透射电子显微镜(JEOL-2100F, 日本电子株式会社), X射线衍射仪(D/MAX-2500, 日本Rigaku公司), 荧光光谱仪(Edinburgh FLSP920, 英国Edinburgh Ins), 荧光显微镜(BX51, Olympus), 优普系列超纯水器(UPH-IV-10T, 四川优普超纯科技有限公司), 分析天平(XS205DU, Switzertand), 数控超声波清洗器(KQ-250DB, 昆山市超声仪器有限公司), 恒温加热磁力搅拌器(CL-2, 巩义市予华仪器有限责任公司), 电热恒温鼓风干燥箱(DHG-940A, 巩义市予华仪器有限责任公司), 台式离心机(DTS-4A, 上海安亭科学仪器厂), 回流装置(蒸醇/回流用冷凝管, 500 mL三颈瓶, 烧杯铁架台, 软管, 三角锥瓶, 温度计)。

醋酸锌(Zn(CH₃COO)₂· 2H₂O, 99.0%, 北京化工厂), 氢氧化锂(LiOH· H₂O, 90.0%, 天津市化学试剂三厂), 乙醇(CH₃CH₂OH, 99.7%, 北京化工厂), 正己烷(C₆H₁₄), 碘(I₂, 北京化工厂), 镁条(Mg), 芦荟大黄素(C₁₅H₁₀O₅, 97.0%, 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司), 所有溶液的配置均使用超纯水, 芦荟的品种是库拉索芦荟。

1.2.1 ZnO 纳米粒子的制备与表征

ZnO纳米粒子的制备使用溶胶-凝胶法: 将打磨好的镁带剪成小段与适量的碘混合, 放入三颈瓶中, 倒入100 mL普通乙醇。 升温70 ℃搅拌加热, 至溶液反应呈灰白色时, 加入400 mL普通乙醇, 继续搅拌加热温度设置为85 ℃, 得到绝对乙醇密封保留。 取绝对乙醇100 mL与一定量的醋酸锌一同放入已经固定好的三颈瓶中, 80 ℃搅拌回流3 h, 至溶液透明澄清, 得到醋酸锌的醇溶液。 取100 mL绝对乙醇与适量的氢氧化锂冰水浴超声, 至完全溶解, 得到氢氧化锂的醇溶液。 将已制得的LiOH醇溶液按照摩尔比1.4: 1的比例加到Zn(CH₃COO)₂醇溶液中, 冰水浴超声约20 min, 得到氧化锌胶体, 按体积比4: 1的比例加入正己烷, 静置产生沉淀。 去除上清液, 将沉淀离心、 清洗、 干燥, 最后在研钵中研磨得到ZnO纳米粒子。 利用透射电子显微镜和X射线衍射仪来表征ZnO纳米粒子的形貌和尺寸。

1.2.2 荧光显微镜观察AE分布

用刀片切取新鲜库拉索芦荟叶片, 纯净水连续冲洗几次, 去掉芦荟叶肉中透明的储水组织, 通过徒手切片法分别采用横向和纵向的方式切取芦荟叶片薄片, 长约10 mm, 宽约5 mm, 厚约200 μ m, 放在干净的载玻片上, 立即置于荧光显微镜下, 分别在白光(下照明)、 蓝光(460~490 nm)和紫外光(330~385 nm)下观察AE等蒽醌类化合物在芦荟叶片中的分布并拍照。

1.2.3 ZnO纳米粒子对AE颜色的影响

切下一片库拉索芦荟叶片放到烧杯里, 收集芦荟叶片同化组织的渗出物, 这种物质的主要成分是AE。 加入一定比例的纯净水将AE稀释, 得到新鲜的AE溶液。 分别配置6和10 mg· L^-1的ZnO纳米粒子悬液, 超声30 min, 与AE溶液按一定比例混合作为实验组。 没有加ZnO NPs悬液的AE溶液是对照组。 将对照组和实验组排列在一起, 先后置于紫外灯(254 nm, 30 W)和黑暗条件下, 6 h内每隔一定时间拍照观察其颜色的变化情况。

1.2.4 ZnO纳米粒子对AE光谱的影响

配置10 mg· L^-1的AE溶液, 放入搅拌子超声5 min, 加热30 min至几乎完全溶解, 温度设定为50 ℃, 研究表明此温度几乎不会使芦荟苷遭到破坏^[12]。 另配置10 mg· L^-1的ZnO纳米粒子悬液, 超声30 min。 将ZnO纳米粒子与AE溶液混合作为实验组, AE溶液作为对照组, 在日光灯下放置, 隔一小时测试一次荧光光谱, 设置激发光波长是460 nm, 波长范围选择480~800 nm。

图1(a)是溶胶-凝胶方法获得的ZnO纳米粒子的XRD图, 图1(b)是六角纤锌矿结构的ZnO纳米粒子的标准图谱(PDF#36-1415)。 通过对比可以发现, 我们制备的ZnO纳米粒子为六角纤锌矿结构。

图1

Fig.1

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	图1 ZnO 纳米粒子的X射线衍射谱Fig.1 XRD spectrum of ZnO nanoparticles

图2(a)为溶胶-凝胶法得到的ZnO纳米粒子的TEM图, 图2(b)是局部放大图, 从图中可以看出, 制备的ZnO纳米粒子均呈球形结构, 分散性良好, 晶体粒径的大小约为5 nm左右, 这与Scherrer公式从XRD计算得到的结果基本是一致的。

图2

Fig.2

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	图2 ZnO 纳米粒子的透射电镜照片Fig.2 TEM photographs of ZnO nanoparticles

在荧光显微镜下, 芦荟叶片的横切面分别经白光(下照明)、 蓝光和紫外光照射, 显微图像如图3(a), (b)和(c), 可以观察到白光下芦荟叶片的储水组织接近透明无色; 向储水组织凸起的部分是维管束, 呈现深褐色; 组成同化组织的绿色细胞清晰可见, 细胞内部是近似透明的, 因为内部有大型的液泡结构。 在蓝光照射下, 芦荟叶片中同化组织细胞发出红色的荧光, 这是因为其内部含有叶绿体, 维管束发出亮黄色荧光, 储水组织几乎无色。 图3(b)可以清晰地看到维管束和靠近维管束一侧的同化组织与储水组织的交界处有发亮黄色荧光的小球点, 但是与维管束周围的荧光相比要弱, 维管束处黄色荧光最强。 这是因为同化组织细胞被认为是AE等蒽醌类物质合成的场所, 然后转移到维管束周围的大型细胞内储存, 即所谓的芦荟素细胞^[13]。 图3(c)是在紫外光照射下, 可以看到维管束细胞内发出橙色的荧光, 同化组织和储水组织的接触面以及一些同化组织细胞中也会有橘色的荧光, 但是强度比维管束外侧细胞内的弱。

图3

Fig.3

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	图3 荧光显微镜下观察芦荟叶片中AE的分布Fig.3 The distribution of aloe-emodin in aloe leaves under fluorescence microscope

在荧光显微镜下, 芦荟叶片的纵切面分别在白光(下照明)、 蓝光和紫外光照射下, 显微图像如图3(d), (e)和(f), 发现同化组织发红色的荧光, 维管束均呈现带状分布, 在白光下是深褐色带状[图3(d)], 蓝光下是亮黄色带状分布[图3(e)], 紫外光下维管束周围有发橙色荧光的小球点[图3(f)]。 与横切面不同的是, 从纵切面的角度观察可以更清晰全面地了解AE在叶片中的分布情况。

2.3.1 暗处理

在暗条件下经ZnO纳米粒子处理后AE溶液颜色的变化情况如图4。 对照组是不加ZnO纳米粒子的AE溶液, 呈现淡黄色, 随着时间增加, 颜色几乎没有发生变化。 加入6与10 mg· L^-1的ZnO 纳米粒子的AE溶液, 随着时间的增加, 颜色变化趋势是淡黄色、 橙黄色、 橙色。 不同的是, 加入10 mg· L^-1的ZnO纳米粒子的AE溶液的颜色在放置3 h后就变成了橙色, 颜色的变化速度更快。 说明ZnO纳米粒子与AE发生了相互作用, 导致溶液的颜色由淡黄色渐渐向橙色转变, 并且相对高浓度的ZnO 纳米粒子会加快AE溶液的颜色变化。

图4

Fig.4

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	图4 暗处理下ZnO 纳米粒子对AE溶液颜色的影响Fig.4 Effect of ZnO nanoparticles on the color of Aloe-emodin solution under dark treatment

2.3.2 紫外光照射

紫外光照射后AE溶液颜色的变化趋势如图5。 对照组是不加ZnO纳米粒子的AE溶液, 溶液颜色是淡黄色, 随着时间增加, 溶液颜色没有发生变化; 加入ZnO纳米粒子后, 随着作用时间增加逐渐向玫红色转变。 因为溶液的正上方对着紫外灯, 所以从对照组来看, 颜色的变化是从溶液的液面开始, 随后溶液的内部也逐渐变成玫红色。 而加入6和10 mg· L^-1的ZnO纳米粒子的AE溶液颜色的变化趋势是淡黄色、 橙黄色、 橙色、 橙红色, 与对照组相比, 颜色改变在溶液内部和表面同时发生, 说明ZnO纳米粒子是导致溶液颜色发生变化的原因。 而且对照组溶液颜色随时间增加变成了玫红色, 实验组溶液颜色随着时间增加变成了橙红色, 即不加ZnO纳米粒子的AE溶液与加入ZnO纳米粒子的AE溶液的颜色变化趋势不同, 说明ZnO纳米粒子能够导致AE溶液的颜色发生变化, 并且与紫外光引起的颜色变化是不同的。

图5

Fig.5

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	图5 紫外光照射下ZnO 纳米粒子对AE溶液颜色的影响Fig.5 Effect of ZnO nanoparticles on the color of Aloe-emodin solution under ultraviolet light

对比黑暗条件与紫外光处理后AE溶液颜色的变化情况, 我们发现黑暗条件下, 不加ZnO纳米粒子的AE溶液颜色不随时间变化。 紫外光照射时, 由于AE结构的特点^[14], 导致其性质不稳定, 在紫外光的作用下, 与溶解氧发生如下反应:

分子结构中的酚羟基被氧化成羰基, 结果导致溶液颜色由淡黄色变成玫红色。

但是加入ZnO 纳米粒子后, 黑暗条件下, 溶液颜色随时间增加由淡黄色变成橙黄色; 紫外光处理后, 溶液颜色的变化趋势是淡黄色、 橙黄色、 橙色、 橙红色。 可以发现此时ZnO纳米粒子是导致AE溶液颜色变化的主要原因, 但是紫外光照射会加快溶液颜色的变化。 这可能是因为ZnO 纳米粒子在水溶液中溶解形成氢氧根离子, 可以与AE发生如下反应:

分子中的酚羟基变成— O— , 导致溶液颜色呈现上述变化。 在紫外光的照射下, ZnO纳米粒子可能发生光催化, 使其表面产生更多的羟基自由基, 加快AE分子结构中的酚羟基的反应。

上述两种变化都会使得AE苯环上的羰基与酚羟基的数目和位置发生变化, 因为羰基是AE的生色团, 酚羟基是AE的助色团, 它们的变化都会导致AE发生变色反应。 颜色变化的大致规律是助色团愈多, 颜色愈深。 以上说明AE与ZnO纳米粒子发生反应后, 可以减少溶液中的超氧自由基和羟基自由基, 起到抗氧化的作用, 所以在实际应用中, AE也被广泛地用作抗氧化剂的成分^[15]。

对于酚类物质的抗氧化性质之前也有过报道。 Ignat等^[16]发现酚类物质的抗氧化活力取决于其结构, 特别是羟基的位置和数目以及苯环上取代基的性质。 而且抗氧化强度通常随着羟基个数的增加而增加, 芳族羟基化合物的抗氧化效果具有很大的研究价值与应用价值^[17]。 Lien等^[18]也发现不同的黄酮类物质的抗氧化能力主要由黄酮类物质分子上羟基的数量和匣置决定。

图6是AE水溶液在空气中放置0, 1, 2, 3, 4, 5和6 h后的发射光谱。 其中图6(a)是AE溶液的发射光谱随时间的变化规律, 图6(b)是将得到的光谱分峰拟合后的结果, 图6(c)是540与580 nm处的荧光峰比值随时间的变化规律。 可以发现, 随着时间增加, 荧光峰的位置基本没有发生变化, 分别是500, 540, 580和620 nm, 但是强度发生了相对变化。 虽然540 nm处的峰值与580 nm处的峰值均在逐渐升高, 但是540 nm处的峰值升高的幅度大于580 nm处的峰值, 即540与580 nm处的荧光峰比值逐渐增加。 由于AE与氧发生反应, 使得分子中的羟基变成羰基, 由C─O变成了C=O , 这些基团中含有π 电子, 可以发生π → π ^* 跃迁。 芦荟大黄素的荧光光谱中, 540 nm处的荧光峰是由于C=O 形成的大共轭π 电子结构, 发生π → π ^* 跃迁产生的。 而580 nm处的荧光峰是由于— O— 的非成对n电子被激发后, 发生n→ π ^* 跃迁到激发态, 再发生辐射跃迁产生荧光。 因此, 随着时间增加, 540与580 nm处荧光强度的比值增加的原因可能是AE苯环上C=O 增多, 导致π → π ^* 跃迁增加, 进而540 nm处的发光峰强度增加。

图6

Fig.6

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	图6 AE溶液间隔不同小时的荧光光谱Fig.6 Fluorescence spectra of aloe-emodin solution at different intervals

经ZnO纳米粒子处理0, 1, 2, 3, 4, 5和6 h后, AE溶液的荧光光谱如图7。 图7(a)是在ZnO纳米粒子作用下, 随着时间增加, AE溶液发射光谱的变化趋势, 图7(b)是将得到的光谱分峰拟合后的结果, 图7(c)是540与580 nm处的荧光峰的比值随时间的变化规律。 从光谱中可以发现, 有四个荧光峰, 分别为500, 540, 580和630 nm, 与没有加入ZnO纳米粒子的AE溶液相比, 540和580 nm处的峰值强度比值均随时间的增加而增加, 但是强度比不加ZnO纳米粒子的情形大。 我们发现ZnO纳米粒子使AE溶液颜色发生变化的同时, 溶液的PH值也在增大, 说明ZnO纳米粒子在溶液中发生光催化, 粒子表面产生羟基和超氧自由基, 这些基团具有强氧化性, 可以催化芦荟大黄素发生氧化反应, 使得AE分子中产生更多的羰基, 羰基中的C=O 含有π 电子结构, 增加π → π ^* 跃迁, 最终导致540 nm处的荧光峰强度增加。

图7

Fig.7

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	图7 ZnO 纳米粒子作用下AE的荧光光谱Fig.7 Fluorescence spectra of aloe-emodin under the action of ZnO nanoparticles

将激发波长设定为360 nm时, AE溶液、 ZnO纳米粒子处理后的AE溶液与ZnO纳米粒子悬液的荧光光谱如图8。 从图中可以明显地看出, ZnO纳米粒子作用于AE溶液后, 与AE溶液的荧光峰比较, 500~630 nm间的荧光峰强度均减弱; 并且540与580 nm峰值相比接近于1, 而不加ZnO纳米粒子的峰值相比小于1, 变化幅度很大, 说明ZnO纳米粒子会使AE溶液540与580 nm处的荧光峰比值增大, 可能是因为ZnO纳米粒子与AE发生氧化反应, 导致助色团与生色团的数量和位置发生变化。

图8

Fig.8

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	图8 AE溶液的荧光光谱Fig.8 Fluorescence spectra of aloe-emodin