引用本文
刘瑾, 杨建军, YongfengHu, 李菊梅, 张秀, 马义兵. 一种高效有机结合态磷肥的多谱学分子形态表征[J]. 光谱学与光谱分析, 2018,38(3): 958-962.
LIU Jin, YANG Jian-jun, Yongfeng HU, LI Ju-mei, ZHANG Xiu, MA Yi-bing. Molecular Speciation of Phosphorus in an Organically Bound Phosphorus Fertilizer with High Phytoavailability Characterized by Multiple Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2018,38(3): 958-962.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2018)03-0958-05  
Permissions
Copyright©2018, 《光谱学与光谱分析》期刊社
《光谱学与光谱分析》期刊社 所有
一种高效有机结合态磷肥的多谱学分子形态表征
刘瑾1, 杨建军2, YongfengHu3, 李菊梅1, 张秀4, 马义兵1,*
1. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 北京 100081
2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 北京 100081
3. Canadian Light Source, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 2V3 Canada
4. 北京大学分析测试中心, 北京 100871
*通讯联系人 e-mail: mayibing@caas.cn

作者简介: 刘瑾, 1986年生, 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所博士后 e-mail: liujin01@caas.cn

收稿日期: 2017-06-04
基金: 国家自然科学基金项目(41601313, U1632134), 中国博士后科学基金项目(2017M611067)资助
摘要

当前, 磷肥不合理施用引发的资源危机和环境问题日益凸显, 创制新型磷肥、 提高磷肥利用率是保障农业生产、 环境安全及可持续发展的关键。 鉴于有机结合态磷肥不易被土壤组分固定, 在土壤中移动性强, 作物有效性高, 研发新型有机结合态磷肥有望从根本上突破并解决无机磷肥利用率低的问题。 新近, 新型有机结合态磷肥的研发方兴未艾, 而有机结合态磷肥的赋存形态及其高效机理尚不清楚。 基于多种有机结合态磷肥研制及肥效方面的研究成果, 选取价格低廉、 肥效稳定的淀粉基磷肥, 采用液相磷-31核磁共振(P-NMR)技术、 同步辐射X射线吸收近边结构谱(XANES)技术在分子层面上对其磷形态进行表征。 将供试淀粉基磷肥酶解制成α-极限淀粉糊精, 溶解于45%的二甲亚砜, 通过液相P-NMR分析发现该磷肥中总磷含量约为5 218 mg·kg-1, 与灼烧-比色法测得的结果一致; 其中磷主要以有机形态赋存, 正磷酸单酯占总磷比例达75.8%。 正磷酸二酯含量为17.3%, 而无机磷仅占总磷含量的6.9%。 另外, 通过指纹图谱比对, 供试样品磷的K-边XANES谱与植酸磷的谱图极为相似。 以上研究结果表明该淀粉基磷肥中磷以正磷酸单酯为主, 为深入揭示有机结合态磷肥的高效机制提供了重要依据。

关键词: 磷; 分子形态; 液相磷-31核磁共振; X射线吸收近边结构谱; 肥料
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Molecular Speciation of Phosphorus in an Organically Bound Phosphorus Fertilizer with High Phytoavailability Characterized by Multiple Spectroscopy
LIU Jin1, YANG Jian-jun2, Yongfeng HU3, LI Ju-mei1, ZHANG Xiu4, MA Yi-bing1,*
1. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
3. Canadian Light Source, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK S7N 2V3 Canada
4. Analytical Instrumentation Center, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract

While the global phosphorus (P) resources is running low, the environmental issues due to over-application of P fertilizers become increasingly urgent. There is a more pressing need than ever before to develop new types of P fertilizers with high phytoavailability with agronomic, environmental and sustainability benefits. Compared to generally applied inorganic P fertilizers, organically bound P fertilizers are less prone to soil fixation, and could remain relatively high mobility from where the fertilizer is added to the rhizosphere for crop utilization. Developing organically bound P fertilizers is increasingly recognized as an efficient way to fundamentally solve the current problem induced by the low phytoavailability of inorganic P fertilizers. In recent few years, related studies are becoming popular, but researches on the speciation of the emerging organically bound P fertilizers are not well-documented until now. Various organically bound P fertilizers were developed and their P phytoavailability were tested. Our previous study showed that the starch-bound P fertilizer had high P efficiency. Since the phytoavailability of P fertilizers was a function of the P species present in the fertilizer and the transformations in soils after application, this current study probed P speciation in the starch-bound P fertilizer at the molecular level by solution P-31 nuclear magnetic resonance (P-NMR) and synchrotron-based X-ray absorption near-edge structure (XANES) spectroscopy. To obtain quantitative results by P-NMR analysis, the fertilizer sample was hydrolyzed to α-limited dextrin, and then dissolved with dimethyl sulfoxide solution (45%). Nicotinamide adenine dinucleotide was added as an internal reference standard. It indicated that the total P concentration in the studied fertilizer by NMR agreed with that by the colorimetric chemical method. Phosphorus in the starch-bound P fertilizer was mainly presented as orthophosphate monoester, representing 75.8% of total P. Orthophosphate diester accounted for 17.3% of total P, while inorganic P only 6.9%. Furthermore, the XANES spectra of the P fertilizer closely resembled that of phytic acid, and was lack of the characteristic features of inorganic P species. Conclusively, these results illustrated the dominance of organic orthophosphate monoester in the studied fertilizer. Combining state-of-the-art of spectroscopic analysis, this study provides an important basis for further studies on the high phytoavailability mechanisms of organically bound P fertilizers.

Keyword: Phosphorus; Molecular speciation; Solution P-31 NMR; XANES; Fertilizers
引言

磷是农业生产不可或缺的化学元素之一, 与作物的新陈代谢密切相关, 为光合与呼吸作用、 能量传递、 细胞生长、 根系发育等一系列作物生理活动所必需。 磷充足供给是保障作物高产和品质优良的关键。 多年来现代农业的发展以磷肥的大量施用为基础, 一方面导致磷素在土壤中过量累积, 通过地表径流、 地下渗漏等方式进入水体, 滋养藻类及其他浮游生物迅速繁殖, 导致水体富营养化, 威胁生态环境健康和饮用水安全; 同时, 由于磷矿的不可再生性, 全球磷资源正面临枯竭[1], 而常用无机化学磷肥的作物利用率极低, 国内外大量研究表明施肥当季仅10%~25%可被作物吸收[2]。 因此, 改进磷肥性状, 研发新型高效磷肥技术, 提高磷肥在土壤中的移动性以维持其生物有效性, 是实现按需施磷, 进而保障农业可持续发展、 粮食安全和环境健康的必经之路[3]。

与传统无机磷肥相比, 有机结合态磷肥不易被土壤组分固定, 在土壤中移动性强, 易于迁移至作物根际, 作物利用率更高[4]。 据报道, 美国Land View公司研发的一种有机酸结合态磷肥Carbond P, 施入土壤后可长效保持磷肥活性, 与化学磷肥(聚磷酸铵和磷酸二氢铵)相比, 显著提高作物(玉米、 小麦等)吸磷率、 植株生物量、 茎粗和株高, 尤其在活性磷含量较低的石灰性土壤中效果更显著[5]。 本课题组前期以天然有机物(作物秸秆、 淀粉等)为原料合成有机结合态磷肥, 发现有机结合态磷肥施用于土壤后的移动性和肥效比无机磷肥(磷酸二氢钙等)均有大幅提高, 扩散距离平均提高20.6 mm, 磷肥利用率提高30.7%~268%。 尤其, 淀粉基磷肥, 与磷酸二氢钙相比, 该磷肥施用后土壤速效磷含量提高5倍以上, 作物当季利用率及吸磷量均可提高3倍, 具有肥效稳定、 价格低廉、 结构简单等优点[6]。 鉴于有机结合态磷肥的上述优点, 新型有机结合态磷肥技术研究方兴未艾, 而有机磷肥的分子形态、 结合机制及高效机理尚不清楚。

有机磷肥中磷的微观分子结构很大程度上决定其施用进入土壤后的形态转化及从施肥点到作物根际的有效化过程, 有效表征有机结合态磷肥的分子形态是深入研究其高效机理的重要前提和突破口。 长期以来, 磷肥形态表征多借助化学连续提取法, 将化学组成或分解矿化能力较为接近的一类化合物归为相同组分, 分别以依次渐强的化学提取剂分级提取[7]。 由于提取剂缺乏专一性及不同分级提取间的相互干扰等因素, 该方法得到的磷素分级仅具有操作意义, 并不能确切反映磷的真实化学形态, 在预测生物可利用性和环境行为方面存在偏差[8]。

液相磷-31核磁共振(P-NMR)技术成为当今有机磷形态表征的主流技术, 在土壤及肥料中有机磷的分子形态识别方面应用广泛, 近年来在样品前提取方法, 试验参数设定, 检测信噪比, 特征峰识别等方面都愈加完善[9]; 同时, 基于同步辐射的X射线吸收近边结构谱(XANES)技术可在分子水平上识别磷周围的局部结构和化学信息, 在非破坏性、 原位直接等方面体现出其他技术无法替代的优越性, 是甄别土壤、 肥料、 沉积物等环境介质中磷形态的有效手段[7]。 以上新兴技术各有所长, 又相互补充, 因而, 多种前沿技术联用成为土壤磷形态表征的发展趋势[2]。

该研究选取淀粉基有机结合态磷肥为研究对象, 利用先进的磷形态表征技术(P-NMR及K-edge XANES)在分子层面上对磷的赋存形态进行联合表征, 以期为后续深入其高效机理研究奠定基础。

1 实验部分
1.1 比色法测定总磷含量

准确称取0.5 g淀粉基磷肥的纯化样品与0.3 g Na2CO3于坩埚中, 加2 mL去离子水混匀, 在100 ℃下干燥后置于550 ℃的马弗炉中灼烧9 h, 消解完全后冷却, 取出, 以2 mL 25%的盐酸溶解熔块, 转移至容量瓶, 再以10 mL去离子水少量多次的洗涤坩埚, 洗液一并转移至容量瓶, 定容, 过滤后以钼酸铵比色法测定总磷含量。

1.2 液相磷-31核磁共振表征

取淀粉基磷肥的纯化样品2.0 g, 溶解于6 mL 0.01 mol· L-1的醋酸缓冲液(pH 6.9)中。 加入0.5 mg α -淀粉酶, 置于沸水水槽中加热10 min。 待冷却至70 ℃, 再加入1 mg α -淀粉酶, 置于70 ℃的恒温水槽中酶解2 h。 然后将反应液在沸水中加热10 min灭酶。 水解产物在-85 ℃条件下冷冻过夜后, 冷冻干燥至粉末, 冷藏待测。

将经冷冻干燥的α -极限淀粉糊精溶解于1.5 mL 45%的氘代二甲亚砜(DMSO)中, 沸水浴加热10 min。 加入1.0 mL氘水锁定信号, 另外, 为对不同磷形态进行准确定量, 加入120 μ g β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为内标物进行加标实验。 调节溶液pH为8.0± 0.1。

磷-31核磁共振图谱以500 MHz核磁共振仪(BRUKER AVANCE Ⅲ )采集。 采用BRUKER标准腔5 mm BBO探头, 循环延迟11 s, 采集时间0.67 s, 测定温度25 ℃, 扫描2 048次。 化学位移(ppm)均参照85%的正磷酸, 不同磷形态化学位移的确定参考文献[9], 峰面积以NUTS(Acorn NMR, Livermore CA, 2000 edition)积分计算, 根据各磷组分的峰面积计算各自的相对含量(%), 绝对含量(mg· kg-1)根据内标物的加标量进行校正。

1.3 磷的K-边XANES谱表征

磷的K-边XANES谱于加拿大光源SXRMB站采集。 储存环中电子能量为2.9 GeV, 最大束流强度为250 mA[10]。 选取如下含磷标准样品: 磷酸铝(AlPO4)、 羟基磷灰石[Ca5(PO4)3OH, HAP]、 磷酸钙[Ca3(PO4)2]、 磷酸铁(FePO4)、 肌醇六磷酸(Phytic acid)。 磷标准样品图谱以电子产额模式采集, 供试磷肥样品谱以部分荧光模式(四元素荧光探测器)采集。 所有样品及标样谱在高真空环境下(< 10-7 Torr)多次扫描取平均。 所有谱图以AlPO4的一阶导数的首峰位置为2 149 eV校正能量[2]。 XANES谱以Athena(8.050)去背景, 归一处理。

2 结果与讨论
2.1 淀粉基磷肥总磷含量分析

以灼烧-比色法分析得到的淀粉基磷肥及原料淀粉中总磷含量如表1所示, 淀粉原料的初始磷含量仅为121 mg· kg-1, 这与文献报道的天然淀粉含磷量相符[11]; 合成的淀粉基磷肥含磷量高达5 500 mg· kg-1, 较合成前的淀粉磷含量提升了45倍以上, 为其施用到农田后的磷肥肥效提供了物质基础。 然而, 磷肥肥效不仅受总量影响, 更重要的是不同磷形态的组成特征, 决定了其进入土壤后的形态转化过程和作物有效化机制。 因此, 需进一步采用先进技术对该磷肥中磷的分子形态加以表征。

表1 原料淀粉及淀粉基磷肥的总磷含量(平均值± 标准误) Table 1 Total phosphorus concentrations of native starch and starch-bound phosphorus fertilizer (mean± standard error)
2.2 液相磷-31核磁共振研究

供试淀粉基磷肥的磷-31核磁共振图谱如图1所示。 内标物NAD表现出一组尖锐的四重峰, 其化学位移分别是: -10.73, -10.84, -10.97, -11.08 ppm(图1), 与前人报道一致[12]。 通过加标实验得到供试淀粉基磷肥中总磷含量为5 218 mg· kg-1, 该结果与化学灼烧-钼酸盐比色测定的总磷含量(5 500 mg· kg-1)一致, 表明本研究中的前处理方法和核磁共振分析技术是定量分析肥料样品中磷形态的有效手段。

图1 供试淀粉基磷肥的液相磷-31核磁共振谱Fig.1 Solution P-NMR spectra of the starch-bound P fertilizer

由图1可知, 合成淀粉基磷肥中的磷并非以单一形态赋存, 多种磷形态的特征峰相互叠合, 主要出现在1.0~5.0 ppm之间, 包括正磷酸单酯(2.5~5.0 ppm)、 正磷酸盐(2.4 ppm)、 和正磷酸二酯(2.3~1.0 ppm)。 其中, 以正磷酸单酯为主, 含量高达3 955 mg· kg-1, 占到总磷的75.8%(表2)。 图1中化学位移在3.7, 4.7和4.9 ppm处的特征峰可能对应酯化反应发生在淀粉分子葡萄糖单元中不同碳原子(C-6, C-3和C-2)的正磷酸单酯[12]。 通过积分面积计算可知, 供试肥料样品中的正磷酸单酯主要为葡萄糖单元C-6和C-3上的酯化产物, 两者含量基本相当, 仅有痕量以C-2上的酯化产物赋存。 另外, 供试样品中还有17.3%的磷以正磷酸二酯形态赋存(表2), 可能包含磷脂、 交联淀粉磷酸酯等[12, 13]。 总体而言, 无机正磷酸盐含量较少, 仅占总磷的6.9%(表2)。

表2 液相磷-31核磁共振谱测得淀粉 基磷肥的磷形态组成及含量 Table 2 Phosphorus species and concentrations in the starch-bound phosphorus fertilizer by solution P-NMR spectroscopy

正磷酸二酯中磷酸基团同时与两个羧基碳结合, 易于破坏, 因而一般认为, 其生物可利用性强于正磷酸单酯, 在土壤中正磷酸二酯稳定性低, 易受细菌等微生物矿化分解成无机正磷酸盐而被土壤组分固定[13]。 由此推测, 该供试淀粉基磷肥主要以正磷酸单酯赋存, 可使其在土壤中以有机形态维持较长时间, 在向根际运移过程中更大程度的抵御土壤固定, 进而有利于到达根际。 由于根际微生物种群结构较土体土壤丰富, 降解能力更强, 有机结合态磷肥一旦进入根际, 易被微生物矿化降解而供给作物磷吸收, 这很可能是其磷肥肥效高的原因之一。

2.3 磷的K边X射线吸收近边结构谱研究

供试淀粉基磷肥样品及磷标准样品磷的-K边XANES谱如图2所示。 淀粉基磷肥样品谱及标样谱均在2 152.2及2 167.8 eV处有特征峰b及特征峰e。 峰b的产生是由磷的1s电子到3p空轨道跃迁所致, 而峰e是正磷酸盐中氧原子的多重散射所致[14]。 磷酸铁的标样谱在2 148.1 eV处呈现边前峰(峰a, 图2), 该峰主要是由磷的1s电子向过渡金属铁的3d, 氧的2p与磷的3p电子杂化形成的反键轨道跃迁所致[7]。 另外, 特征峰c(2 154.6 eV)及特征峰d(2 162.4 eV)是不同溶解度钙结合态磷的特征峰, 磷酸铝则呈现钙磷的特征峰d但缺乏铁磷的边前锋a[14]。 相对而言, 植酸磷的谱图呈现较宽的峰b, 并无其他明显特征峰[2], 以上结果与前人报道一致[14], 表明标样谱可为样品中磷形态表征提供可靠依据。

图2 供试淀粉基磷肥及磷标准样品磷的K边XANES谱
短线表示不同磷形态的特征峰: a: 铁磷; b: 吸收边; c, d: 钙磷; e: 氧多重散射Fig.2 Phosphorus K-edge XANES spectra for the starch-bound P fertilizer and selected P standards
The dashed lines indicate spectral features for different P species: a: Fe-P; b: Absorption edge; c, d: Ca-P; e: Oxygen oscillation

通过指纹图谱比对, 供试淀粉基磷肥样品的XANES谱图与有机植酸磷的谱图最为相似, 并未呈现无机铁、 铝、 钙结合态磷的特征峰(图2), 表明淀粉基磷肥中的磷主要以有机结合态赋存, 与液相磷-31核磁共振的结果一致。

3 结论

供试的新型高效淀粉基磷肥总磷含量约为5 218 mg· kg-1, 其中以有机磷形态为主, 无机磷含量仅占总磷的6.9%。 有机形态以正磷酸单酯为主, 占总磷比例高达75.8%, 正磷酸二酯含量为17.3%。 鉴于土壤中正磷酸单酯的稳定性较正磷酸二酯更高, 该供试磷肥以正磷酸单酯为主要磷形态的特点一定程度上可抵御微生物矿化及土壤固定, 有利于向根际运移, 并进一步通过根际微生物矿化降解供给作物磷素需求。 在此基础上, 后续将进一步深入研究有机结合态磷肥施用后在土壤中的形态转化及高效机制。

致谢: 感谢加拿大半干旱草原农业研究中心(SPARC)研究员 Barbara Cade-Menun在数据解析中给予的帮助和建议。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Sattari S Z, Bouwman A F, Giller K E, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(16): 6348. [本文引用:1]
[2] Liu J, Hu Y F, Yang J J, et al. Environmental Science & Technology, 2015, 49(1): 168. [本文引用:4]
[3] Withers P J, Sylvester-Bradley R, Jones D L, et al. Environmental Science & Technology, 2014, 48(12): 6523. [本文引用:1]
[4] Dalai R C. Advances in Agronomy, 1977, 29: 83. [本文引用:1]
[5] Hill M W, Hopkins B G, Jolley V D, et al. Journal of Plant Nutrition, 2015, 38(9): 1416. [本文引用:1]
[6] LI Ju-mei, MA Yi-bing, WEN Fang-fang(李菊梅, 马义兵, 文方芳). Chinese Patent(中国专利). CN101172886, 2008. [本文引用:1]
[7] LIU Jin, YANG Jian-jun, LIANG Xin-qiang, et al(刘瑾, 杨建军, 梁新强, 等). Chinese Journal of Applied Ecology(应用生态学报), 2011, 22(10): 2757. [本文引用:3]
[8] Liu J, Yang J J, Cade-Menun B J, et al. Journal of Environmental Quality, 2013, 42(6): 1763. [本文引用:1]
[9] Cade-Menun B J. Geoderma, 2015, 257: 102. [本文引用:2]
[10] Liu J, Yang J J, Liang X Q, et al. Soil Science Society of America Journal, 2014, 78(1): 47. [本文引用:1]
[11] Kasemsuwan T, Jane J L. Cereal Chemistry, 1996, 73(6): 702. [本文引用:1]
[12] Zhao J, Chen Z, Jin Z, et al. Carbohydrate Polymers, 2015, 131: 424. [本文引用:3]
[13] Dodd R J, Sharpley A N. Resources, Conservation and Recycling, 2015, 105, Part B: 282. [本文引用:2]
[14] Prietzel J, Duemig A, Wu Y, et al. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 2013, 108: 154. [本文引用:3]