本研究以内蒙古地区褐煤和羊粪为研究对象, 褐煤源自内蒙古赤峰市平庄煤矿, 羊粪源自内蒙古包头市养殖场, 有机肥的发酵: 第一组作为空白对照, 100%羊粪; 第二组添加10%褐煤、 90%羊粪; 在发酵的过程中, 每三天翻堆一次, 采集羊粪有机肥样品, 供有机肥DOM的提取。

称取有机肥鲜样, 按有机肥干物质重与双蒸水体积为1:10 (W(g)/V(mL)) 加入双蒸水, 室温下200 r· min^-1下振荡16 h, 然后4 ℃下12 000× g离心20 min, 上清液过0.45 μ m滤膜, 滤液即为DOM, TOC仪(Vario TOC/Tnb)测定水溶性有机碳(DOC)后, 双蒸水调节一致样品浓度备用。

(1)紫外可见光谱分析将待测DOM浓度调节至330 mg(C)· L^-1, 在紫外可见分光光度计上测定, 扫描波长范围200~700 nm^[10]。

(2)荧光光谱分析发射和激发单色器的扫描速度均为200 nm· min^-1, 发射单色器狭缝宽度10 nm, 激发单色器狭缝宽度5 nm。 荧光发射光谱扫描范围370~600 nm, 固定的激发波长为350 nm。 激发光谱图采用固定发射波长560 nm, 激发光谱扫描范围300~550 nm。 同步扫描激发光谱波长从300~600 nm, Δ λ =λ _发射-λ _激发=18 nm^{[13, 14]}。 所用仪器Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS55。 测定采用的DOM浓度为330 mg(C)· L^-1。

(3)傅里叶变换红外光谱分析1 mg冻干DOM样品与100 mg干燥KBr(光谱纯)磨细、 混匀, 在10 t· cm^-2下压成薄片并维持2~3 min, 用CF-IR光谱仪(TENSOR Ⅱ 03040404)测定并记录其光谱, 所有样品的测定条件完全一致。

紫外-可见光谱图研究DOM的特性, 能提供褐煤添加对羊粪有机肥发酵过程中DOM组成和特征变化的重要信息^[10]。

图1

Fig.1

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	图1 10%褐煤添加羊粪有机肥不同阶段DOM紫外-可见光谱图Fig.1 DOM UV-Vis spectrogram in different stages of sheep manure organic fertilizer added with 10% lignite

有机肥DOM在254 nm处的吸光度乘以100与该溶液的DOC值之比定义为SUVA₂₅₄(=A₂₅₄× 100/TOC)。 Li等^[15]研究认为, 有机物在254 nm下的紫外吸收, 主要代表具有不饱和碳碳键的化合物如芳香族化合物, 在254 nm波长下, 吸光值的增加意味着相同DOM浓度的有机质非腐殖质向腐殖质的转化^[16], 显示有机肥腐熟程度增加。 如图1(a)所示, 随着发酵时间推移, DOM在254 nm下的紫外吸收强度先降低、 后升高再下降又升高的过程, 由有机肥起始的0.662 3降至0.578 9最终升至0.662 2, 表明添加褐煤的羊粪有机肥, DOM在发酵前期可能含有一定的大分子的物质, 大分子物质逐渐随着发酵的进行降解, 在254 nm下DOM的吸光度增大, 氨基酸与木质素类降解产物不断缩合生成腐殖酸类物质, 致使羊粪有机肥腐殖质不断增加, 腐殖化程度随着有机肥发酵进行而升高^{[15, 17]}。

E₄/E₆为DOM在465与665 nm吸光度的比值, 常用于表征有机肥有机质的稳定度, E₄/E₆值越小, 有机质聚合程度越大^[18]。 如图1(b)所示, 有机肥样品的E₄/E₆值呈现出先下降后上升的趋势, 由有机肥发酵开始时的9.110 4降至最低为4.647 7, 表明有机肥样品DOM在发酵过程中有腐殖酸类物质生成, 有机质聚合程度增加, 随着可转化的木质素等有机质减少, 有机质聚合程度减少, E₄/E₆值升为有机肥发酵结束时的5.390 1。 紫外-可见光谱主要有3个吸收带^[19]。 在260~280 nm波长处有第1个吸收带(A₁), A₁积分面积值反映有机质中的木质素开始转化的剧烈程度^[10]。 如图1(c)所示, 在有机肥发酵前期的前6 d, A₁呈现下降趋势, 由40.682 0降至35.294 0, 在有机肥发酵后期A₁呈现出上升趋势, 有机肥结束后为40.445 4, 说明褐煤添加使羊粪有机肥DOM的结构变得更加简单, 发酵前期可腐殖化的木质素等有机质的量呈现出上升趋势, 第6 d为有机肥发酵中生物化学反应最活跃的一天。 第2个吸收带(A₂)位于460~480 nm波长处, 有机肥腐殖化程度随A₂积分面积增大而升高, A₂呈现出先上升后下降的趋势, 在有机肥发酵起始的5.154 4变化为发酵结束时的8.274 4, 在有机肥发酵的第12 d达到最高值8.461 1, 表明腐殖质随着有机肥发酵进行增多, 在第12 d时达到了顶峰, 后期可向腐殖质转化的有机质减少, 所以腐殖化程度降低。 第3个吸收带(A₃)对应的600~700 nm波长处, 600~700 nm波长处吸收带A₃积分面积表示腐殖化程度较高的芳香性和缩合基团呈现出先上升后下降的趋势, 变化趋势与A₁相似, 在有机肥第12 d出现峰值10.983 0, 表明整个发酵过程中, 高腐殖化程度产物增大, 在有机肥12 d时达到最大峰值。

重要吸收带A₁, A₂, A₃的面积积分比值, 同样能反映DOM组成和转化的重要信息^[10]。 A_2/1指的是A₂和A₁面积的比值, 反映了有机肥发酵中原料有机质如羊粪所含木质素等物质在腐殖化开始的比例; A_3/1指的是A₃和A₁面积的比值, 反映了腐殖化物质和非腐殖化物质之间的关系; A_3/2指的是A₃和A₂面积的比值, 反映了芳香性成分的压缩和聚合程度; A_(2+3)/1指的是A₂+A₃的面积与A₁面积的比值, 反映了腐殖化与非腐殖化物质的相关性, A_(2+3)/1比值增大速率越快, 腐殖化水平越大。 如图1(d)所示, 在有机肥发酵前期0~12 d, A_2/1, A_3/1和A_(2+3)/1的值呈增大的趋势, 说明腐殖化与非腐殖化物质比率增大。 有机肥发酵后期12~18 d, A_2/1, A_3/1和A_(2+3)/1的值呈现出先减小后趋于稳定的趋势, 主要是由于原料有机质腐殖化程度达到一定水平后, 可腐殖化的木质素等含量越来越小。 随着供氧量、 含水率等因素的改变和强化, 原料有机质非腐殖质向腐殖质转化的过程继续进行趋于稳定。

由表1可以看出, 羊粪有机肥的SUVA₂₅₄值均大于10%褐煤添加; 羊粪有机肥起始的E₄/E₆小于10%褐煤添加, 羊粪有机肥结束后的E₄/E₆大于10%褐煤添加; 由于单位浓度样品在254 nm的紫外吸收强度越高意味着DOM分子质量越大, E₄/E₆用来表征有机物的稳定度, 该值越小, 有机质聚合程度越大^[10], 所以添加褐煤的羊粪有机肥的DOM的多聚化程度变小, 结构变得更加简单, 即形成了更多的小分子有机物, 随着有机肥发酵的进行一些大分子物质逐渐降解、 聚合, 有机质聚合程度明显增大。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 DOM的SUVA254值和E4/E6 Table 1 SUVA254 and E4/E6 value of DOM 样品 SUVA254 (start) SUVA254 (end) E4/E6 (start) E465/E665 (end) 羊粪 0.698 3 0.707 7 5.765 0 5.899 0 褐煤添加10% 0.662 3 0.662 2 9.110 4 5.390 1

表1 DOM的SUVA254值和E4/E6 Table 1 SUVA254 and E4/E6 value of DOM

2.2.1 10%褐煤添加羊粪有机肥发酵过程中DOM的同步扫描光谱分析

与荧光发射光谱和激发光谱相比, 荧光同步扫描光谱能获得清晰、 独特波谱, 从而能够给出更多的DOM结构和官能团信息。

同步荧光光谱中有机肥DOM出现了2个明显的荧光峰, 其峰位置分别位于435和470 nm。 同步扫描光谱波峰的位置比较靠近土壤黄腐酸的特征峰(330~360, 390~430和460~490 nm)^[14], 说明10%褐煤添加处理的羊粪有机肥DOM中的腐殖质类物质均以类黄腐酸为主。 随着类腐殖质的芳香族结构物质所占的百分率的上升, 谱线向长波方向移动, 因此荧光峰光强的比值(I₄₇₀/I₄₃₅)可以用来表征类腐殖质芳环类化合物的数目及结构变化^[6], I₄₇₀/I₄₃₅可用来评价有机肥腐殖化程度, 随着I₄₇₀/I₄₃₅增大有机肥腐殖化程度升高。

由表2可知, 虽然I₄₇₀/I₄₃₅变化是上下波动的, 但总体呈上升趋势, 由开始的0.452 8上升至最后的0.655 2, 表明腐殖质类物质增加, 腐熟度提高。 图2还显示, DOM同步荧光光谱中2个类腐殖质峰的最大峰位置都向长波方向移动, 分别从有机肥起始的435和470 nm, 红移至堆肥结束的436和480 nm。 Zhao等^[6]研究表明有机质中稠环芳烃的存在, 导致最大荧光峰位置的红移, 因此, 表明有机肥发酵过程中有机质的苯环结构增多, 共轭度增大, 有机肥的稳定度提高。

图2

Fig.2

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	图2 10%褐煤添加羊粪有机肥不同阶段DOM同步扫描荧光光谱Fig.2 DOM synchronous scanning fluorescence spectroscopy of different stages of adding sheep manure organic fertilizer to 10% lignite

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 有机肥DOM同步扫描荧光光谱的参数变化 Table 2 Parameter changes in DOM synchronous scanning fluorescence spectra fororganic fertilizer Project 0 d 3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 435 nm 248.076 8 220.698 2 133.428 9 161.240 0 112.872 2 121.987 3 111.712 4 470 nm 112.320 3 99.578 3 80.136 5 83.511 3 68.356 0 76.521 7 73.197 7 I470/I435 0.452 8 0.451 2 0.601 0 0.517 9 0.605 6 0.627 3 0.655 2 AFLR 0.597 4 0.620 8 0.565 3 0.569 7 0.526 3 0.511 6 0.490 0 AHLR 0.402 6 0.379 2 0.434 7 0.430 3 0.473 7 0.488 4 0.510 0 AHLR/AFLR 0.673 9 0.610 8 0.769 0 0.755 3 0.900 1 0.954 7 1.040 8

表2 有机肥DOM同步扫描荧光光谱的参数变化 Table 2 Parameter changes in DOM synchronous scanning fluorescence spectra fororganic fertilizer

如图2所示, DOM同步扫描荧光光谱主要存在: A区(330~360, 390~430和460~490 nm)为富里酸Fulvic acid类物质区(FLR), 与黄腐酸类物质中带3~4个苯环的稠环芳烃的存在有关^{[15, 20]}; B区(490~595 nm)为胡敏酸Humic acid类物质区(HLR), 与腐植酸类物质中带5~7个苯环结构的稠环芳香烃的多环芳香结构存在有关^[20]。 本研究中, 2个标记为FLR和HLR的荧光区分别对应300~460和460~600 nm范围内荧光积分面积占总面积的比例。 经过18 d的有机肥发酵(表2)FLR的值由0.597 4降到0.490 0, 同时HLR的值由0.402 6增加到0.510 0。 可见有机肥发酵过程是一个DOM组分中类富里酸类物质降低以及类胡敏酸类物质增加的过程。

由于DOM中不同组分在有机肥发酵过程发生了不同的变化, 使得波谱向长波方向移动, 可以用HLR面积与FLR面积的比值(A_HLR/A_FLR)来揭示有机肥发酵过程中DOM的转化过程^[10], 由表2可知, 整体上A_HLR/A_FLR不断上升, 由有机肥发酵最初的0.673 9上升至有机肥发酵最终的1.040 8。 说明随着时间推移, 腐殖质芳香性结构增多, 有机肥趋于稳定。

2.2.2 有机肥发酵前后DOM的荧光光谱分析

有机肥发酵前后DOM的荧光发射(a)、 激发(b)和同步(c)扫描光谱图如图3所示, 其中1指的是未添加褐煤的羊粪有机肥发酵起始; 2指的是未添加褐煤的羊粪有机肥发酵结束; 3指的是10%褐煤添加的羊粪有机肥发酵起始; 4指的是10%褐煤添加的羊粪有机肥发酵结束。

图3

Fig.3

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	图3 有机肥发酵前后DOM的荧光发射(a)、 激发(b)和同步(c)扫描光谱图Fig.3 Fluorescence emission (a), excitation (b) and synchronous (c) scanning spectra of DOM before and after organic fertilizer fermentation

图3可以看出, 未添加褐煤和10%褐煤添加的羊粪有机肥有相似的发射光谱图、 激发光谱图和同步扫描光谱图, 经过18 d的微生物发酵, 有机肥发酵结束后样品荧光强度小于有机肥发酵起始时的荧光强度, 表明随发酵时间推移, DOM不饱和结构的多聚化程度增大^[21]。 添加10%褐煤后, 有机肥DOM 的荧光强度明显增强, 表明添加褐煤, 使羊粪有机肥DOM不饱和结构(主要是含苯环类物质)的多聚化程度变小, 意味着DOM的结构变得简单, 有小分子有机物生成^[10]。 由图3的发射、 激发和同步扫描光谱均可以看出, 18 d的有机肥发酵结束后, 10%褐煤添加羊粪有机肥的相对荧光强度, 明显高于未添加褐煤羊粪有机肥的荧光强度, 表明在羊粪有机肥中添加褐煤可以加速DOM向多聚化方向转变^[22]。

有机肥发酵前后DOM的红外光谱如图4所示, 其中(a)指的是未添加褐煤的羊粪有机肥发酵起始; (b)指的是未添加褐煤的羊粪有机肥发酵结束; (c)指的是10%褐煤添加的羊粪有机肥发酵起始; (d)指的是10%褐煤添加的羊粪有机肥发酵结束。

图4

Fig.4

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	图4 有机肥发酵前后DOM的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of DOM before and after organic fertilizer fermentation

从图4可见, 有机肥开始和结束时DOM的红外谱图出现相似的6个吸收峰(3 421, 2 922, 2 361, 1 650, 1 422和1 040 cm^-1)。 3 500~3 000 cm^-1是— COOH、 醇及苯酚中的— OH的伸缩振动吸收峰^[23]; 1 660~1 600 cm^-1可能是烯烃— C=C— 的伸缩振动、 羧酸中的— C=O伸缩振动或缔合酰胺中的— C=O伸缩振动吸收峰^[7]; 1 420~1 330 cm^-1可能是腐殖物质的特征光谱, 是对称羧酸跟阴离子— COO— 对称伸缩振动或— C— O— H面内弯曲谱带或键合的芳香环类的吸收峰^[23]; 1 200~1 040 cm^-1是多糖类的— C— O— C— 伸缩振动吸收峰, 最可能的是纤维素、 半纤维素的— C— O— C— 对称伸缩振动吸收峰; 830~820和671 cm^-1是芳香环类的特征峰^[24]; 603 cm^-1是氨基化合物的N— H弯曲谱带; 2 400~2 200 cm^-1为三键和累积双键伸缩振动吸收峰, 主要包括— C≡ C— , — C≡ N— 三键的伸缩振动和 , 等累积双键的非对称伸缩振动^[24]。 由于3 500~3000, 1 660~1 600, 830~820 cm^-1吸收峰存在, 表明有机肥样品的DOM中含有苯环和酚基功能团; 3 500~3 000, 1 660~1 600和1 420~1 330 cm^-1存在吸收峰预示着样品中有— COOH; 1 200~1 040 cm^-1吸收峰表明样品中有多糖; 2 400~2 200 cm^-1吸收峰表明样品中含有蛋白类降解物质。 从图4可以看出, 羊粪添加褐煤进行有机肥发酵前后, 其DOM存在相同的功能基团, 但吸收峰的强度已发生了较大变化, 说明某些基团的含量在发生变化。 随着有机肥发酵的进行, 3 500~3 000 cm^-1吸收峰的相对强度逐渐降低, 10%褐煤添加和未添加褐煤的分别降低了2.31%和5.70%, 表明发酵原料中纤维素、 半纤维素、 酰胺化合物分解, 使羟基和次甲基减少。 在1 200~1 040 cm^-1吸收峰的相对强度逐渐降低, 10%褐煤添加和未添加褐煤的有机肥分别降低了5.33%和6.05%, 表明DOM中的多糖类物质含量在减少。 在600~800 cm^-1有机肥发酵后的吸收强度明显高于发酵前的, 表征了在有机肥发酵过程中形成了结构稳定的芳香族物质。