软骨样本来自有轻微关节功能退变的两条比格犬(江苏亚东动物研究院, 动物伦理委员会许可)。 选取膝关节股骨端软骨样本(软骨表面完整性较好), 编号分别为S1和S2。 透明剂分别采用甘油和碘海醇。 甘油购自国药集团化学试剂有限公司, 纯度> 99.9%(分析纯), 分别配置浓度100%, 80%, 60%和40%各45 mL。 碘海醇, 由通用电气药业(上海)有限公司提供, 规格350 mg· mL^-1(常以碘含量表征浓度), 分别配置规格350, 250, 150和50 mg· mL^-1各45 mL。

实验所用拉曼光谱仪是本实验室自行搭建的拉曼光谱系统^[14], 结构示意图见图1, 包括785 nm激光器(IPS)、 制冷型CCD检测器(Andor)、 信号收集单元、 三维移动平台、 计算机, 拉曼光谱仪(光栅(Newport)刻痕密度1 200 lp· mm^-1, 狭缝(Thorlab)50 μ m)。 光谱扫描范围为500~2 200 cm^-1, 分辨率为3 cm^-1。

图1

Fig.1

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	图1 自搭建拉曼光谱系统示意图Fig.1 Schematic diagram of home-built Raman spectroscopic system

S1实验组中, 右后腿股骨端膝关节整体软骨沿中线剖开后分别浸渍在80%和100%浓度的甘油溶液中, 左后腿股骨端同样位置剖分后顶端软骨分别浸渍在40%和60%浓度甘油中, 每隔十分钟后取出, 取12个点进行采集(后取平均值), 浸渍计时60 min。 S2实验组与S1实验组操作相同, 其中50和150 mg· mL^-1的碘海醇溶液用于左腿股骨端软骨, 250和350 mg· mL^-1用于右腿股骨端软骨, 计时60 min, 时间间隔为10 min。 样品置于三维样品平台上室温下进行光谱采集, CCD曝光时间20 s。

相应的背景扣除和光谱采集是在CCD自带Andor Solis软件下完成。 采用Vancouver Raman Algorithm 软件^[15]对光谱进行荧光背景分离; 由Origin Pro软件进行10点平滑处理(五次多项式)并计算相应拉曼带面积。 采用特征带强度比(磷酸基团与酰胺Ⅰ 带积分面积比值)来定性表征软骨内矿物质与有机组分的变换及光透明效应^[16]。

图2给出了在350 mg· mL^-1下碘海醇浸渍60 min后测得的关节软骨平均光谱图(波数范围800~1 750 cm^-1)。 图中标记了主要的矿物质和有机物的谱带: 1 250~1 320 cm^-1(代表酰胺Ⅲ ), 1 600~1 700 cm^-1(代表酰胺Ⅰ ), 1 400~1 470 cm^-1(代表亚甲基团), 而磷酸基团(P O43-)和碳酸基团(C O32-)主要代表矿物质成分。

图2

Fig.2

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	图2 以350 mg· mL-1碘海醇浸渍不同时间的关节软骨样本的平均光谱图 注: 0 min表示未加透明剂情况下, 下同Fig.2 The average spectra of cartilage impregnated with 350 mg I· mL-1 iohexol for different time

2.1.1 碘海醇浸渍时间的影响

图3所示的是在不同碘海醇浓度下特征峰拉曼强度比(即磷酸基团峰与酰胺Ⅰ 峰的积分面积比值)随浸渍时间的变化趋势, 并以此矿物质与有机物特征峰面积比值来反应光透明效果。 由图可得, 在50 min内光透明效果不明显, 总体上强度比值较未加透明剂之前低或变化不大, 尔后增大, 透明效果明显。 生物组织散射强以致激发光穿透深度浅, 拉曼强度比不明显。 生物医学光子学已理论证实生物组织高散射性是源于散射颗粒与背景介质光学折射率不匹配^[17]。 这其中散射颗粒就包括细胞和细胞器等(折射率1.39~1.42^[18]), 背景介质则主要有细胞间液和内液两种组分(折射率1.34~1.36^[18])。 由复合介质折射率的Gladstone-Dale定律^[19], 碘海醇(折射率1.45^[12])进入软骨基质后可视为软骨细胞间液, 与软骨基质折射率1.35不匹配, 导致50 min内拉曼强度比轻微波动。 通过50 min平衡后, 碘海醇浸入软骨基质使其折射率得到匹配, 拉曼强度比增高。 软骨内基质主要由蛋白多糖与胶原纤维组成, — CH₂基团特征峰强度除了来自蛋白多糖和胶原蛋白外主要来源于松质骨^[20], 经光透明过后的软骨拉曼光谱中— CH₂基团特征峰强度的增长明显快于磷酸基团特征峰, 见图2所示。 以上结论表明经碘海醇的光透明效应, 激发光可经关节软骨(厚度约1 mm)探测到软骨下的松质骨, 说明碘海醇光透明效果能达到软骨下骨; 也说明随着时间的延长, 软骨光透明效果逐渐变好。 同时从另一方面也暗示了— CH₂基团特征峰强度变化也可作为碘海醇光透明效果检测的另一手段。

图3

Fig.3

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	图3 不同碘海醇浓度下拉曼强度比(P O43-/Amide Ⅰ )随时间变化关系 2.1.2 碘海醇浓度的影响Fig.3 The time dependence of Raman intensity ratio of phosphate group to amide Ⅰ under different iohexol concentrations ranging from 50 to 350 mg· mL-1

由图3还可观察到: 0 min时, 即无透明剂作用时, 各浓度碘海醇即将浸渍的位置所测拉曼强度比相当。 经过透明50 min之后, 150 mg· mL^-1条件下拉曼强度比明显最高; 350 mg· mL^-1条件下的比250和50 mg· mL^-1下的略大, 250 mg· mL^-1条件下比50 mg· mL^-1下的略大。 由此可知, 在整个浸渍时间范围内, 150 mg· mL^-1碘海醇使软骨透明程度提高, 以致软骨内绝对探测深度较深, 从而该比值增大^[21]。

碘海醇是常用于临床的一种非离子型造影剂, 含碘量约40%, 渗透压和粘稠度与血浆接近。 主要分布在间质腔中, 也不被吸收和代谢, 测不到任何代谢产物光谱。 高浓度碘海醇的高渗透压可能使组织脱水, 导致软骨细胞与软骨基质间折射率匹配更好以致组织散射性降低^[10], 光透明效果也更好。 当激发光能穿透软骨抵达钙化区及软骨下骨, 该区域磷酸基团特征峰较强^[22], 故拉曼强度比值也越高。

以上两个方面研究说明经较高浓度碘海醇作用后, 激发光可探测到软骨下骨, 但是150 mg· mL^-1浓度碘海醇透明剂获得透明效果更佳。

2.2.1 甘油浸渍时间的影响

图4所示的是在不同甘油浓度下特征峰拉曼强度比随浸渍时间的变化趋势。 从图可以看出, 加入甘油后拉曼强度比迅速增大, 说明甘油能增强拉曼强度比信号, 并在第20 min时拉曼强度比(光透明效果)达到最强。 20 min后拉曼强度比减弱, 这可能和甘油与软骨组织的相互作用方式有关。 甘油分子的— OH基团能够较快与胶原分子形成氢键(并达饱和稳定), 破坏了胶原-胶原间的连接氢键, 使胶原纤维解离, 被破坏后的氢键与甘油的— OH 结合形成水分子, 使得软骨脱水收缩并实现折射率的匹配, 厚度变薄^{[23, 24]}和组织光透明, 最终使激发光能穿透软骨区(磷酸基团特征峰强度较低)到达钙化区及软骨下骨(磷酸基团特征峰强度高), 因此拉曼强度比增强。 软骨收缩后组织间隙变得紧凑, 激发光和信号穿过软骨区域几率变小, 所以在20 min后的拉曼强度比出现了轻微降低。 更高浓度的甘油粘度高则难于被吸收, 透明效果反而较不明显。

图4

Fig.4

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	图4 不同甘油浓度下拉曼强度比(P O43-/Amide Ⅰ )随时间变化关系Fig.4 The time dependence of Raman intensity ratio of phosphate group to amide Ⅰ under different glycerol concentrations ranging from 40% to 100%

2.2.2 甘油浓度的影响

由图4还可见, 甘油浓度为60%时, 磷酸基团峰与酰胺Ⅰ 的拉曼强度比最高, 获得的透明效果最好。 40%浓度甘油使软骨的透明效果稍好于100%浓度。 由于甘油是中间代谢产物, 低浓度的甘油可能被吸收, 从而更容易改变软骨细胞与软骨基质、 软骨细胞基质的折射率, 使得软骨内散射颗粒与背景介质折射率匹配更快, 从而在60%浓度下实现最佳的软骨光透明效果。 对于80%浓度的甘油, 不被组织吸收导致可能需要更长的作用时间完成折射率匹配从而实现软骨光透明。

以上研究可见, 不同的透明剂对软骨光透明的影响是不同的。 高浓度的甘油、 碘海醇的软骨光透明效果不一致。 碘海醇自身粘度低, 较高浓度下, 其光透明效果会较好^[24], 且组织不易变形。 高浓度的甘油由于固有的高粘度则限制了其对组织的渗透, 导致其光透明效果减弱。 在加入甘油和碘海醇的60 min之内, 两者透明效果有相反趋势, 甘油会较快增强软骨透明效果, 碘海醇则在60 min内透明效果稍有波动。 共同之处则是透明剂所具有的渗透特性导致软骨组织脱水, 此时的甘油或碘海醇取代了低折射率的软骨基质液, 使软骨中各种成份折射率得到匹配, 降低散射, 从而提高了软骨的光透明效果。

本研究同时考虑到透明剂自有光谱对测量结果的影响。 经拉曼光谱检测发现, 碘海醇试剂的特征拉曼峰并没有出现在其浸渍的软骨组织的拉曼光谱中, 而甘油试剂特征峰则出现在824, 855和1 469 cm^-1。 为了尽量减少光透明剂对样品光谱数据造成特征峰误判, 光谱分析选用磷酸基团和酰胺Ⅰ 特征带来进行数据分析^[21]。 磷酸基团特征带最早出现是在钙化区, 如果加入光透明剂之后就能获得更强的磷酸基团特征带, 就此可判定激发光到达钙化区及以下的软骨下骨。 另一方面, 也是为了避免每次光谱采集过程中可能出现的激发光照射或聚焦平面位置的偶然误差^[16], 实验分析采用了同一测量谱线中磷酸基团和酰胺Ⅰ 的特征峰积分强度比来表征光透明效果。