引用本文
战岩, 俎鸿儒, 黄棣, 胡超凡. 水热法快速制备荧光氧化石墨烯量子点及其在细胞成像中的应用[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(5): 1458-1462.
ZHAN Yan, ZU Hong-ru, HUANG Di, HU Chao-fan. Rapid Synthesis of Graphene Oxide Quantum Dots via Hydrothermal Strategy for Cell Imaging Application [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(5): 1458-1462.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)05-1458-05  
Permissions
Copyright©2018, 《光谱学与光谱分析》期刊社
《光谱学与光谱分析》期刊社 所有
水热法快速制备荧光氧化石墨烯量子点及其在细胞成像中的应用
战岩1, 俎鸿儒1, 黄棣1,*, 胡超凡1,2,*
1. 太原理工大学力学学院, 山西 太原 030024
2. 华南农业大学材料与能源学院, 广东 广州 510624
*通讯联系人 e-mail: huangjw2067@163.com; hcf0000@126.com

作者简介: 战 岩, 1990年生, 太原理工大学力学学院硕士研究生 e-mail: 458237101@qq.com

收稿日期: 2017-08-07
基金: 国家自然科学基金项目(51402207, 11502158)资助
摘要

作为一种新型荧光纳米材料, 氧化石墨烯量子点(GO QDs)凭借其良好的水溶性和生物相容性得到广泛的关注。 以氧化石墨烯为原料, 过氧化氢为氧化剂, 一步水热法在90 min内快速制备氧化石墨烯量子点, 实现了快速、 高效及绿色制备氧化石墨烯量子点。 所制备得到的氧化石墨烯量子点分布均匀, 透射电镜(TEM)图片表明氧化石墨烯量子点粒径分布在2.25~5.25 nm, 傅里叶红外光谱(FTIR)和X射线电子能谱(XPS)显示氧化石墨烯量子点表面含有大量的羟基、 羧基、 羰基等含氧功能团, 表明氧化石墨烯量子点具有很好的水溶性。 荧光发射光谱(PL)表明氧化石墨烯量子点具有激发波长依赖性。 基于其独特的纳米结构, 良好的光学性能和生物相容性, 氧化石墨烯量子点可替代传统荧光纳米材料应用于细胞成像。

关键词: 水热法; 过氧化氢; 氧化石墨烯; 荧光量子点; 细胞成像
中图分类号:O644.3 文献标志码:A
Rapid Synthesis of Graphene Oxide Quantum Dots via Hydrothermal Strategy for Cell Imaging Application
ZHAN Yan1, ZU Hong-ru1, HUANG Di1,*, HU Chao-fan1,2,*
1. College of Mechanics, Taiyuan University of Technology, Taiyuan 030024, China
2. College of Materials and Energy, South China Agricultural University, Guangzhou 510624, China
Abstract

As a new type of fluorescent nanomaterials, graphene oxide quantum dots (GO QDs)have extensively captivated attention due to their excellent water solubility and biocompatibility. In this work, GO and hydrogen peroxide were chosen as source and oxidant, and one-pot hydrothermal approach was proposed to rapidly synthesize graphene oxide quantum dots (GO QDs) in 90 min, making a rapid, efficient and green strategy of synthesis of GO QDs. The as-prepared GO QDs showed uniform size distribution, and transmission electron microscopy (TEM) displayed that the diameter of GO QDs ranged from 2.25 to 5.25 nm. A large number of hydroxyl, carboxyl and carbonyl oxygen-containing functional groups were confirmed by Fourier transform infrared (FTIR) spectrum and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis on the surface of GO QDs, indicating GO QDs present excellent water solubility. Photoluminescence (PL) spectra exhibited excitation-dependent photoluminescence emission of GO QDs. Based on the unique nanostructure, distinctive spectral properties and biocompatibility, GO QDs could be employed in cell imaging applications as a promising candidate of conventional fluorescent nanomaterials.

Keyword: Hydrothermal approach; Hydrogen peroxide; Graphene oxide; Fluorescent quantum dots; Cell imaging
引 言

石墨烯的发现打开了研究二维材料的大门, 作为新型碳材料, 氧化石墨烯是石墨烯经过氧化处理的单一原子层氧化物, 仍然保持碳原子以sp2杂化方式形成的层状结构, 但在单片上引入大量的羟基、 羧基、 羰基、 环氧基等含氧功能团, 导致氧化石墨烯片层具有良好的水分散性及易功能化的特点, 为其在生物领域的应用创造了良好的条件[1, 2, 3]。 相对于层状二维结构, 氧化石墨烯量子点体现出独特的光学及电学性能, 这是由于当片层氧化石墨烯的尺寸减小到10 nm后, 其量子局限性和边缘效应显著增强[4]。 与传统的荧光纳米材料相比较, 氧化石墨烯量子点具有良好生物相容性、 荧光稳定性、 低毒性等优势, 在光学传感、 生物成像及环境检测方面有良好的应用价值[5]。

目前, 制备氧化石墨烯量子点主要有两种方法: 自上而下法和自下而上法[6]。 自上而下合成法主要通过液相剥离破坏片层结构间相互作用力制备量子点, 包括离子插层法、 超声剥离法、 剪切剥离法、 选择性刻蚀法及氧化还原法等[7]。 自下而上合成法主要利用高温高压的条件打破原材料原子间强烈的共价键作用, 将原子间的作用重新组合。 自下而上方法操作复杂、 反应条件苛刻, 制备过程难以控制[8]。 相对于后者, 自上而下合成法体现出操作简便、 节能、 环保等优点, 但目前已报道的制备氧化石墨烯量子点的自上而下法中也存在反应时间长、 操作繁冗、 使用强酸型氧化剂、 有机溶剂等问题[9, 10]。 因此, 探索一种绿色快速法制备氧化石墨烯量子点仍然面临巨大的挑战。 本文通过一步水热法, 采用过氧化氢为氧化剂, 在90 min内快速制备氧化石墨烯量子点, 实现了快速绿色制备氧化石墨烯量子点。 通过调节反应时间至75和90 min, 可获得分别发射黄色荧光和蓝色荧光的氧化石墨烯量子点。 我们对蓝色荧光氧化石墨烯量子点能进行了表征及性测试, 结果表明其平均粒径为3.75 nm, 表现出良好的水溶性、 荧光稳定性及生物相容性, 可以广泛应用于细胞成像及荧光传感等领域。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

石墨粉与过氧化氢均购于阿拉丁试剂(上海)有限公司, 细胞培养试剂均购于美国GIBCO公司, 所使用试剂均为分析纯, 实验用水为去离子水(18.2 MΩ )。

扫描电子显微镜(Nova NaoSEM-430, 荷兰FEI公司); 透射电子显微镜(JEOL-2010, 日本JEOL公司); 傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS10, 美国 Thermo Nicolet公司); X射线能谱(AXIS-ULTRA OLD-X, 日本Kratos公司); 紫外-可见分光光度计(UV-2550, 日本Shimadu公司); 荧光分光光度计(F-7000, 日本Hitachi公司); 激光共聚焦显微镜(LSM 710, 德国Zeiss公司)。

1.2 荧光氧化石墨烯量子点的制备

氧化石墨烯通过已报道的Hummers法制备而得。 称取30 mg氧化石墨烯粉末分散于30 mL去离子水中, 加入1 mL过氧化氢, 超声分散均匀。 将混合液转移至反应釜中, 密封后在180 ℃条件下分别反应60, 75和90 min。 将反应液通过0.22 μ m的水系滤膜进行抽滤, 收集滤液得到氧化石墨烯量子点的水分散液。

1.3 荧光成像

将Hela细胞在96孔显微板中进行培养, 板孔细胞密度为5× 103个, 在二氧化碳浓度为5%, 温度为37 ℃条件下培养24 h。 用装有已过滤处理的氧化石墨烯量子点的培养基培养细胞5 h, 将细胞用磷酸盐溶液冲洗三次除去表面残余的量子点。 将细胞用多聚甲醛固定20 min, 并用载玻片封片后, 放在激光共聚焦显微镜下观察, 研究氧化石墨烯量子点对Hela细胞标记时的激发波长为405 nm。

采用细胞活性比色检测法(MTT检测法)测定氧化石墨烯量子点的细胞毒性, 将不同浓度的氧化石墨烯量子点水溶液与Hela细胞共同孵育48 h 后, 根据酶标仪上的度数计算细胞活性。

2 结果与讨论
2.1 荧光氧化石墨烯量子点合成机理及制备过程

如图1所示, 由于表面含有大量的含氧功能团, 氧化石墨烯片层极易分散于去离子水中, 通过水热反应, 采用过氧化氢高温解离出来的羟基和氧自由基的氧化作用破坏其C— C, 形成C— OH, 并将其逐渐裂解形成量子点, 基于较强氧化性, 同时伴随有少量的纳米小颗粒被氧化为二氧化碳气体放出。 通过调控反应时间观察氧化过程, 可以看出反应时间在60 min氧化石墨烯参与反应并会有少量荧光纳米材料生成, 反应时间控制在75 min会有发射黄色荧光纳米材料生成, 反应时间延伸至90 min, 会有发射蓝色荧光纳米材料生成, 并且荧光强度逐渐提高, 水系滤膜上残留物表明大部分氧化石墨烯参与反应, 因此采用发射蓝色荧光氧化石墨烯量子点为研究对象。 以上分析说明随着反应时间不同, 氧化石墨烯被过氧化氢裂解为尺寸大小不一、 发射波长逐渐蓝移的荧光纳米材料。

图1 水热法制备GO QDs的过程示意图Fig.1 Schematic process of synthesis of GO QDs via one rapid hydrothermal treatment in the presence of hydrogen peroxide

2.2 氧化石墨烯量子点的表征及光学性质的研究

图2(a)是氧化石墨烯扫描电镜(SEM)图片, 可以看出其褶皱的片层结构。 图2(b)和(c)分别为氧化石墨烯量子点透射电镜(TEM)图片和粒径分布图, 可以清晰地看出氧化石墨烯量子点尺寸均匀, 经统计其粒径分布在2.25~5.25 nm, 平均粒径为3.75 nm。 图2(d)是氧化石墨烯量子点高分辨透射电镜(HRTEM)图片, 可以看出其晶格尺寸为0.24 nm, 对应于石墨烯(1120)晶相, 这与已报道文献相符[11]。 以上分析证明了层状氧化石墨烯被过氧化氢氧化剥离为纳米量子点。

图2 (a) GO的SEM图; (b) GO QDs的TEM图; (c) GO QDs的粒径分布图; (d) GO QDs的HRTEM图Fig.2 (a) SEM image of GO; (b) TEM image of GO QDs; (c) Size distribution of GO QDs; (d) HRTEM image of GO QDs

图3(a)为氧化石墨烯及其量子点的傅里叶红外光谱(FTIR)图, 可以看出经过氧化反应, 氧化石墨烯量子点表面存在大量含氧功能团, 如O— H (3 412.15 cm-1), C=O (1 733.20 cm-1), C— O— C (1 227.25cm-1)和C— O (1 048.60 cm-1)[12]。 图3(b)是氧化石墨烯及其量子点的X射线能谱(XPS), 可以看出经过反应后氧化石墨烯量子点表面含氧量明显增多。 图3(c)为氧化石墨烯量子点C (1s)的X射线能谱, 峰值处于288.98, 286.07和284.80 eV 分别对应于COO— , C— O和C— C。 图3(d)是氧化石墨烯量子点O(1s)的X射线能谱, 图中COO— , C— O和C=O 分别位于533.03, 532.21和531.42 eV[13, 14]。 红外光谱与X射线能谱分析结果一致表明, 氧化石墨烯经过氧化氢水热处理为量子点后, 表面含氧功能团显著增加。

图3 (a) GO QDs的傅里叶红外光谱图; (b)GO和GO QDs的X射线光电子全扫描谱图; GO和GO QDs的(c) C(1s)和(d) O(1s) X射线光电子谱图Fig.3 (a) FTIR spectra of GO and GO QDs; (b) XPS survey spectra of GO and GO QDs; (c and d) C (1s) and O (1s) spectra of GO QDs

图4(a)为氧化石墨烯量子点的紫外吸收光谱(UV-Vis)图, 可以看出氧化石墨烯量子点光吸收范围从紫外延伸至可见光, 并在330 nm左右出现特征吸收峰, 这是由于其n— π * 的跃迁[15]。 图4(a)插图表明氧化石墨烯量子点分散液在日光和紫外灯照射下分别呈现淡黄色和蓝色。 图4(b)为氧化石墨烯量子点荧光发射光谱(PL)图, 可以看出其具有激发波长依赖性, 这与已报道文献相符[16]。 图4(c)表明氧化石墨烯量子点的最佳激发波长和最佳发射波长分别为330和420 nm。 图4(d)为氧化石墨烯量子点荧光稳定性图片, 可以看出在60 min内, 其荧光强度基本保持不变。

图4 (a) GO QDs的紫外可见吸收光谱图(插图为GO QDs在可见光和紫外灯照射下的光学照片); (b) GO QDs不同激发波长的荧光光谱图; (c)GO QDs激发和发射光谱图; (d)GO QDs在激发波长为330 nm照射下的荧光稳定性Fig.4 (a) UV-Vis absorption of GO QDs (insert: Optical photographs of GO QDs under visible light and 365 nm excitation); (b) PL emission spectra of GO QDs with different excitation wavelengths; (c) PL excitation and emission spectra of GO QDs; (d) Photostability of GO QDs with 330 nm excitation

2.3 细胞成像

基于氧化石墨烯量子点小尺寸、 单分散, 表面具有大量的含氧功能团, 良好的荧光稳定等特点, 在细胞成像有潜在的应用前景。 图5为Hela细胞和氧化石墨烯量子点共同培育5 h后在405 nm激发波长时的激光共聚焦图片, 可以看出Hela细胞呈现出明亮的蓝色荧光, 表明氧化石墨烯量子点可以通过内吞作用进入细胞。 从图中看出细胞贴壁生长, 形态保持良好, 说明氧化石墨烯量子点表现出较低的细胞毒性。

图5 (a) Hela细胞与GO QDs共同配育5 h后在激发波长为405 nm的共聚焦荧光显微镜图片; (b) 明场图; (c) 荧光与明场叠加图Fig.5 (a) Confocal fluorescence microphotograph of Hela cells cultured with GO QDs for 5 h (λ ex=405 nm); (b) Bright-field microphotograph of Hela cells; (c) An overlay image of (a) and (b)

图6为不同浓度氧化石墨烯量子点(0~150 μ g· mL-1)与Hela细胞共同培育48 h后的细胞存活率。 结果表明, 随着氧化石墨烯量子点浓度的增加, 细胞存活率有降低的趋势, 但是变化相差不大, 基本维持95%以上, 进一步说明氧化石墨烯量子点具有良好的生物相容性, 表现出较低的细胞毒性。

图6 Hela细胞与不同浓度GO QDs共同培育48 h后的细胞存活率Fig.6 Cell viability of Hela cells cultured with different concentration of GO QDs for 48 h

3 结 论

通过一步水热法, 采用过氧化氢为氧化剂, 在60~90 min内实现快速制备氧化石墨烯量子点, 并且探讨了反应时间对生成物的影响。 与已报道的合成法相比较, 该制备方法操作简便、 绿色环保, 将有潜力应用于其他纳米氧化物材料的制备。 制备所得量子点分布均匀、 具有良好的水溶性、 荧光稳定性及生物相容性, 在生物成像、 荧光传感及环境检测领域有潜在的应用前景。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Xu M S, Liang T, Shi M M, et al. Chem. Rev. , 2013, 113(5): 37668. [本文引用:1]
[2] Zhan Y, Liu Z M, Liu QQ, et al. New J. Chem. , 2017, 41(10): 39308. [本文引用:1]
[3] XIA Chang, CHEN Xu-wei, WANG Jian-hua(夏畅, 陈旭伟, 王建华). Spectroscopy and Spectral Analysis(光谱学与光谱分析), 2016, 36(10): 351. [本文引用:1]
[4] Liu Q Q, Hu C F, Wang X M. RSC Adv. , 2016, 6(30): 25605. [本文引用:1]
[5] LI Ling-ling, NI Gang, WANG Jia-nan, et al(李玲玲, 倪刚, 王嘉楠, 等). Spectroscopy and Spectral Analysis(光谱学与光谱分析), 2016, 36(9): 2846. [本文引用:1]
[6] N L Y, Colman J N, Zhang H, Shin H, et al. Small, 2016, 12(3): 272. [本文引用:1]
[7] Ren W C, Cheng H M. Nanotechnol. , 2014, 9: 726. [本文引用:1]
[8] Wang X W, Sun G Z, Li N, et al. Chem. Soc. Rev. , 2016, 45(8): 22392. [本文引用:1]
[9] ZHAN Yan, ZU Hong-ru, HUANG Di, et al(战岩, 俎鸿儒, 黄棣, 等). Chem. J. Chinese Universities(高等学校化学学报), 2017, 39(9): 1556. [本文引用:1]
[10] Ghosh D, Halder G, Sahasrabudhe A, et al. Nanoscale, 2016, 8(20): 10632. [本文引用:1]
[11] Li Y, Liu H, Liu X Q, et al. Langmuir, 2016, 32(34): 8641. [本文引用:1]
[12] Lu L Q, Zhu Y C, Shi C, et al. Carbon, 2016, 109: 373. [本文引用:1]
[13] Hu C F, Liu Y L, Lei B F, et al. J. Nanopart. Res. , 2015, 17(12): 4831. [本文引用:1]
[14] Hu C F, Liu Y L, Rong J H, et al. Nano, 2015, 10(8): 15501123. [本文引用:1]
[15] Lu Q J, Wu C Y, Liu D, et al. Green Chem. , 2017, 19(4): 900. [本文引用:1]
[16] Dong Y Q, Shao J W, Chen C Q, et al. Carbon, 2012, 50: 4738. [本文引用:1]