本实验采用由日本日立公司生产的F-4600 FL荧光分光光度计测定样品的三维荧光光谱数据。 设置发射波长区间为200~700 nm, 步长为5 nm。 激发波长区间为200~600 nm, 步长也为5 nm。 设置仪器的激发与发射狭缝宽度均为10 nm, PMT电压设置为400 V, 扫描速度定为30 000 nm· min^-1。 所有计算均使用美国MathWorks公司出品的MATLAB R2021a进行。 利用drEEM工具箱(http://www.models.life.ku.dk/drEEM)构建PARAFAC模型^[12]。

在本研究中, 我们选择了河北沿程生物科技有限公司的酪氨酸、 南通飞宇生物科技有限公司的黄腐酸、 上海摩楷生物科技有限公司的萘乙酸和上海源叶生物科技有限公司的罗丹明B四种典型的化学物质进行实验。 将酪氨酸、 萘乙酸和罗丹明B的浓度梯度均设置为: 20、 40、 60、 80和100 μg· L^-1。 将黄腐酸的浓度梯度设置为: 1、 3、 5、 7和9 mg· L^-1。 每种化学品均用Millipore公司的Milli-Q水净化系统的去离子水作溶剂配制而成, 各得五个样品。

模拟突发污染水样, 通过自来水与罗丹明B配制而成。 自来水取自浙江大学舟山校区海科楼。 通过控制水流流速, 每5 min取样一次, 共取样30个样本。 为防止非必要性误差的产生, 每个样品均扫描三次三维荧光光谱, 取平均值作为样品最终的三维荧光光谱进行数据分析。

在三维荧光光谱中, 拉曼散射可近似由水分子与激发光光子相互作用发生能级跃迁而产生, 影响因素较为单一^[13]。 且考虑到测试仪器本身的背景噪声也会对实验效果造成影响。 因此我们需要测量每次实验中溶剂的三维荧光光谱, 本实验的溶剂均为去离子水, 将其作为背景基线。 采用原始光谱数据减去背景基线的校正方法, 也称为空白扣除法, 达到校正拉曼散射和背景干扰的目的。

而瑞利散射的产生机理相对于拉曼散射而言要复杂很多。 瑞利散射是由光子与溶解气体、 悬浮颗粒和可溶分子等碰撞而产生的, 影响因素颇多。 因此对于部分样品, 特别是低浓度样品而言, 仅采用空白扣除法往往难以对其达到很好的校正效果。 针对已完成拉曼散射校正的三维荧光光谱数据, 本文将从散射峰与物质峰的荧光强度和重叠程度两方面考虑, 将光谱分为五类情况对应三种重叠等级, 采用一种自适应的散射去除方法对其进行校正。 首先, 对这一节中将出现的参数进行定义与解释说明, 如表1所示。 需要注意的是, 当散射区域与物质峰因重叠过度而致使物质区域没有峰值时, 物质区域峰值即定义为其最大值, 且瑞利散射近似于一个中心在激发波长处的高斯函数^[14]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 定义参数与解释说明 Table 1 Define parameters and explanations Parameters Definitions and Explanations A The Point at the left end of the first-order Rayleigh scattering region B The Point at the right end of the first-order Rayleigh scattering region C The Point at the left end of the second-order Rayleigh scattering region D The Point at the right end of the second-order Rayleigh scattering region x(A)、 x(B)、 x(C)、 x(D) The emission wavelengths corresponding to points A, B, C and D y(A)、 y(B)、 y(C)、 y(D) Fluorescence intensities corresponding to points A, B, C and D R1 First order Rayleigh scattering region R2 Second order Rayleigh scattering region h1 The fluorescence intensity of the first-order Rayleigh scattering peak h2 The fluorescence intensity of the second-order Rayleigh scattering peak H0 The fluorescence intensity of the material peak which is at the left of the first-order Rayleigh scattering and closest to it H1 The fluorescence intensity of the material peak which is between the first-order and the second-order Rayleigh scattering H2 The fluorescence intensity of the material peak which is at the right of the second-order Rayleigh scattering and closest to it

表1 定义参数与解释说明 Table 1 Define parameters and explanations

然后对即将应用到的三种算法进行简要介绍。 置零法即为用零替换已有数据。 Hermite插值, 也称为具有节点的导数值约束的插值。 因为其严苛的算法要求, 既能保证数据的强关联性又能使所得曲线相对光滑, 在插值领域应用广泛。 然而直接使用Hermite插值得到的多项式往往次数较高, 也存在着龙格现象。 因此在本研究中, 我们采用了分段三次Hermite插值多项式(piecewise cubic hermite interpolating polynomial, PCHIP)以防止过拟合。 高斯拟合即为用高斯函数对已经存在的数据点进行函数拟合逼近。

由于拉曼散射是通过空白扣除法进行校正的, 所以原始光谱的瑞利散射数据也将扣除部分。 因此会存在瑞利散射信号比物质荧光强度弱的情况。 我们将从散射峰与物质峰的荧光强度大小关系进行考虑, 将其分为h≤ 1/2H和h> 1/2H两大类。 首先介绍h≤ 1/2H的情况。 我们对其四个端点: A、 B、 C、 D分别进行评估。 对于A端点, 当h₁≤ 1/2H₀, 且y(A)≈ 0时表示散射峰与物质峰不存在重叠区域, 采用置零法对R₁区域进行有效数据替换处理; 当0< y(A)时表示散射峰与物质峰存在重叠区域, 但是因为h₁≤ 1/2H₀所以将其重叠等级定为微弱重叠, 用R₁两边的有效数据采用PCHIP算法对R₁区域内的数据进行插值替换处理。 对于B端点, 当h₁≤ 1/2H₁, 且y(B)≈ 0时表示散射峰与物质峰没有重叠, 采用置零法对R₁区域内数值进行处理; 当0< y(B)时表示散射峰与物质峰存在微弱重叠, 用R₁两边的有效数据采用PCHIP算法对散射区域内数值进行插值替换处理。 对于C端点亦然, h₂≤ 1/2H₁, 且y(C)≈ 0时采用置零法对R₂区域内数值进行替换; 当0< y(C)时用R₂两边的有效数据采用PCHIP算法对R₂区域进行插值处理。 对于D端点, h₂≤ 1/2H₂, 且y(D)≈ 0时采用置零法对R₂区域进行处理; 当0< y(D)时用R₂两边的有效数据采用PCHIP算法对R₂区域进行插值处理。 如图2(a)所示, 即展示了当h₁≤ 1/2H₁、 h₂≤ 1/2H₁和h₂≤ 1/2H₂, y(B)、 y(C)、 y(D)均逼近于零时, 也就是散射峰和物质峰无重叠区域的情况。 因为有重叠的情况与图2(a)仅有y(B)、 y(C)、 y(D)是否大于零的差异, 将不再画图加以说明。

图2

Fig.2

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	图2 酪氨酸在(a) 210 nm, (b) 260 nm, (c) 270 nm, (d) 275 nm激发波长下的荧光发射光谱 绿色虚线为瑞利散射区域边界Fig.2 Fluorescence emission spectrums of Tyrosine at (a) 210 nm, (b) 260 nm, (c) 270 nm, (d) 275 nm excitation wavelength The dashed green lines are the boundaries of the Rayleigh scattering regions

而当h> 1/2H时, 将存在三种情况, 即无重叠、 微弱重叠和严重重叠。 以B点为例进行探讨, A、 C和D点的情况根据上文依次类推。 当h₁> 1/2H₁, y(B)≈ 0时, 如图2(b)所示, 表明散射峰与物质峰无重叠, 可用置零法将R₁区域内数据替换为0。 当0< y(B)≤ 1/2H₁时, 如图2(c)所示, 表明散射峰与物质峰存在重叠, 但是对物质峰的影响尚弱, 可定义为微弱重叠, 用R₁两边的有效数据采用PCHIP算法对R₁区域内数值进行插值替换处理。 而当1/2H₁< y(B)时, 如图2(d)所示, 散射峰对物质峰的影响加剧, 将其定义为严重重叠。 需要先对R₁散射区域内的荧光数据进行高斯拟合, 然后再用R₁两边物质区域的荧光数据减去高斯拟合后的数据, 最后将R₁两边处理完的数据采用分段三次Hermite插值多项式算法对R₁区域内数值进行插值替换处理。 以达到既扣除瑞利散射干扰, 又保证数据一致性的目的。

将这五种情况列表如表2所示。 需要注意的是对于瑞利散射而言其一般具有两个边界端点, 如果两个端点所判断的情况不一样, 则需要根据优先级关系进行进一步判断处理。 优先级关系为: 类别5> 类别4=类别2> 类别3=类别1。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 自适应算法所对应的五类情况 Table 2 The five categories corresponding to the self-adapting algorithms Categories Basic conditions Judgment methods Overlapping levels Interpolation methods 1 h1≤ 1/2H0 or 1 h2≤ 1/2H1 or 2 y(A)≈ 0 or y(B)≈ 0 y(C)≈ 0 or y(D)≈ 0 No overlap Setting to zero 2 0< y(A) or 0< y(B) 0< y(C) or 0< y(D) Weak overlap Piecewise Cubic Hermite Interpolating Polynomial (PCHIP) 3 h1> 1/2H0 or 1 h2> 1/2H1 or 2 y(A)≈ 0 or y(B)≈ 0 y(C)≈ 0 or y(D)≈ 0 No overlap Setting to zero 4 0< y(A)≤ 1/2H0 or 0< y(B)≤ 1/2H1 0< y(C)≤ 1/2H1 or 0< y(D)≤ 1/2H2 Weak overlap Piecewise Cubic Hermite Interpolating Polynomial (PCHIP) 5 1/2H0< y(A) or 1/2H1< y(B) 1/2H1< y(C) or 1/2H2< y(D) Serious overlap Gaussian-piecewise cubic Hermite interpolation polynomial coupling algorithm

表2 自适应算法所对应的五类情况 Table 2 The five categories corresponding to the self-adapting algorithms

如图3(a), (c), (e), (g)分别是酪氨酸、 黄腐酸、 萘乙酸和罗丹明B的原始光谱图, 酪氨酸、 萘乙酸和罗丹明B的浓度均为40 μg· L^-1, 黄腐酸的浓度为5 mg· L^-1, 以此为例, 其他情况均可类推。 不难看出, 酪氨酸和黄腐酸与拉曼光谱重叠较为严重, 存在严重重叠区域。 通过空白扣除法, 扣除了原始三维荧光光谱的背景干扰和拉曼散射后, 所得光谱图如图3(b), (d), (f), (h)所示。 通过对比图3(a), (b)和图3(c), (d)可以看出, 即使物质荧光区域与拉曼散射区域严重重叠, 该方法也能起到很好的校正效果。 由此论证通过空白扣除法校正拉曼散射是合理有效的。

图3

Fig.3

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图3 (a) 酪氨酸、 (c) 黄腐酸、 (e) 萘乙酸、 (g) 罗丹明B的原始三维荧光光谱图; 其拉曼散射校正后的光谱图分别为(b)、 (d)、 (f)、 (h); 校正后的三维荧光光谱图上方两条色条分别表示一阶瑞利散射和二阶瑞利散射区域与物质峰的重叠程度, 蓝黑色、 橙色和红色色条分别对应无重叠、 微弱重叠和严重重叠Fig.3 Original excitation-emission matrix spectroscopies of (a) Tyrosine, (c) Fulvic acid, (e) Naphthalene acetic acid, (g) Rhodamine B; The spectrums after Raman scattering correction are (b), (d), (f) and (h), respectively; The two-color bars on the top of the corrected excitation-emission matrix spectroscopies respective to show the overlapping between the first-order or the second-order Rayleigh scattering regions and the material regions; The blue-black, orange and red color bars correspond to no overlap, weak overlap and serious overlap, respectively

通过图3(b), (d), (f), (h)也可以看出, 对于低浓度样品而言, 仅仅通过空白扣除法是无法完全去除瑞利散射干扰的, 这与理论相符。 因此对于低浓度并且物质荧光信号存在与散射区域重叠较为严重的样品来说, 亟需一种有效的去除瑞利散射的方法。 按照1.4节的方法, 综合考虑物质峰与散射区域峰值的荧光强度和重叠程度, 对光谱进行重叠等级评估, 结果如图3(b), (d), (f), (h)三维荧光光谱上方的色条所示。 上方第一条色条表示一阶瑞利散射与物质峰的重叠程度, 上方第二条表示二阶瑞利散射与物质峰的重叠程度。 蓝黑色代表无重叠, 橙色代表微弱重叠, 红色代表严重重叠。 不难得出, 罗丹明B的重叠情况和程度相对于其他三种物质来说更为复杂, 这与事实相符。

根据2.1节中瑞利散射区域与物质峰重叠程度的评估结果, 分别对酪氨酸、 黄腐酸、 萘乙酸和罗丹明B这四种典型的有机化合物进行了相应的算法处理。 校正后的三维荧光光谱图如图4(a), (b), (c), (d)所示。 与原始三维荧光光谱图对比, 可以发现物质荧光光谱区域结构完整, 大量信息得以有效留存, 瑞利散射和拉曼散射完全去除。 即使光谱重叠严重的罗丹明B的三维荧光光谱经过处理后形状也未失真, 证明了本文方法去除散射干扰的有效性。

图4

Fig.4

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	图4 (a) 酪氨酸、 (b)黄腐酸、 (c)萘乙酸、 (d)罗丹明B基于自适应方法校正后的三维荧光光谱图Fig.4 Excitation-emission matrix spectroscopies of (a) Tyrosine, (b) Fulvic acid, (c) Naphthalene acetic acid, (d) Rhodamine B after scattering correction based on the self-adapting method

因为黄腐酸是天然有机化合物, 广泛存在于自然界中, 并且物质荧光区域和散射区域存在严重重叠情况。 所以以黄腐酸为典型物质, 将本文方法与现阶段研究中采用最多的Delaunay三角形内插值法进行对比。 我们分别采用[16, 18]、 [10, 10]、 [22, 22]、 [18, 16]为最佳参数的一阶瑞利散射、 一阶拉曼散射、 二阶瑞利散射和二阶拉曼散射数值设定进行了Delaunay插值, 结果如图5(b)所示。 可以看出红色方框区域内的荧光信号相对于本文所使用的方法而言出现严重失真, 存在过拟合现象。 说明Delaunay插值方法对存在严重重叠干扰的适应性较弱。 并对四种有机化合物的共20个样本, 分别用这两种方法进行了散射校正处理, 以重叠区域散射校正后的数据进行浓度回归, 所得决定系数R-squared的值列表如表3所示, 本文方法的平均决定系数为0.996 2, 相对于Delaunay插值法所得的平均决定系数提高了5.04%, 进一步证明了本文方法保持物质荧光光谱区域的结构特征和去除散射干扰的合理有效性。

图5

Fig.5

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	图5 黄腐酸散射校正后的三维荧光光谱图 (a): 自适应方法; (b): Delaunay插值法Fig.5 Excitation-emission matrix spectroscopies after scattering correction of Fulvic acid (a): Adaptive method; (b): Delaunay interpolation

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 四种有机化合物经本文方法和Delaunay插值法散射校正后进行浓度回归预测所得的决定系数值 Table 3 The R-Squared obtained by concentration regression prediction of four organic compounds after removing scatterings by the method and Delaunay interpolation Samples The method Delaunay interpolation Tyrosine 0.995 4 0.910 3 Fulvic acid 0.993 2 0.924 5 Naphthalene acetic acid 0.998 7 0.996 2 Rhodamine B 0.997 3 0.952 3 The average of R-Squared 0.996 2 0.945 8

表3 四种有机化合物经本文方法和Delaunay插值法散射校正后进行浓度回归预测所得的决定系数值 Table 3 The R-Squared obtained by concentration regression prediction of four organic compounds after removing scatterings by the method and Delaunay interpolation

为验证本文方法在实际应用场景中的可靠性和通用性, 我们通过模拟突发污染实验对所得水样进行了水质监测。 因为罗丹明B是一种常见的致癌染料, 经常在印染厂附近的河流中发现。 所以我们拟采用自来水和罗丹明B进行实验, 共获得30个样品。 利用PARAFAC模型计算30个样品的四个PARAFAC分量的载荷, 如图6所示, 可以看到组分四在第9和第10个样品之间有明显的变化。 这与加入罗丹明B的时间相符, 进一步验证了本文方法修正三维荧光光谱中瑞利散射和拉曼散射的合理性, 同时论证了此方法具有普适性, 可以用于实际应用场景之中。

图6

Fig.6

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	图6 模拟突发污染水样的四种PARAFAC组分载荷随时间的变化趋势Fig.6 The loading trends of four PARAFAC components with time in water samples with sudden pollution were simulated