十二烷基磺酸钠(SDS), 3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MTS), 牛血清白蛋白(BSA), 雌二醇(E₂), 4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)均购买于Sigma公司, 于4 ℃保存。 雌二醇包被抗原(雌二醇-BSA复合物)和雌二醇单克隆抗体购买于北京勤邦生物技术有限公司。 聚二甲基硅氧烷购买于道康宁公司。 荧光染料Cy5.5购买于GE公司。 其他试剂未经特别注明均由国药集团化学试剂公司提供。

0.5% SDS(pH 1.9)溶液和10 mmol· L^-1 pH 7.4 PBS(磷酸)缓冲液(2 mmol· L^-1 KH₂PO₄, 137 mmol· L^-1 NaCl, 10 mmol· L^-1 Na₂HPO₄, 2.7 mmol· L^-1 KCl)用超纯水配制。 一系列浓度梯度的雌二醇标准溶液用10 mmol· L^-1 PBS溶液配制。

阵列倏逝波荧光传感器的系统结构如图1所示, 主要包括四个部分: 传感芯片和反应池、 光路系统、 信号处理系统和流动进样系统。 倏逝波传感芯片的材质为K9光学玻璃(折射率为1.52, 尺寸65 mm× 25 mm× 1.5 mm), 上下表面进行抛光处理, 一端设计45° 斜面, 抛光处理后用于激发光耦合到芯片内部。 八通道流通池由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作, 固定于芯片的表面。 氦氖激光器作为激发光源(635 nm), 经棱镜处理后形成一字光线耦合进入芯片, 在芯片内部发生全反射, 表面形成全反射线, 产生倏逝波。 当芯片表面有荧光分子存在时, 其会被倏逝波激发产生荧光信号。 在每个传感位点的下方, 利用数值孔径为0.46的塑料光纤收集激发的荧光, 经带通滤光片过滤杂散光后经光电二极管转化为电信号, 转换后的信号通过锁相放大器放大, 并通过数据采集卡转换为数字信号, 利用软件进行处理。 液体经过蠕动泵进行传送。

图1

Fig.1

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	图1 阵列倏逝波荧光传感器结构图Fig.1 Schematic diagram of an array fluorescent biosensor

首先, 将芯片浸入piranha试剂反应30 min, 清洗芯片表面, 并引入硅羟基键, 然后用去离子水冲洗至pH值中性, N₂吹干。 在室温下, 用2% MTS(无水甲苯做溶剂)对芯片进行表面硅烷化。 用无水甲苯洗去多余的MTS, 然后与双官能交联试剂(2 mg· mL^-1 GMBS溶解于乙醇中)在室温下反应1 h。 随后将雌二醇-BSA复合物滴加在GMBS修饰的芯片传感位点上, 在4 ℃反应过夜。 最后, 将芯片放入2 mg· mL^-1 BSA中反应, 以封闭非特异性位点。 制备好的芯片在使用前于4 ℃保存。

Cy5.5荧光染料标记抗体采用水相碳二亚胺法, 此染料分子内部含有高活性的NHS基团, 可直接与蛋白质中的氨基发生反应。 透析后的溶液用紫外-可见光光度计扫描全谱, 并测定其在280和678 nm上的吸光度, 确定其标记比。 本实验中所使用的Cy5.5标记雌二醇抗体的标记比为2.3。

运用间接竞争免疫检测模式, 首先将雌二醇标准溶液与Cy5.5标记的雌二醇抗体进行预反应(5 min)。 然后, 将混合溶液以100 μ L· min^-1的流速通入传感芯片表面, 使剩余的游离抗体与芯片表面固定化的抗原进行结合(10 min)。 被结合到芯片表面的荧光标记的抗体经倏逝波激发产生荧光信号。 样品中雌二醇的浓度越大, 结合在芯片表面的抗体量就越少, 荧光信号值越低, 建立荧光信号值与雌二醇浓度的定量关系。 最后用5 mL SDS(0.5%, pH 1.9)作为活化液, 洗去芯片表面结合的抗体, 并进行下一轮的测试。

对清华大学中水站污水处理厂和江阴市两个污水处理厂的两种不同污水处理工艺的出水进行了加标测定, 加标浓度分别为0.3和0.5 μ g· L^-1。 测试前水样经0.45 μ m的滤膜过滤以除去较大的颗粒物。 对加标前后每个样品平行测试3次, 分别计算回收率。

根据Snell定律, 计算入射光在光波导发生全内反射的入射角θ _B, 也称为布儒斯特角

θB=arcsinn2n1

式中n₁为K9玻璃波导介质折射率, 1.516 3; n₂为水相折射率, 1.33。 经计算, 全反射角为61.3° 。

为了使系统灵敏度达到最优, 对入射光角度与芯片表面荧光发射强度之间的关系用matlab软件进行了模拟。 拟使用的荧光染料Cy5.5荧光效率为Φ _(c)=0.28, 摩尔吸收系数k=250 000 L· mol^-1· cm^-1, 转换成与倏逝波透射深度单位一致, 得到ε =1/40 nm^-1。 假设荧光染料在传感芯片表面均匀分布, 则可以得到入射光的平行分量和垂直分量产生的荧光强度(F_TM和F_TE)与入射角之间的模拟关系图(图2)。 荧光强度随入射角增大而快速下降, 当入射角等于90° 时, 荧光强度为0, 当在入射角接近全反射角时, 荧光强度达到最大。 因此, 入射角应尽量接近全反射角, 才能有效提高荧光发射强度, 从而提升传感器的灵敏度。 考虑准直系统的调节精度, 本研究设定入射角为61.8° 。

图2

Fig.2

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	图2 入射角与荧光强度的关系Fig.2 Relationship of the incidence angle and the emitted fluorescence intensity

芯片表面24个传感位点(3行× 8列)对10^-7 mol· L^-1荧光染料Cy5.5的响应如图3(a)所示。 24个传感位点的荧光信号值相对标准偏差为20%。 分析造成各传感位点信号差异的主要原因是收集荧光光纤和修饰位点之间的对准精度不够。 同时考察24个传感位点对不同浓度荧光染料Cy5.5的响应, 其中图3(b)为灵敏度差别最大的两个位点为Cy5.5的响应曲线, 可以看出, 对Cy5.5的检出限均能达到1 nmol· L^-1, 与文献报道的其他阵列倏逝波荧光传感芯片灵敏度相当^[8], 可以用于后续的免疫分析。

图3

Fig.3

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	图3 (a)传感器24个传感位点对10-7 mol· L-1 Cy5.5的响应信号值; (b)响应信号差别最大的两个检测位点对不同浓度的Cy5.5的测定曲线 2.3 阵列倏逝波荧光传感器对雌二醇的检测标准曲线Fig.3 (a) Peak response signals of twenty-four biosensing spots towards 10-7 mol· L-1 Cy5.5 dye solution; (b) Calibration curves of Cy5.5 on two spots with the biggest difference in the response signals

阵列倏逝波荧光传感器对雌二醇测试的完整周期如图4(a)所示, 包括基线测定阶段, 免疫反应阶段(激光关闭)、 荧光测试阶段(激光开启)和活化阶段, 整个测试周期不超过20 min。 图4(b)为平面波导型阵列荧光免疫传感器对不同浓度雌二醇标准溶液进行测试所获得的荧光信号与雌二醇浓度之间的关系。 经Logistic曲线模拟, 线性检测区间为0.08~2.52 μ g· L^-1, 跨越了3个数量级, 检测限为0.05 μ g· L^-1(最大信号90%所对应的目标物浓度)。 如表1所示, 与其他检测雌二醇的方法相比, 本文提出的阵列荧光传感器对雌二醇的检测具有很高的灵敏度, 且低于日本最新饮用水水质标准中对雌二醇规定的限值(80 ng· L^-1)。

图4

Fig.4

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	图4 阵列倏逝波荧光传感器对雌二醇完整的测试周期(a)和雌二醇检测标准曲线(b)Fig.4 Complete test cycle of the array fluorescence biosensor for estradiol detection (a) and typical calibration curve for estradiol detection (b)

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 与文献报道雌二醇检测方法的比较 Table 1 Comparison of detection methods for estradiol 检测方法 检出限 /(μ g· L-1) 检测区间 /(μ g· L-1) 参考 文献 高效液相色谱法 0.8~1.4 250~500 [8] 酶联免疫分析法 971.4 10~106 [9] 高效液相色谱荧光检测器法 0.186 5~1 000 [10] 流动注射化学阻抑发光法 8.5 20~800 [11] 基于适配体的纳米金比色法 10 10~10 000 [12] 阵列倏逝波荧光传感器 0.05 0.08~2.52 本文

表1 与文献报道雌二醇检测方法的比较 Table 1 Comparison of detection methods for estradiol

生物传感芯片的界面稳定再生是保证传感器分析生物技术准确性、 降低检测成本、 实现在线/半连续运行的前提条件^[14]。 强酸或碱性溶液可以破坏抗体与芯片上的分析物之间的结合作用力。 使用0.5% SDS(pH 1.9)作为活化液, 对传感芯片进行再生。 对2 μ g· mL^-1 Cy5.5标记雌二醇抗体连续测试20次的信号响应结果如图5所示, 信号值标准偏差为3%, 表明芯片再生稳定性好, 可多次重复使用。

图5

Fig.5

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	图5 传感芯片对2 μ g· mL-1 Cy5.5标记雌二醇抗体连续测定20次的信号值 2.5 实际水样分析Fig.5 Regeneration of fluorescence signals towards 2 μ g· mL-1 Cy5.5-labeled estradiol antibody on the array fluorescence biosensor

对三个不同工艺污水处理厂出水进行测试及加标回收实验, 结果见表2。 加标回收率在84%~120%, 变异系数小于15%, 表明该方法可成功应用于实际水样中雌二醇的快速检测。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 三个污水处理厂出水水样加标回收测试(n=3) Table 2 Recoveries of Spiked Samples of Wastewater Effluent (n=3) 样品来源 处理工艺 检出量/(μ g· L-1) 加标量/(μ g· L-1) 变异系数(CV)/% 回收率/% 清华大学中水站 MBR 未检出 0.3 0.5 4 13 100 86 江阴市污水处理厂A 厌氧-好氧 未检出 0.3 0.5 9 15 113 84 江阴市污水处理厂B MCR 未检出 0.3 0.5 2 1.4 117 120

表2 三个污水处理厂出水水样加标回收测试(n=3) Table 2 Recoveries of Spiked Samples of Wastewater Effluent (n=3)