实验采用8个相同的圆柱形有机玻璃材质的SBR, 反应器供氧利用空气泵和反应器底部的微孔曝气盘实现。 通过玻璃转子流量计控制溶解氧为2.0~3.0 mg· L^-1。 反应器壁厚0.5 cm, 高28 cm, 内径9 cm, 有效使用容积为1.8 L。 反应周期分6个阶段, 进水、 厌氧、 曝气、 沉淀、 出水、 闲置阶段。 采用间歇式厌氧/好氧交替运行方式, 反应器每天运行6个周期, 1个周期4 h, 进水30 min, 厌氧50 min, 好氧110 min, 沉淀30 min, 出水10 min, 闲置10 min。 每个反应器污泥浓度(MLSS)约为4 000 mg· L^-1。

实验接种的活性污泥取自合肥市望塘污水处理厂的氧化沟, 将接种污泥接入到18 L反应器进行驯化, 实验污泥驯化阶段出水COD、 MLSS和正磷酸盐稳定后视为驯化完成。 最后活性污泥转移至1.8 L反应器进行实验。

实验采用人工配水, 药剂包括CH₃COONa· 3H₂O、 KH₂PO₄、 NH₄Cl、 MgSO₄、 C₄H₈N₂S、 C₁₀H₁₆N₂O₈、 CaCl₂· 2H₂O、 酵母膏、 蛋白胨; 微量元素包括FeCl₃、 KI、 ZnSO₄、 H₃BO₃、 CuSO₄、 MnCl₂、 Na₂M_OO₄、 CoCl₂· 6H₂O。

分别称取1 g金霉素和土霉素, 用去离子水充分溶解并定容至1 L棕色容量瓶进行避光保存, 放置于4 ℃冰箱储存待用。

EPS提取采用热提取法^[13]。 提取步骤: 取厌氧末端30 mL污泥混合液, 离心力2 000 g条件下离心15 min去上清液, 注入超纯水补充至原体积。 置于80 ℃恒温水浴锅中加热1 h后, 溶液冷却至室温。 在4 ℃, 离心力12 000 g条件下离心10 min, 取上清液用0.45 μm滤膜过滤, 将过滤后的EPS溶液置于4 ℃进行保存。 提取的EPS中蛋白质采用考马斯亮蓝, 多糖采用蒽酮-硫酸测定法。

采用Hitachi F-7000荧光分光光度计对EPS的成分进行3D-EEM分析。 以氙灯为光源, 设定电压700 V, 三维荧光光谱扫描设定狭缝宽带λ _Ex为5 nm, λ _Em为5 nm; 激发波长λ _Ex为200~400 nm, 发射波长λ _Em为300~550 nm; 扫描速度为2 400 nm· min^-1。 扫描的数据利用Matlab2020软件处理分析。

为了定性分析EPS中化学官能团的变化, 将EPS提取液经过冷冻干燥后与光谱纯KBr按照质量比1:100进行充分研磨、 压片, 压片成透明状后在红外光谱仪进行FTIR分析, 在400~4 000 cm^-1波数范围内扫描, 分辨率为4 cm^-1, 扫描的数据利用origin2018软件绘图。

首先根据金霉素、 土霉素单独作用时的比吸磷率, 得到半最大效应浓度EC50, 再利用直接均分射线法^[14]设计3种不同浓度配比(L1、 L2、 L3)的金霉素和土霉素混合物, 结果如图1和表1所示。 再根据稀释因子法^[14]为每种配比设计8组金霉素和土霉素混合物, 结果如表2所示。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 直接均分射线法设计不同浓度配比混合物Fig.1 Mixtures with different concentrations ratios by direct equipartition ray method

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 金霉素和土霉素混合物浓度配比 Table 1 Concentration ratio of Chlortetracycline and Oxytetracycline 配比 金霉素占比 土霉素占比 稀释因子 L1 0.71 0.29 0.56 L2 0.45 0.55 0.57 L3 0.22 0.78 0.60

表1 金霉素和土霉素混合物浓度配比 Table 1 Concentration ratio of Chlortetracycline and Oxytetracycline

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 8组金霉素和土霉素浓度组合 (mg· L-1) Table 2 Eight groups of Chlortetracycline and Oxytetracycline mixtures (mg· L-1) 编号 金霉素 土霉素 混合浓度 L1 L2 L3 1# 0.10 0.10 0.52 0.76 1.32 2# 1.00 1.00 0.93 1.33 2.21 3# 5.00 5.00 1.67 2.32 3.68 4# 10.00 10.00 2.97 4.04 6.13 5# 15.00 15.00 5.30 7.04 10.22 6# 20.00 20.00 9.46 12.27 17.05 7# 30.00 30.00 16.89 21.37 28.43 8# 40.00 40.00 30.13 37.22 47.40

表2 8组金霉素和土霉素浓度组合 (mg· L-1) Table 2 Eight groups of Chlortetracycline and Oxytetracycline mixtures (mg· L-1)

不同浓度金霉素、 土霉素及3种配比的混合物对正磷酸盐去除的影响如图2所示。 由图2(a—e)可知, 随着作用时间的延长, 不同浓度金霉素、 土霉素及混合物作用下, 出水中正磷酸盐的浓度不断增加并逐渐趋于进水浓度。 这说明抗生素已经严重抑制聚磷菌除磷的过程。

图2

Fig.2

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图2 不同浓度金霉素、 土霉素及3种配比混合物对正磷酸盐去除的影响 (a): 不同浓度金霉素对正磷酸盐去除的影响; (b): 不同浓度土霉素对正磷酸盐去除的影响; (c): 配比L1对正磷酸盐去除的影响; (d): 配比L2对正磷酸盐去除的影响; (e): 配比L3对正磷酸盐去除的影响Fig.2 Effects of different concentrations of chlortetracycline, oxytetracycline and three ratio mixtures on the removal of orthophosphate (a): Effects of chlortetracycline on orthophosphate removal; (b): Effects of oxytetracycline on orthophosphate removal; (c): Effects of ratio L1 on orthophosphate removal; (d): Effects of ratio L2 on orthophosphate removal; (e): Effects of ratio L3 on orthophosphate removal

不同浓度金霉素、 土霉素及3种配比的混合物对COD去除的影响如图3所示。 图3(a—e)不同浓度金霉素、 土霉素及混合物随着作用时间的延长, 反应器COD出水浓度不断增加。 可见金霉素、 土霉素及混合物对COD去除产生较大影响, 抗生素浓度越高COD去除受到抑制越明显。

图3

Fig.3

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图3 不同浓度金霉素、 土霉素及3种配比混合物对COD去除的影响 (a): 不同浓度金霉素对COD去除的影响; (b): 不同浓度土霉素对COD去除的影响; (c): 配比L1对COD去除的影响; (d): 配比L2对COD去除的影响; (e): 配比L3对COD去除的影响Fig.3 Effects of different concentrations of Chlortetracycline, Oxytetracycline and their mixtures on COD removal (a)Effects of Chlortetracycline on COD removal; (b): Effects of Oxytetracycline on COD removal; (c): Effects of ratio L1 on COD removal; (d): Effects of ratio L2 on COD removal; (e): Effects of ratio L3 on COD removal

不同浓度金霉素和土霉素对微生物EPS中蛋白质和多糖含量的影响如图4所示。 由图4(a—d)可知, 随反应时间的延长, 蛋白质和多糖含量均呈现先上升后下降的趋势, 蛋白质、 多糖含量分别在36和48 h达到最大值, 同时蛋白质含量远高于多糖。 分析认为在反应初期, 金霉素、 土霉素的刺激下使生物除磷中微生物分泌EPS在微生物体表面形成保护层抵御有害的环境。 研究表明, 蛋白质是保护细胞的主要物质, 为防止细胞受到毒害, 细胞合成蛋白质的含量增加^[15]。 也有研究发现, EPS表面具有大量带负电荷的基团和氢键、 范德华力能够与污染物结合形成复合物保护微生物^[16]。

图4

Fig.4

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图4 不同浓度金霉素、 土霉素对EPS组分随时间变化情况 (a): 不同浓度金霉素作用下蛋白质的变化; (b): 不同浓度金霉素作用下多糖的变化; (c): 不同浓度土霉素下蛋白质的变化; (d): 不同浓度土霉素下多糖的变化Fig.4 Changes of EPS components under different Chlortetracycline and Oxytetracycline (a): Changes of protein under different concentrations of Chlortetracycline; (b): Changes of polysaccharides under different concentrations of Chlortetracycline; (c): Changes of protein under different concentrations of Oxytetracycline; (d): Changes of polysaccharides under different concentrations of Oxytetracycline

然而, 金霉素与土霉素均属于四环素类抗生素。 研究表明, 四环素类抗生素能与核糖体30S亚基中A的位置结合, 能够阻止胺基酰-tRNA与核糖体A位置联结, 导致了微生物合成蛋白质受阻^[17]。 当金霉素、 土霉素的浓度增加至某临界值时, EPS表面结合位点被完全占据, 导致EPS结构遭到破坏, 抗生素进入细胞体内进而抑制微生物合成蛋白质。 因此, 随反应时间和浓度的增加EPS中蛋白质和多糖含量出现逐渐减少的现象, 从而引起生物除磷功能逐渐下降。 该实验结果与前人研究结果一致^[18]。 可见EPS含量增加对于延缓生物除磷性能不断恶化具有重要作用。

不同浓度配比金霉素和土霉素混合物对微生物EPS中蛋白质和多糖含量的影响如图5所示。 由图5(a—f)可知, 随着反应时间的增加, 3种不同浓度配比下微生物EPS中蛋白质和多糖含量均呈现先上升后下降的趋势。 这可能是微生物为了不受到金霉素和土霉素联合毒害的作用分泌产生更多的EPS在微生物体表面形成保护层, 导致蛋白质和多糖含量出现不同程度的增加。 该研究结果与李娟英等研究的纳米氧化锌和四环素对EPS的影响相似^[19]。 然而, 随反应时间延长及浓度的增加, 金霉素和土霉素在EPS中逐渐积累, 微生物表面的EPS结构遭到破坏, 进而抑制蛋白质和多糖的合成, 导致蛋白质和多糖含量下降。

图5

Fig.5

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图5 不同浓度配比混合物对EPS组分随时间变化情况 (a): 配比L1作用下蛋白质的变化; (b): 配比L1作用下多糖的变化; (c): 配比L2作用下蛋白质的变化; (d): 配比L2作用下多糖的变化; (e): 配比L3作用下蛋白质的变化; (f): 配比L3作用下多糖的变化Fig.5 Changes of EPS components with different ratios over time (a)Changes of protein under the action of ratio L1; (b): Changes of polysaccharides under the action of ratio L1; (c): Changes of protein under the action of ratio L2; (d): Changes of polysaccharides under the action of ratio L2; (e): Changes of protein under the action of ratio L3; (f): Changes of polysaccharides under the action of ratio L3

2.5.1 不同浓度金霉素和土霉素对微生物EPS的3D-EEM分析

不同浓度金霉素和土霉素对生物除磷中微生物EPS影响的3D-EEM如图6所示。 由图6可知, 不同浓度金霉素和土霉素作用下EPS的3D-EEM均出现了2种荧光区域类型, 即荧光峰A(类酪氨酸, Ex=220~230 nm, Em=280~380 nm)和荧光峰B(类色氨酸, Ex=270~290 nm, Em=280~380 nm), 这两类物质都属于类蛋白质物质^[20]。 随金霉素、 土霉素浓度的增加类蛋白质物质荧光强度均出现先增强后减弱。 金霉素3^#反应器和土霉素6^#反应器又先后出现了第3、 4个荧光区域, 分别记作荧光峰C(类腐殖酸物质, Ex=320~370 nm, Em=380~450 nm)和荧光峰D(类富里酸物质, Ex=220~230 nm, Em=380~430 nm)^[21]。 其中金霉素生物除磷反应器比土霉素反应器多了1种类富里酸荧光峰E(Ex=240~260 nm, Em=400~430 nm)。 类富里酸物质的荧光强度随金霉素浓度的增加不断增强, 说明金霉素和土霉素虽然归属于四环素类抗生素, 但是两者对生物除磷系统中的微生物EPS影响有所不同, 可能归属两者化学结构上不同。

图6

Fig.6

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	图6 不同浓度金霉素、 土霉素3D-EEM分析图Fig.6 3D-EEM analysis of chlortetracycline and oxytetracycline at different concentrations

由以上分析, 当金霉素和土霉素浓度为0.1~5 mg· L^-1时, 随着浓度的增加, 类酪氨酸和类色氨酸的荧光强度均呈现先增强后减弱的趋势。 分析认为低浓度金霉素、 土霉素的影响下, 微生物分泌更多的蛋白质与金霉素和土霉素结合以阻止毒害作用, 故酪氨酸峰和类色氨酸峰的荧光强度不断增强。 然而当金霉素和土霉素为10~40 mg· L^-1, 随着浓度的增加, 类酪氨酸峰和类色氨酸峰的荧光强度逐渐减弱, 这表明微生物分泌蛋白质受到影响或者蛋白质与金霉素和土霉素结合导致的荧光淬灭, 因此类酪氨酸峰和类色氨酸峰荧光强度逐渐减弱。 在金霉素和土霉素的影响下产生新物质类腐殖酸和类富里酸, 并且荧光强度不断增强。 分析认为高浓度金霉素、 土霉素导致部分微生物死亡和微生物细胞破碎水解。 少部分微生物的内源性呼吸释放出有机物质, 导致类腐殖酸物质和类富里酸物质荧光强度逐渐增强^[15]。 说明了在反应后期正磷酸盐出水浓度超过进水浓度的原因。 因此金霉素和土霉素浓度的增加会导致生物除磷系统中微生物EPS组分发生改变, 同时生物除磷效果也会受到影响。

2.5.2 不同浓度配比混合物3D-EEM分析

不同浓度配比混合物对生物除磷中微生物EPS影响的3D-EEM如图7各图所示。 由图7可知, 3种不同浓度配比混合物作用下, EPS中均出现了2种类蛋白质物质, 且随浓度的增加荧光强度先增强后减弱, 相比单独的金霉素和土霉素单独作用下, 类蛋白质物质荧光强度均较弱。 配比L1和L2还出现类腐殖酸物质和类富里酸物质, 其荧光强度也相对较弱, 说明金霉素小于土霉素占比时, 只引起微生物分泌2种类蛋白质物质出现。 可能两种抗生素之间具有拮抗作用, 减弱了对微生物的毒害作用^[22]。

图7

Fig.7

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	图7 不同浓度配比混合物3D-EEM分析Fig.7 3D-EEM analysis of different ratios of mixtures

不同浓度金霉素、 土霉素及其混合物对EPS的官能团影响的FTIR光谱图如图8(a—e)所示。 由图8可知, FTIR光谱图极为相似, 但是随金霉素、 土霉素及3种配比混合物浓度的增加使某些峰产生位移以及透过率逐渐增大, 这表明金霉素和土霉素与EPS某些官能团发生作用。

图8

Fig.8

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图8 不同浓度金霉素、 土霉素及3种配比混合物作用下EPS官能团的FTIR分析 (a): 不同浓度金霉素作用下FTIR; (b): 不同浓度土霉素作用下FTIR; (c): 不同配比浓度L1作用下FTIR; (d): 不同配比浓度L2作用下FTIR; (e): 不同配比浓度L3作用下FTIRFig.8 FTIR analysis of EPS functional groups at different concentrations of chlortetracycline, oxytetracycline and their mixtures (a)FTIR at different concentration of chlortetracycline; (b): FTIR at different concentrations of oxytetracycline; (c): FTIR at different proportions and concentrations L1; (d): FTIR at different proportions and concentrations L2; (e): FTIR at different proportions and concentrations L3

由图8各图可知, FTIR光谱图中都存在3 500~3 000 cm^-1宽峰, 其中3 419~3 301 cm^-1可归属于细胞表面蛋白质N—H键伸缩振动和碳水化合物中结合水的O—H键的伸缩振动。 1 653 cm^-1吸收峰为酰胺Ⅰ 谱带的C=O伸缩振动, 吸收峰都发生右移。 1 403 cm^-1吸收峰可能归因于酰胺Ⅱ 谱带中羧基基团的C=O对称拉伸, 吸收峰未发生明显变化^[23]。 1 653和1 403 cm^-1吸收峰与蛋白质官能团相关^[24]。 1 266 cm^-1吸收峰归属于P=O伸缩振动, 吸收峰透过率随着浓度增加逐渐增大^[25]。 1 200~1 000 cm^-1范围的吸收峰为所有糖类衍生物的典型特征峰^[26]。 1 100 cm^-1吸收峰归属于糖类C—OH伸缩振动, 吸收峰发生明显的偏移^[27]。 金霉素、 土霉素及3种配比混合物浓度的改变会引起EPS中官能团的改变。

FTIR光谱图中吸收峰也存在区别。 土霉素、 配比L2、 配比L3都存在1 004 cm^-1附近P—OH伸缩振动, 900 cm^-1附近P—O伸缩振动^[27]只存在于金霉素、 土霉素、 配比L2、 配比L3中。 770 cm^-1附近氨基酸COO变角振动, 只有金霉素中不存在; 这3类吸收峰随着浓度增加吸收峰透过率逐渐增大而消失。 分析认为金霉素与土霉素之间存在拮抗作用所导致。 同时, 金霉素、 土霉素及混合物浓度的增加, 这些吸收峰都逐渐消失, 说明微生物受到高浓度毒害作用较大, 引起了EPS相关官能团发生改变。 金霉素、 土霉素及3种配比混合物对微生物EPS中的主要官能团, 即蛋白质C=O键, 多糖C—OH键、 P=O键、 P—O键、 P—OH键及氨基酸COO键产生影响。