汞离子标准液(1 000 μ g· mL^-1)购于国家标准物质中心。 Tris-HCl等其他盐购自Sigma-Aldrich; 盐酸(HCl)、 乙醇和其他有机物购自北京化工厂; 所有溶液均使用分子生物级水制备(Corning Cellgro, NY, USA); 紫外分光光度计(UV)型号为日本日立U-3900; 荧光分光光度计为日立公司F-7000。 所有核酸序列(HPLC纯化)均购自上海生工, 具体名称与碱基序列如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 汞选择性寡核苷酸探针序列 Table 1 Mercury specific oligonucleotide sequences 编号 名称 序列(5'— 3') 长度 /nt 参考 文献 1 Tn Tn n 2 DAPI GGGT10CCC 16 [18] 3 Chain1 GTGACCAT5GCAGTG 18 [17] Chain2 CACTGCT5TGGTCAC 18 4 Rod1 CTTGTCAGCTTGGCTTTGT 19 [15] Rod2 ACTTTGCCTTGCTGACTTG 19 5 SWCT1 TTTCATTCCTTTGTTGATTC 20 [16] SWCT2 GTTTCTTCTTTGGTTTGATT 20

表1 汞选择性寡核苷酸探针序列 Table 1 Mercury specific oligonucleotide sequences

SYBR Green I购于Sigma-Aldrich公司, 保存于-20 ℃条件下, 使用前对其进行短暂离心(此处不应使用玻璃容器, 染料可能会吸附到玻璃容器表面), 再使用1X TBE缓冲液(89 mmol· L^-1 Tris碱, 89 mmol· L^-1硼酸和1 mmol· L^-1 EDTA, pH 8.0)以1∶ 10 000缓冲液(暨1 mL染料原始溶液可以制备10 L的染料溶液)的稀释比例制备SG I染料储备溶液。

染料/碱基比例(dye base pair ratio, DBPR)为初始反应体系中每摩尔DNA碱基 (base pair, bp)所对应的染料(dye)摩尔数, 其计算公式如式(1)

DBPR=c(dye)c(bp)(1)

本文中采用SGI作为荧光染料。 固定体系MSO浓度为 300 nmol· L^-1, 汞离子浓度为500 nmol· L^-1, 依据相关经验, 在DBPR=0.25~1.25的范围内调节SG I浓度。 每个反应体系于室温下在10 mmol· L^-1 MOPS缓冲液中避光反应0.5 h。 根据反应体系相较于空白对照体系(无汞离子存在)荧光增强倍数(F/F₀, 计算公式如式(2))的高低对DBPR进行优化。 荧光光谱仪测试条件: 光电倍增管电压400 V, 激发波长为497 nm, 发射波长为520 nm, 若无特殊说明, 本文中其他测试条件均与此相同。

F/F0=F(+Hg2+)F(-Hg2+)(2)

本研究选取了若干代表性MSO(如表1所示), 固定体系MSO浓度为300 nmol· L^-1, 使用1.2中优化出的DBPR, 调整汞离子浓度。 每个反应体系于室温下在10 mmol· L^-1 MOPS缓冲液中反应0.5 h, 根据相应F/F₀对各MSO进行对比优化。

在基于紫外吸收波谱推断MSO识别汞的可能构型时, 固定体系MSO浓度为20 μ mol· L^-1, 汞离子浓度在0~20 μ mol· L^-1内变化。 每个反应体系于室温下在10 mmol· L^-1 MOPS 缓冲液中反应0.5 h, 随后进行紫外吸收波谱测试, 并记录260 nm处紫外吸收值变化。

图2显示了在不存在和存在Hg²⁺的不同条件下SGI的荧光变化。 在没有Hg²⁺的情况下, SGI溶液只显示非常弱的荧光(曲线1)。 加入MSO(T₁₀)后, 混合物的荧光略有增加(曲线2), 说明随机卷曲的MSO与SGI相互作用较弱。 然而, 分别在100和500 nmol· L^-1 Hg²⁺的存在下, SGI/MSO复合物的荧光不断增加(曲线3, 4), SGI-MSO和SGI-Hg²⁺-MSO之间的差异表明MSO与汞离子作用后形成局部双链结构, 可与SGI强烈相互作用, 这使得该方法可以实现Hg²⁺的检测。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 不同浓度Hg2+下MSO和SGI溶液的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of MSO and SGI solutions with different concentrations of Hg2+

为测试该方法在实际检测中的性能, 考察实际环境中基质效应对测试的影响, 本研究选择三种实际水样进行了加标回收实验, 包括两种地表水(丹江口水库, 清华大学荷塘水)和从清华大学下方数百米处抽取的碳酸钙硬度为290~350 mg· L^-1的地下水。 丹江口水库作为南水北调工程中线的水源, 其水质状况非常重要。 荷塘是清华大学一个没有流入和流出的小湖。

在测量之前需要进行包括煮沸以沉淀碳酸盐, 待冷却至室温后, 使用0.22 μ m尼龙滤膜过滤以除去较大的颗粒物, 然后在回收实验前用去离子水稀释2倍。 在检测的线性范围内, 加标浓度分别为10, 50和100 nmol· L^-1, 对加标前后每个样品平行测试3次, 分别计算回收率。

合适的DBPR对基于荧光染色的生物传感体系有着重要的意义。 若体系中荧光染料过少, 所形成的dsDNA不能被完全染色, 会降低传感上限的测量准确度; 若体系中荧光染料过多, 则游离的荧光染料可能增强背景噪声, 削弱体系灵敏度。 一般情况下, 适当提高荧光染料浓度可以提高检测的灵敏度、 扩大靶标定量线性范围。 本工作采用SG I作为荧光染料。 根据先前的经验, 在0.25~1.25的范围内基于MSO体系优化DBPR。 如图3所示, 随着DBPR的增加, F/F₀(暨信号与基线的比值)整体趋势大致相同, 当DBPR为0.5时F/F₀已经比较稳定, 后续即使加大, 整体的比值也没有非常明显的变化, 说明此时SGI的用量比较合适, 既可以明确的指示双链的量, 又不会对杂交产生影响。 同时可以看出, T₂₀对SGI的响应强度非常大, 而其他探针的响应情况区别不是很大。 可能因为T₂₀探针拥有数目最多的T碱基, 结合汞离子后, 与SGI结合的能力最强。 在保证一定灵敏度的前提下, 出于节省染料的目的, 本工作以DBPR=0.5作为后续试验的条件。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 MSO汞离子传感体系中DBPR优化Fig.3 Optimization of DBPR in the MSO based biosensing for Hg2+

目前已经报道的MSO类型丰富, 但至今却没有工作针对探针类型进行系统优化的报道。 本工作基于上述优化的DBPR和固定的探针浓度、 在适宜的Hg²⁺浓度范围内, 针对前人报道中常见的代表性MSO(表1), 按照1.3中所描述的方法, 采用F/F₀为评价指标对各MSO汞传感灵敏度进行测试, 结果如图4所示。 整体上, 在所研究Hg²⁺范围内, 非T_n型MSO探针荧光信号增强倍数较低, F/F₀普遍低于5; 而T_n型MSO荧光信号增强倍数较高, F/F₀最高可达40以上。 在T_n型MSO中, T₁₆探针最为灵敏, 其次为T₁₄。 而当T_n长度增至20时(T₂₀), 此时可能因为随着DNA探针链的增长, 其自身产生发卡结构而使得结合的汞离子含量减少, 进而使得F/F₀的比值减小, 与T₁₀接近。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 MSO探针优化 (a): 非Tn型MSO; (b): Tn型MSOFig.4 Optimization of MSO sequences (a): Non-Tn type MSO; (b): Tn type MSO

进一步基于紫外吸收波谱对T_n型MSO-Hg²⁺复合物构型进行研究。 选用短(T₁₀)、 中(T₁₆)、 长(T₂₀)三种T_n型MSO为代表进行验证。 利用DNA在260 nm UV处有特定的吸收峰, 可以定量DNA的浓度。 在理想状态下, 当富含T碱基的dsDNA与Hg²⁺结合后, 便会形成如图5(a)构像Ⅰ 所示, dsDNA MSO上的T碱基分别与Hg²⁺结合, 引发其吸收峰的位置发生移动, 继而原先在260 nm处的峰值便会降低, 在其他波长位置产生新的吸收峰。 而在实际检测中, 并不完全如图5(a)构像Ⅰ 所示那样, 而是可能单条MSO自身与Hg²⁺发生杂交, 产生如图5(a)构像Ⅱ 所示的发卡结构。 根据这一特性, 在相同的T碱基浓度下, 如果MSO-Hg²⁺形成发卡结构, 该发卡结构相对于dsDNA将少结合一定量的Hg²⁺离子。 在较小Hg²⁺浓度的时候, 其在260 nm处的吸收值便会降低并趋于稳定。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 MSO-Hg2+复合物构型分析 (a): 复合物可能存在的构型示意图; (b): MSO在260 nm紫外吸收峰值随Hg2+浓度的变化Fig.5 Analysis of MSO-Hg2+ conjugate (a): Possible conformation of conjugate; (b): Relationship of UV absorption peak of MSO at 260 nm with different Hg2+ concentration

根据不同浓度汞离子所对应的260 nm处的峰值的变化趋势可以得知不同探针出现发卡结构的可能, 进一步对MSO-Hg²⁺复合物构型加以分析。

由图5(b)可以看出, 体系中存在4 μ mol· L^-1汞离子的情况下, T₂₀探针的吸收峰值最早趋于稳定, 达到一个平台; 而后当体系中的汞离子达到8 μ mol· L^-1时, T₁₆探针的吸收峰值也趋于稳定; 最后, 直到体系中的汞离子浓度达到12 μ mol· L^-1时, T₁₀探针的吸收峰值才趋于稳定。 由此可以推断, T₂₀探针存在一定的发卡结构, 在相同的T碱基浓度下, 发夹结构将比dsDNA结合更少的汞离子。 因此, 在较低Hg²⁺浓度的情况下, 紫外吸收便会出现饱和。 同时也说明, 在较低浓度汞离子存在的情况下, 使用T₂₀探针可能会使检测做到更加灵敏。

使用上文中优化的条件进行Hg²⁺的检测, 随着Hg²⁺浓度的增加, 荧光强度逐渐增加。 图6表示不同浓度的Hg²⁺的荧光强度的标准曲线。 检测限为7.89 nmol· L^-1(定义为3σ /斜率, 其中σ 是空白溶液的相对标准偏差, n=11), 线性范围为10~100 nmol· L^-1。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 0~150 nmol· L-1 Hg2+荧光强度的检测Fig.6 Fluorescence detection of 0~150 nmol· L-1 Hg2+

为了考察实际环境中基质效应对测试的影响, 尝试在三种不同水样中加入三个不同汞离子浓度(5, 10和100 nmol· L^-1)并测试3次, 三种不同水样的加标回收能力均令人满意, 整体回收率在82.8%~101.8%之间, 表明该方法有着很好的精密度和准确性, 受环境基质的影响较小, 可应用于实际水样中汞离子的检测。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 三种不同水样的加标回收测试(n=3) Table 2 Recoveries of spiked samples of three different water (n=3) 样品来源 加标量/ (nmol· L-1) 检出量/ (nmol· L-1) 回收率 /% 10 63.57 101.8± 5.36 丹江口水库 50 111.9 96.7± 6.02 100 171.0 94.7± 5.35 10 57.71 92.6± 1.99 荷塘水 50 106.4 92.0± 2.42 100 160.7 90.8± 14.1 10 55.77 89.3± 5.16 清华大学地下水 50 106.1 91.7± 7.65 100 153.3 82.8± 5.71

表2 三种不同水样的加标回收测试(n=3) Table 2 Recoveries of spiked samples of three different water (n=3)