, ALA107, ILE98和ILE58等, 其中, TRP62和TRP63距离BDE47非常近, 相互作用较强。 另外, 可以观察到BDE47与色氨酸(TRP62)的苯环、 吲哚环部分基本平行, 存在着错位面对面堆积作用(即F型堆积作用); BDE47分子中的醚键O原子与TRP63形成氢键, 氢键距离为2.2 Å 。 氢键的形成和F型堆积作用在一定程度上对BDE47与溶菌酶结合起到了稳定的作用, 结合位点更靠近TRP62和TRP63。

图1

Fig.1

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	图1 溶菌酶与BDE47的分子对接Fig.1 Molecular docking between lysozyme and BDE47

50 ns的动力学模拟结束后, 选取平衡后30~50 ns的模拟轨迹对溶菌酶与BDE47之间的结合自由能进行分析, 结果如图2。 用MM-PBSA方法计算得到的结合自由能为-27.10 kJ· mol^-1。 体系的范德华相互作用能Δ G_vdW为负(-36.81 kJ· mol^-1), 且绝对值比其他能量项大很多, 表明Δ G_vdW有利于溶菌酶与BDE47的结合作用, 范德华作用为主要驱动力。 体系的静电相互作用能Δ G_elect虽然也利于两者的结合, 但非常弱, 极性的静电溶剂化能很大程度上抵消了这种趋势(体系的极性化能高达15.22 kJ· mol^-1), 这表明极性溶剂化自由能对结合是极为不利的^[16]。

图2

Fig.2

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	图2 BDE47与溶菌酶之间的结合自由能Fig.2 Binding free energies of BDE47-lysozyme complex

2.3.1 三维荧光

蛋白质一般含有色氨酸、 酪氨酸、 苯丙氨酸这三种芳香氨基酸, 因此能发射荧光。 常用三维荧光来分析药物小分子对溶菌酶的构象和微环境的影响。 图3中, 加入BDE47后, 体系的瑞利散射峰(λ _ex=λ _em)增强, 这可能是由于溶菌酶与BDE47生成复合物, 导致溶液中溶质粒径增大, 散射效应增强^[17]。 峰1是色氨酸、 酪氨酸等残基的特征峰, BDE47的加入使溶菌酶的荧光强度降低, 色氨酸的微环境发生改变。 峰2是溶菌酶多肽骨架的特征峰, 加入BDE47后, 峰2的强度降低, 并且其发射波长发生略微红移(5 nm), 这表明BDE47的存在导致了溶菌酶的构象发生改变^[18]。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 溶菌酶(a)与溶菌酶-BDE47(b)体系的三维荧光光谱Fig.3 Three-dimensional fluorescence spectra of lysozyme (a) and lysozyme-BDE47 (b) systems clysozyme=2.0× 10-6 mol· L-1, cBDE47=5.0× 10-7 mol· L-1

2.3.2 圆二色谱

为了进一步验证溶菌酶的构象发生变化, 采用圆二色谱对溶菌酶的二级结构含量进行定量分析。 溶菌酶的圆二色谱在208和222 nm附近有两个负峰, 这是α -螺旋的光谱特征^[9]。 如图4, 加入BDE47后, 谱图中负峰的强度减弱。 根据式(1)和式(2)^[19]计算溶菌酶中α -螺旋的含量, 结果显示, 蛋白的α -螺旋含量从35.8%减少到33.1%和31.6%, 这表明BDE47与溶菌酶的相互作用改变了溶菌酶的二级结构, 导致其α -螺旋含量减少。

MRE=CD(mdeg)cpnl×10(1)α⁃helix(%)=-MRE208-400033000-4000×100%(2)

式中, c_p为蛋白质的摩尔浓度, n为氨基酸残基数(溶菌酶为129), l为样品池的厚度(0.1 cm); MRE₂₀₈是蛋白质在208 nm处的平均残基椭圆率(deg· cm²· dmol^-1), 4 000是螺旋和无规则卷曲在208 nm处的平均残基椭圆率, 33 000是纯螺旋结构在208 nm处的平均残基椭圆率。

图4

Fig.4

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	图4 溶菌酶与溶菌酶-BDE47体系的圆二色谱Fig.4 Circular dichroism spectra of lysozyme in the absence and presence of BDE47

2.4.1 溶菌酶的荧光猝灭机制

溶菌酶分子中含有6个色氨酸残基, 其中TRP62和TRP108是溶菌酶主要的荧光苯团之一, 最大荧光发射波长分别为352和342 nm。 如图5, 随着BDE47的加入, 溶菌酶的荧光强度逐渐降低, 但峰型基本保持不变, 表明BDE47与溶菌酶发生了相互作用, 改变了TRP62附近的微环境, 导致荧光猝灭。

图5

Fig.5

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	图5 306 K时BDE47对溶菌酶的荧光猝灭光谱图Fig.5 Fluorescence quenching spectra of lysozyme in presence of BDE47 at 306 K clysozyme=4.0× 10-6 mol· L-1; cBDE-47(a— g): 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 (× 10-8 mol· L-1), respectively

蛋白质的荧光猝灭通常有动态猝灭、 静态猝灭及非辐射能量转移三种。 而时间分辨荧光是区分动态猝灭和静态猝灭最准确的方法。 静态猝灭过程中, 猝灭剂的加入, 荧光分子激发态等寿命并不会改变; 而在动态猝灭中, 猝灭剂的存在可引起溶菌酶荧光寿命的缩短^[20]。 图6为加入BDE47前后溶菌酶的荧光寿命衰减曲线, 双指数拟合结果列于表1。 加入BDE47后, 溶菌酶的平均寿命由1.72 s变到1.77和1.78 s, 荧光寿命有微小的增加, 表明溶菌酶与BDE47发生相互作用, 改变了溶菌酶TRP的微环境。 但变化不大, 由此可认为BDE47对溶菌酶的荧光猝灭是一个静态猝灭过程。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 加入BDE47后溶菌酶的荧光寿命变化 Table 1 Fluorescence lifetime of lysozyme as a function of concentration of BDE47 Samples τ 1 /ns τ 2 /ns A1 A2 τ /ns χ 2 溶菌酶 0.88 3.53 68.28 31.72 1.72 1.29 溶菌酶+BDE47 (8:1) 1.55 3.80 89.89 10.11 1.77 1.38 溶菌酶+BDE47 (4:1) 1.56 3.84 90.38 9.62 1.78 1.19

表1 加入BDE47后溶菌酶的荧光寿命变化 Table 1 Fluorescence lifetime of lysozyme as a function of concentration of BDE47

图6

Fig.6

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	图6 溶菌酶的荧光寿命衰减曲线Fig.6 The time-resolved fluorescence decay of lysozyme in the absence and presence of BDE47 clysozyme=2.0× 10-6 mol· L-1, cBDE47=0 (Red), 0.25× 10-6 mol· L-1 (Blue), 0.5× 10-6 mol· L-1 (Magenta). The sharp pattern on the left (Black) is the lamp profile

2.4.2 溶菌酶与BDE47的结合距离

小分子与溶菌酶相互作用的结合距离可根据Fö ster偶极-偶极非辐射能量转移理论计算^[10]。 图7为溶菌酶的荧光光谱与BDE47的紫外吸收光谱的重叠图谱。

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ(3)E=1-F/F0=R06/(R06+r6)(4)R06=8.79×10-25K2N-4ΦJ(5)

式(3)— 式(5)中K²=2/3; N=1.36为介质折射指数; Φ =0.15为给体的荧光量子产率; J为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分, R₀是转移效率为50%时的临界距离; r为给体与受体的结合距离。

图7

Fig.7

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	图7 溶菌酶荧光光谱和BDE47吸收光谱的重叠图Fig.7 The overlap of lysozyme fluorescence and BDE47 absorbance spectra clysozyme=cBDE47=5.0× 10-7 mol· L-1

根据式(3)— 式(5)计算得出, 两光谱重叠区的重叠积分J=5.12× 10^-14 cm³· L· mol^-1, 能量转移效率E=0.13, R₀和r分别为3.31和4.55 nm。 BDE47与溶菌酶的结合距离r小于7 nm, 且满足0.5R₀< r< 1.5R₀, 符合非辐射能量转移的条件, 表明非辐射能量转移是导致溶菌酶荧光猝灭的另一个原因。 此外, MD的计算结果显示, BDE47与TRP62之间的距离为2.03 nm, 小于7 nm, 与能量转移结论一致。

2.4.3 溶菌酶与BDE47结合的作用力类型

小分子-受体相互作用力的类型包括范德华力、 疏水作用力、 静电引力和氢键等。 根据Ross和Subramanian理论^[21], 由热力学参数可判断其结合作用力类型。 由实验计算得出的自由能值与上述计算模拟获得的结合自由能(-27.10 kJ· mol^-1)吻合良好。 由表2可知, 291~310 K时, 该体系中Δ G< 0, Δ H< 0, Δ S< 0, 说明BDE47与溶菌酶之间的结合是一个自发放热的过程, 二者结合的作用力类型为氢键和范德华力^[9]。 这与分子对接、 结合自由能分析的结论一致, 表明了计算模拟的准确性。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同温度下BDE47与溶菌酶相互作用的热力学常数 Table 2 The thermodynamic parameters of BDE47-lysozyme interaction at different temperatures compound T/K Δ H/(kJ· mol-1) Δ G/(kJ· mol-1) Δ S/(J· mol-1· K-1) BDE47 291 298 306 310 -103.90 -33.19 -31.49 -29.54 -28.57 -242.99

表2 不同温度下BDE47与溶菌酶相互作用的热力学常数 Table 2 The thermodynamic parameters of BDE47-lysozyme interaction at different temperatures