绿色植物光合作用能量的转换过程包括原初反应、 电子传递和光合磷酸化和碳同化三个阶段。 其中, 叶绿素荧光在原初反应过程中产生, 它是由叶绿素分子吸收光能后到达激发态重新发射比吸收光波长更长、 能量更低的光子所产生, 如图1。 1931年, Kautsky等发现叶绿素荧光现象, 为研究植物光合作用提供了理论基础。 目前, 叶绿素荧光技术主要以Bulter的光合作用能量竞争模型为基础, 即叶绿素分子吸收的光能通过光合系统的光化学反应、 热散失和叶绿素荧光三个途径释放能量, 通过检测植物的叶绿素荧光能间接反映植物光合系统对光能的吸收、 传递、 耗散和分配。 1986年, 德国乌兹堡大学的Schreiber发明了基于饱和脉冲理论的脉冲振幅调制叶绿素荧光仪, 使得光化学猝灭和非光化学猝灭的测量成为可能, 实现了不同环境状态下植物荧光信号的检测^[13]; 随后德国的Walz、 英国的Hansatech、 捷克的Photo Systems Instruments等公司相继开发了商用的叶绿素荧光仪和成像系统。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 叶绿素分子的能级变[12]Fig.1 The energy level of the chlorophyll in PSII

叶绿素荧光成像系统克服了传统荧光仪有限点测量的缺点而被逐渐广泛应用。 系统一般包括激发光源、 滤波片、 检测器、 计算机和控制模块等, 可以获得植物叶片或冠层的叶绿素荧光信号, 结合数字图像处理技术可分析荧光强度在空间的分布情况, 如图2。 不同的测量方案可以获得不同的荧光诱导猝灭曲线, 其中光源和光照模式的设置是方案选择的关键。 光源的主要类型有测量光、 光化光与饱和光。 测量光用于激发暗适应后最小荧光(Fo), 通常选择蓝光或红光; 光化光是一种近似自然光的光源, 光化光的光强与自然光十分相近, 研究人员通常选择蓝光或红光使植物的光合系统产生实质上的光化学反应; 饱和光的光强度超过植物光合系统的捕光能力, 使叶绿素荧光强度达到最高, 通常选择白光(> 8 000 K)^[14]。 不同光照模式可以获取不同的光合作用信息: 微秒级或者更小的闪光(Flash)可以观测PSII供体和受体侧电子传递反应; 毫秒级的饱和光脉冲(Pulse)能够得到光合电子传递链(electron transport chain, ETC)的信息; 5~10 min的光照可以获得稳定的光合活性信息^[15]。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 基于饱和脉冲理论的脉冲振幅调制荧光成像系统 1: 激发光源(光化光、 饱和光、 测量光); 2: 控制模块; 3: 检测器; 4: 计算机Fig.2 A pulse amplitude modulation (PAM)-based chlorophyll fluorescence imaging system 1: Excitation light source (actinic light, saturation light, measuring light); 2: Control module; 3: Detector; 4: Computer

图3为典型脉冲调制(pulse amplitude modulation, PAM)叶绿素荧光系统获得的叶绿素荧光猝灭曲线, 可以获得大量与光合作用相关联的荧光参数, 详见表1所示。 暗适应后最小荧光(Fo)是植物经过充分暗适应后光合反应中心处于完全开放状态时, 打开测量光后获取的荧光强度。 暗适应后最大荧光(Fm)是植物经过充分暗适应后施加饱和脉冲后使光合反应中心处于完全关闭状态时所获取的最大荧光强度, 根据能量竞争模型, 此时天线色素获取的能量主要转化为荧光和热能, 即光合作用利用率最低。 光适应下最大荧光(Fm')是植物叶片在光适应条件下施加饱和脉冲使光合反应中心处于完全关闭状态时获取的荧光强度。 光适应稳态荧光(Fs)是植物叶片光适应下达到稳定状态时获取的荧光强度。 光适应下最小荧光(Fo')是植物叶片在光适应条件下光合反应中心处于开放最大状态时获取的最小荧光强度。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 基于饱和脉冲理论的脉冲振幅 调制的叶绿素荧光猝灭曲线Fig.3 A quenching curve based on the pulse amplitude modulation (PAM) technique

光化学猝灭反映了PSII原初电子受体Q_A的还原状态, 可以衡量PSII反应中心的开放程度; 非光化学猝灭反映了天线色素吸收的光能用于热耗散的部分, 可以评估植物的光保护能力。 光化学猝灭参数一般与参数Fm', Fs相关, 包括最大光量子效率(Fv/Fm)、 光量子效率(Φ PSII)、 电子传递速率(ETR)、 稳态光适应光化学猝灭(qP)、 基于Lake模型的稳态光适应光化学猝灭(qL)等。 参数Fv/Fm反映了PSII的最大光化学量子产量, 对逆境胁迫的响应较为敏感, 在正常状态下植物的Fv/Fm维持在0.8~0.84之间。 参数Φ PSII是光照条件下光合反应中心的实际光化学量子产量, 用于衡量植株的实际光合效率。 Φ PSII可以用来计算电子传递速率ETR, 由公式ETR=c· Φ PSII· PPFD得到, 其中系数c表征吸收的光子能量在PSII与PSI之间的分配情况, 当c=0.5时表示吸收的光子能量平均分配给PSII和PSI; PPFD表征吸收光的光量子通量, 单位为 μ mol· m^-2· s^-1。 参数qP为光适应光化学猝灭, 基于常见的沼泽(Puddle)模型^[16], 反映了PSII反应中心的开放程度。 参数qL是基于湖泊(Lake)模型^[17]的光适应下的光化学猝灭, 同样反映反应中心的开放程度^[18]。 非光化学猝灭参数主要有非光化光系数猝灭(qN)、 非光化荧光猝灭(NPQ)、 非光诱导猝灭(Φ NO)、 光诱导下猝灭的量子产额(Φ NPQ)。 前两者基于Puddle模型, 其中参数NPQ可反映PSII吸收的能量以热耗散形式释放的部分, 检测植物逆境响应的灵敏度高于qN^[15]。 后两者基于Lake模型, 参数Φ NO是植株的光合损伤指标, 参数Φ NPQ可以反映植株的光保护能力。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 常用的叶绿素荧光参数及其概念描述[19] Table 1 List of the commonly used chlorophyll fluorescence parameters and their definitions 参数 公式 概念描述 参数 公式 概念描述 Fo / 暗适应后最小荧光 ETR c· Φ PSII· PPFD 电子传递速率 Fm / 暗适应后最大荧光 qP (Fm'-Fs)/(Fm'-Fo') 稳态光适应光化学猝灭 Fm' / 光适应最大荧光 qL (Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')/ (Fo'-Fs) 基于Lake模型的稳态光 适应光化学猝灭 Fs / 光适应稳态荧光 NPQ (Fm-Fm')/Fm' 非光化荧光猝灭 Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm 最大光量子效率 qN (Fm-Fm')/(Fm-Fo') 非光化光系数猝灭 Fo' Fo/((Fv/Fm)+(Fo/Fm')) 光适应最小荧光 Φ NO 1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)) 非光诱导猝灭的量子产额 Φ PSII (Fm'-Fs)/Fm' 光量子效率 Φ NPQ 1-Φ PSII-Φ NO 光诱导下猝灭的量子产额

表1 常用的叶绿素荧光参数及其概念描述[19] Table 1 List of the commonly used chlorophyll fluorescence parameters and their definitions

叶绿素荧光成像技术提供了植物叶绿素荧光信号在二维空间上的分布信息, 如图4为拟南芥的叶绿素荧光图像。 叶绿素荧光图像结合数字图像处理技术可以较好地反映出光合作用在叶片或冠层水平上的时空异质性, 已广泛应用于植株非生物胁迫和生物胁迫检测, 如干旱^{[20, 21]}、 冻害^[22]、 细菌^[9]、 真菌^[23]及病毒胁迫^{[24, 25, 26]}等。 2012年, Sperdouli等获取了4周龄不同干旱胁迫程度下拟南芥的Fo, Fv/Fm, NPQ/4等叶绿素荧光图像, 分别从图像中选取了5个感兴趣区域(areas of interest, AOI): 叶片中心、 靠近叶基的两侧、 靠近叶端的两侧, 比较了不同干旱胁迫程度(轻度、 中度、 重度)对PSII的影响^[8]。 结果表明, 在干旱胁迫早期(轻度胁迫), 从叶绿素荧光图像中就能够观察到叶片的发病区域。 2015年Bresson等建立了Fv/Fm等图像的荧光强度分布的双峰之间距离的模型S值(S=(μ -μ _i)/(2σ _i)), 用以量化植株的光合异质性, 实现了干旱条件下植株的表型检测^{[20, 21]}。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 拟南芥叶绿素荧光图像Fig.4 Chlorophyll fluorescence images of Arabidopsis thaliana

通过图像融合方法可以获得更全面的表型信息。 以Matous等在2006年提出的线性融合方法为例^[26]: 首先选用序列浮动前向(sequential forward floating search algorithm , SFFS)算法选择特征图像; 然后利用线性判别分类器(linear discriminant classifier, LDC)对实验组植株和对照组植株进行分类, 最后利用线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA) 对荧光图像线性融合。 最终得到了实验组植株(病害、 冻害、 干旱胁迫)与对照组植株差异性最大的融合图像, 较于传统的叶绿素荧光参数图像, 融合的图像可以更早地实现病害、 冻害、 干旱胁迫的诊断^{[26, 27, 28]}。 对于结构复杂的植株, 叶绿素荧光成像系统仅能实现局部视角的测量从而损失大量有效信息。 Eguchi等尝试利用叶绿素荧光成像技术结合便携式扫描激光雷达技术获得整个植株的三维叶绿素荧光强度分布, 得到光合信息在整个植株上的空间变化^[29]。 该方法为解决因局部视角测量造成的叶绿素荧光信息的损失提供了思路。

非生物胁迫会导致植物的形态、 生理和生化发生变化, 影响植物正常的生长发育。 其中, 干旱胁迫、 盐胁迫及低温/高温胁迫等非生物胁迫能够影响植物的光合作用, 因此叶绿素荧光技术可应用于植物的非生物胁迫检测, 如表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 叶绿素荧光技术在非生物胁迫分析中的相关应用 Table 2 Survey of works on plant response to abiotic stress using chlorophyll fluorescence technique 非生物胁迫 植物 参数 参考文献 干旱胁迫 拟南芥 Fv/Fm, Φ PSII, Rfd, Φ NO, Φ NPQ, NPQ, 1-qP, qP [8, 20, 31, 34-35] 大麦 100个叶绿素荧光参数 [36] 番茄 Fv/Fm, Φ PSII, NPQ, ETR, qP [18, 30] 酸枣 Fv/Fm, NPQ, Φ PSII, qP [37] 枸杞 Fm, Fs, Fv/Fm, Φ PSII, qP, qN [38] 油菜 Fv/Fm [39] 低温/高温胁迫 小麦 Fv/Fm [40] 稻穗 Φ PSII, Fs [41] 豌豆 Fv/Fm, Φ PSII, Φ NPQ, qP [42] 拟南芥 Fo, Fm, Fs, Fv/Fm, Fs/Fo, Rfd [28, 33] 大麦 Fv/Fm [43] 番茄 Fv/Fm, Φ PSII, qP [44] 盐胁迫 拟南芥 Fv/Fm, Φ PSII, Φ NPQ, qP, Φ NO [45] 水稻 Fv/Fm [46-47] 芦竹 Fv/Fm, Φ PSII [32] 藻 Fv/Fm, Φ PSII [48-49] 苜蓿 Fv/Fm [50] 芒果树 Fo, Fm, Fo/Fm, Fv/Fm, Fv'/Fm', Φ PSII, ETR [51] 小麦 Fv/Fm [52-53] 杨梅 Fv/Fm, Φ NPQ [54]

表2 叶绿素荧光技术在非生物胁迫分析中的相关应用 Table 2 Survey of works on plant response to abiotic stress using chlorophyll fluorescence technique

分析表2可以看出, 最大光量子效率(Fv/Fm)、 光量子效率(Φ PSII)、 光适应光化学猝灭(qP)、 非光化荧光猝灭(NPQ)等荧光参数对植物非生物胁迫响应具有较好的指示性。 大部分非生物胁迫对植物的影响十分复杂, 集不同组织水平上的跨空间、 跨时间的反应于一体。 Bresson等于2014年指出不同基因型的番茄叶片的叶绿素荧光参数NPQ, Φ PSII, Fv/Fm分别在干旱胁迫的第7, 12, 14天可以检测到野生型与转基因叶片存在的显著性差异; 此外, 参数Fv/Fm也与植株干旱条件下的存活率相关^[31]。 表明叶绿素荧光技术可以从时间和空间尺度上实现对植株干旱胁迫的无损检测。 2017年Pompeiano等利用叶绿素荧光技术研究芦竹对盐胁迫的响应, 该研究发现在盐胁迫42天后芦竹的光合效率不受影响, 但参数Φ PSII, Fv/Fm在盐胁迫至49天后出现了下降^[32]。 低温或高温胁迫皆会造成植物减产, Mishra等在2014年利用融合图像方法对不同基因型拟南芥在低温胁迫下的表型进行了研究, 通过线性融合经序列浮动前向选择算法选取的三张荧光猝灭过程中不同时间点的荧光图像, 能够加强对照组与实验组的区分度, 可实现耐寒性基因型植株的筛选^[33]。

叶绿素荧光技术在生物胁迫研究中应用广泛, 可检测由病毒、 细菌和真菌感染引起的生理状态变化, 如表3。 因此, 对生物胁迫的早期检测可以尽早控制病情发展, 提高农业生产效率并为农作物的品质安全提供保障。

在生物胁迫检测中, 叶绿素荧光参数包括最大光量子效率(Fv/Fm)、 非光化荧光猝灭(NPQ)、 光量子效率(Φ PSII)等对生物胁迫具有较好的灵敏度, 能实现对染病植株与健康植株的早期识别, 也能定量分析植株的染病程度。 2009年Mandal等研究发现轻度感染霜霉病与重度染病的车前草叶片的Fv/Fm值相较于健康叶片分别低了24.39%和44.90%^[55]。 2011年Pineda等利用叶绿素荧光成像技术分析了两种毒性不同的烟草花叶病毒对烟草的影响, 通过比较常用叶绿素荧光参数图像与融合的图像对染病叶片的诊断效果, 结果发现, 融合的图像比传统叶绿素荧光参数图像能更早实现对染病烟草的检测^[56]。 2011年, 陈兵等利用叶绿素荧光技术检测了棉花叶片黄萎病, 研究表明叶绿素荧光参数与染病程度相关性较好^[57]。 同年, Elke等利用叶绿素荧光和高光谱成像技术分析黄色镰刀菌侵染小麦麦穗后对小麦光合作用的影响, 基于参数Fv/Fm建立的线性模型, 可以实现轻度(0~10%)、 中度(40%~50%)和重度(70%~90%)不同染病程度的小麦麦穗的分类, 分类精度最高可达80%, 但该方法不适用于小麦生长81阶段(BBCH代码)后^[58]。 2013年Tung等利用叶绿素荧光成像技术检测烟草炭疽病, 以Fv/Fm图像量化分析烟草染病程度(染病、 未显症染病、 健康), 表明叶绿素荧光成像技术可实现染病程度检测^[24]。 2017年Cen等探讨叶绿素荧光成像技术诊断柑橘黄龙病的潜力, 文章通过比较不同特征选择方法(随机蛙跳算法、 顺序前进法、 蒙特卡罗无信息变量消除法)获得荧光特征对柑橘黄龙病的灵敏度, 将所选荧光参数作为支持向量机分类器的输入变量, 建立了柑橘叶片黄龙病诊断模型(健康、 染病、 缺素), 模型诊断精度最高可达97%^[59]。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 叶绿素荧光技术在生物胁迫分析中的相关研究 Table 3 Survey of works on plant response to biotic stress using chlorophyll fluorescence technique 生物胁迫 植物 参数 参考文献 病毒 烟草 Fv/Fm, NPQ, Φ PSII [27, 56, 60] 黄瓜叶片 504~900 nm波段的光谱 真菌 鳄梨 Fv'/Fm', Fs/Fo [61] 小麦 Fv/Fm [58] 车前草 Fv/Fm, Φ PSII [55] 棉花叶 Fm, Fv/Fm, Φ PSII, Fv, Fm/Fo, Fv/Fo, Fo [57] 人参 Φ NO, Fv/Fm [62] 小麦 Fv/Fm [63] 烟草 Fv/Fm, NPQ, Φ PSII [24] 细菌 柑橘 Fo, Fv/Fo, Fv/Fm, NPQ [59] 拟南芥 Fv/Fm, Rfd, NPQ [9]

表3 叶绿素荧光技术在生物胁迫分析中的相关研究 Table 3 Survey of works on plant response to biotic stress using chlorophyll fluorescence technique

分子标记辅助选择法在植物育种中的应用越来越普遍, 它可以从分子水平上准确地分析植株的遗传组成从而实现分子育种, 筛选对非生物胁迫和生物胁迫耐受性好、 产量高的基因型。 该方法不仅需要应用基因功能知识和重组DNA技术, 而且也需要高通量植物表型技术来解析不同功能基因的解剖、 生理、 生化表型性状^[64]。

叶绿素荧光技术提供了与光合系统相关的信息, 为作物优良性状的筛选提供了理想的平台。 如2015年Estrada研究温度和水分两个环境因子对六种基因型蓝莓的影响^[65]; 2017年Zhou等利用叶绿素荧光成像技术检测在干旱和热复合胁迫下三个品种番茄的生理变化, 主要选用Φ PSII, NPQ, ETR和qL等参数, 表明番茄生理响应与干旱、 高温和复合胁迫的差异和联系, 对干旱、 高温和复合胁迫下耐盐番茄品种的选育具有重要意义^[66]; 2014年Chen等利用叶绿素荧光成像技术并结合其他成像技术建立了一个全面的高通量植物表型数据分析架构, 实现了在同一时段内从多源图像信息中提取大量表型性状特征, 为揭示复杂农艺性状的遗传机制打下基础^[36]。 此外, 在植物的光合作用和产量的提高方面也有相关应用, 如光量子效率(Φ PSII)可以用来评估CO₂固定的光能利用效率和干物质积累^[67]。