污泥取自河南省洛阳市某污泥处理厂, 为洛阳市内某市政污水处理厂脱水污泥经好氧堆肥工艺(SACT隧道仓堆肥工艺)处理后的污泥。 污泥含水率为7.65%, pH值为7.23, 灼烧减量法(HJ 761-2015)测定有机质含量为297 g· kg^-1。 污泥风干后, 过10目不锈钢标准筛, 装入聚乙烯样品袋中, 置于冰箱中4 ℃保存。

试验土壤取自河南省洛阳市洛宜快速通道附近的玉米种植农田, 采集方法为五点取样法, 采样深度为10~15 cm。 挑出石块和杂物, 土壤过10目不锈钢标准筛后装入聚乙烯样品袋中, 置于冰箱中4 ℃保存。

取15 g新鲜土壤置于250 mL锥形瓶中, 加入100 mL去离子水, 将锥形瓶置于恒温振荡器, 150 r· min^-1、 25 ℃条件下振荡2 h, 静置。 上清液过0.45 μm玻璃纤维微孔滤膜, 滤液即为试验所需菌种液。

取3 g污泥置于50 mL锥形瓶中, 加入30 g酸洗干净石英砂作为微生物的惰性基质, 再加入5 mL菌种液和20 mL去离子水, 纱布封口。 将锥形瓶置于恒温振荡器, 在135 r· min^-1、 25 ℃条件下避光振荡1 h, 然后25 ℃条件下避光静置培养, 差重法补充蒸发散失水分。 设置空白对照组, 即只加入菌种液、 石英砂和去离子水。 分别在0.5、 1、 3、 5、 7、 15、 20、 30和60 d取样, 获得污泥释放的DOM, 每次取样均设置两组平行。

取样时, 用60 mL去离子水少量多次洗涤污泥和石英砂, 将所得溶液混合均匀。 先用纱布去除大颗粒杂质, 再过0.45 μm玻璃纤维微孔滤膜, 所得滤液即为DOM, 置于4 ℃保存备用。

通过总有机碳分析仪(岛津TOC-V_CPH)测定DOM的溶解有机碳(DOC), DOM的所有浓度都以DOC浓度表示。

UV-Vis(普析TU-1901)扫描波长范围为190~800 nm, 扫描间隔1 nm; 250与365 nm处吸光度的比值, 记为E₂/E₃; 波长范围275~295 nm拟合得到的曲线光谱斜率, 记为S_275~295; 波长范围275~295和350~400 nm拟合得到的曲线光谱斜率的比值, 记为S_R; 254 nm处的吸光度值与DOC浓度的比值, 记为SUVA₂₅₄。

3D-EEM(日立F7000)的扫描范围激发波长λ _ex=200~450 nm, 发射波长λ _em=250~600 nm, 狭缝宽度为5 nm。 自生源指数BIX为激发波长310 nm处, 发射波长380与430 nm处荧光强度的比值; 荧光指数FI为激发波长370 nm处, 发射波长470与520 nm处荧光强度的比值; 腐殖化指数HIX为激发波长254 nm处, 发射波长435~480 nm下的峰面积与300~345和435~480 nm下峰面积和的比值。 3D-EEM的平行因子(PARAFAC)分析通过使用MATLAB R2019b中的DOMFluor工具箱(http://www.models.life.ku.dk)进行。 每个DOM样品扣除纯水数据, 并进行拉曼归一化后, 再通过残差分析, 拆半检验分析和随机初始化分析等验证污泥DOM中适当的组分量。

剩余的DOM溶液冷冻干燥得到DOM固体。 将DOM固体粘结在导电胶上, 用扫描电子显微镜(SEM, 岛津FlexSEM-1000)进行形貌观察; 去离子水溶解DOM固体, 通过凝胶渗透色谱(GPC, 岛津LC20/RID-20)获得DOM分子量; 测¹H NMR(布鲁克400 MHz AVANCE Ⅲ HD)时, 用氘代水作为溶剂, 以四甲基硅烷作为内标物校准化学位移; 将DOM粉末与KBr混合研磨, 压片后获得FTIR图谱(岛津IRTracter-100)。

污泥DOM冷冻干燥后, 在外观和颜色上表现出明显差异。 第0.5 d DOM样品呈深褐色, 较为粘稠的固体; 20 d DOM样品呈浅黄色, 较为松散的絮状固体; 与20 d DOM样品相比, 60 d DOM样品颜色更浅, 形状更为松散。 如图1(a—c)所示, 污泥释放DOM冷冻干燥后的微观形貌也存在明显的变化。 第0.5 d DOM样品为堆积型致密块状物, 而第20和60 d样品为不规则松散物质。 形貌是DOM分子结构和性质的外在体现, 形貌的变化也表示出污泥还田后60 d内释放的DOM分子在性质上存在较大差异。

图1

Fig.1

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	图1 污泥释放DOM的微观形貌 (a): 0.5 d; (b): 20 d; (c): 60 dFig.1 The morphology of DOM released from sludge (a): 0.5 d; (b): 20 d; (c): 60 d

DOM的释放量常用DOC来指示, 通常DOM的浓度是DOC的2倍。 空白DOC浓度占第0.5 d DOC的9.41%, 在微生物处理下, 空白有机质的浓度可能会持续降低。 污泥在0~60 d DOC释放量(未扣除空白)的变化如图2所示。 污泥DOC释放呈现先上升后稳步下降的趋势。 在0~15 d内, DOC释放量由4.25升高至6.17 mg· g^-1污泥, 此后趋于稳定并在第60 d逐渐下降至4.63 mg· g^-1污泥。 有研究发现, 秸秆还田后, DOC释放量在前期会出现一个下降阶段, 分析认为环境中微生物的快速增值, 消耗了秸秆释放的大量易分解的有机质。 本研究中, 污泥中的易降解组份大都在堆肥过程中被分解, 0~15 d阶段主要是污泥有机质的缓慢溶解过程, 溶解趋于稳定后, 微生物对大分子有机质的降解导致DOC缓慢下降。 研究发现, 模拟旱地条件下, 水稻和油菜秸秆释放的DOC量分别为5.93~12.4和2.69~10.8 mg· g^-1秸秆, 模拟水田条件下, 水稻和小麦秸秆释放的DOC量分别为24.3~53.6和12.1~27.8 mg· g^-1秸秆^[9]。 本研究污泥模拟旱地农用释放的DOC量(4.25~6.22 mg· L^-1)与秸秆在模拟旱地条件下DOC释放量相当, 低于秸秆在模拟水田条件下的释放量, 这与高含水率条件下微生物活性高有关。 污泥农用会给土壤带来一定的有机质补充, 同时释放的DOM也会对土壤中污染物的行为产生影响。

图2

Fig.2

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	图2 污泥释放DOC的变化Fig.2 DOC released from sludge

DOM是含有碳水化合物(如氨基酸、 富里酸等)的异质混合物, 组成复杂, 很难直接测定或描述出其确切的分子或结构信息。 紫外-可见光谱E₂/E₃、 S_275~295、 S_R和SUVA₂₅₄等指标可以指示DOM的分子量和结构。

大量研究表明, E₂/E₃、 S_275~295、 S_R与DOM的分子量成反比^[5]。 如图3(a)、 (b)和(c)所示, 污泥E₂/E₃、 S_275~295、 S_R指数整体上呈现出下降趋势, 说明污泥释放出DOM分子量逐渐升高; 对比GPC测定的DOM分子量信息(表1), 污泥DOM重均分子量M_w由0.5 d时2 674 g· mol^-1的逐渐升高为60 d的129 026 g· mol^-1, 本研究中E₂/E₃、 S_275~295、 S_R整体上可以指示污泥释放DOM的分子量变化信息。 尽管污泥在好氧堆肥过程中耗尽了易降解小分子DOM, 污泥还田后微生物仍会选择分子量相对较小的DOM作为可用碳源, 小分子组分的陆续降解, 逐渐升高DOM分子的M_w值。 另外可能存在的腐殖化过程, 也会导致分子量的增加。

图3

Fig.3

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	图3 污泥释放DOM紫外光谱特征值 (a): E2/E3; (b): S275~295; (c): SR; (d): SUVA254Fig.3 UV spectral eigenvalues of DOM released from sludge (a): E2/E3; (b): S275~295; (c): SR; (d): SUVA254

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 污泥DOM分子量及荧光指数 Table 1 Molecular weight and fluorescence indices of DOM released from sludge 第0.5 d 第1 d 第7 d 第20 d 第60 d 重均分子量Mw/ (g· mol-1) 2 694 8 295 24 597 52 691 129 026 BIX 0.14 0.12 0.11 0.10 0.10 FI 2.51 2.47 2.40 2.41 2.47 HIX 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

表1 污泥DOM分子量及荧光指数 Table 1 Molecular weight and fluorescence indices of DOM released from sludge

SUVA₂₅₄与DOM分子的芳香性有关, SUVA₂₅₄值越大表明DOM的芳香性程度越高^[5]。 如图3(d)所示, SUVA₂₅₄整体呈现增加的趋势, 表明污泥在还田后释放的DOM分子中芳香性物质含量逐渐升高。 在第0.5~5 d, 随着微生物繁殖, 相对分子量较小的DOM被降解, 导致芳香性DOM快速积累; 当相对分子量较小的DOM被分解完, 前期积累的芳香性DOM成为微生物的碳源, 导致第5~10 d的SUVA₂₅₄出现下降趋势。 污泥还田后, 相对小分子物质的降解和腐殖化进程的共同作用下, 导致芳香性物质的积累。

还田后污泥释放DOM不仅在量上存在变化, 在分子量和芳香性指标上也存在变异, 可能导致共存污染物的环境行为随之改变。

荧光光谱法可以揭示DOM中有机成分的差异。 3D-EEM光谱中特定峰值归因于特定类型DOM分子所产生的特定荧光团的出现^[10]。 观察到的荧光可以是单个荧光团贡献叠加信号的函数, 也可以是相互作用的荧光团之间分子内电荷转移机制的函数^[11]。 污泥DOM的EEM光谱图见图4, 根据文献将EEM光谱分为(a—e)5个区域, 从Ⅰ 到Ⅴ 分别为类酪氨酸、 类色氨酸、 类富里酸、 类可溶性微生物副产物和类腐殖质物质^{[10, 12, 13, 14]}。 由图4可知, 在整个过程中未发现类蛋白峰, 说明污泥中易降解组分在农用前的堆肥过程中被耗尽^[15]。 污泥DOM荧光峰主要出现在区域Ⅲ (类富里酸)和Ⅴ (类腐殖质)。 类富里酸和类腐殖质荧光峰的产生与DOM中的芳香族物质或共轭系统有关, 尤其是羧基、 羰基和酚羟基等官能团。 整个过程中, 类富里酸峰和类腐殖质峰荧光强度逐渐增强, 表明污泥农用后释放的DOM中这两类物质逐渐积累, 整体上呈现腐殖化趋势。

图4

Fig.4

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	图4 污泥释放DOM的3D-EEM图 (a): 0.5 d; (b): 1 d; (c): 7 d; (d): 20 d; (e): 60 dFig.4 3D-EEM spectra of DOM released from sludge (a): 0.5 d; (b): 1 d; (c): 7 d; (d): 20 d; (e): 60 d

利用PARAFAC对污泥DOM的三维荧光光谱进行模拟, 最终分解出三个不同的荧光组分[图5(a—f)], 分别为组分C1、 C2和C3。 C1(Ex/Em: 240, 320/415 nm)的荧光特征类似于类富里酸^[12]; C2(Ex/Em: 265, 370/460 nm)和C3(Ex/Em: 210, 220, 330/440 nm)的荧光特征类似于类腐殖质^[16]。 相对于C1, C2和C3出现红移, 其腐殖质成分具有分子量高, 分子结构共轭度以及化学稳定性更高的特点。 荧光成分的最大荧光强度值(F_max)可以评估各组分的相对水平。 如表2所示, 随时间延长, 污泥DOM的C1和C3组分分别呈现下降和上升的趋势, 表明类富里酸物质在微生物作用下转变为类腐殖质, 导致污泥农用后释放的DOM中腐殖质逐渐积累。 3D-EEM图是荧光基团叠加而成, 信号重叠可能导致真正的峰值位移, 会阻碍DOM中不同荧光峰值的视觉定位。 而PARAFAC能将DOM中各组分识别出来, 利用F_max评估各组分的相对水平。 PARAFAC分析三维荧光可能更直接有效。

图5

Fig.5

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	图5 PARAFAC模型输出三个荧光组分(a、 c和e)和相应的激发/发射负载(b、 d和f)Fig.5 Three fluorescent components of DOM from PARAFAC model (a, c and e) and the corresponding excitation/emission loadings (b, d and f)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 污泥释放DOM的最大荧光强度值(Fmax)中C1、 C2和C3的相对丰度 Table 2 Relative abundance of C1, C2 and C3 in the maximum fluorescence intensity (Fmax) values of DOM released from sludge 污泥DOM Fmax的构成/% C1 C2 C3 第0.5 d 53.42 30.77 15.81 第1 d 48.67 33.67 17.66 第5 d 46.05 33.71 20.24 第7 d 44.12 30.88 25.00 第20 d 41.55 31.51 26.94 第60 d 43.85 30.18 25.98

表2 污泥释放DOM的最大荧光强度值(Fmax)中C1、 C2和C3的相对丰度 Table 2 Relative abundance of C1, C2 and C3 in the maximum fluorescence intensity (Fmax) values of DOM released from sludge

荧光指标(BIX、 FI和HIX)通常用于表征DOM的类型和来源^[13]。 BIX通常与DOM的来源相对应, 较低的BIX值表示DOM主要是陆地来源的输入^[17]。 在整个降解过程的DOM的BIX值都小于1, 表明污泥的DOM主要来自陆地来源, 如动物分解残留物和植物凋落物等。 FI常被用来表示DOM的来源, 不同时期的污泥DOM的FI值为2.40~2.51, FI> 1.9表明DOM主要由细菌和藻类活动产生, 是自生源输入^[18]。 HIX可用于表征有机质的腐殖化程度, 其值与有机质腐殖化程度呈正比, 一般认为, HIX> 0.8时, 腐殖化程度较高^[18]。

FTIR被广泛用于DOM的表征, 可以识别无机和有机官能团^[19], 不同时期污泥DOM的FTIR图可以指示DOM分子中基团的变化。 如图6所示, DOM样品的FTIR光谱在2 563~3 807 cm^-1处都有一个很宽的吸收峰, 可能由O—H(如醇、 酚、 羧基或样品中含有的水)伸缩、 N—H(氨基酸)伸缩振动和C—H键(CH₃和CH₂)伸缩重叠造成^[19]。 此外, DOM在1 671、 1 382、 1 121和617 cm^-1处有明显的吸收峰: 1 671 cm^-1处吸收峰可能与C=C伸缩(烯烃)有关; 1 382 cm^-1处可能是COO伸展、 酚OH变形和C—O伸缩振动造成; 1 121 cm^-1处可能是脂肪醚伸缩振动或糖类成分和芳香环高度缩合造成; 617 cm^-1处吸收峰是由Si—O变形振动、 OH的里外变形振动、 C—Cl(脂肪族)伸缩振动、 肽类或蛋白质、 苯环上C—H面外弯曲振动造成^[8]。

图6

Fig.6

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	图6 污泥释放DOM的FTIR图Fig.6 FTIR spectra of DOM released from sludge

在污泥释放DOM的不同时期, DOM的吸收峰表现出明显差异。 第5~60 d, 2 563~3 807 cm^-1处的宽吸收峰变窄(2 936~3 686 cm^-1), C—H键(CH₃和CH₂)的吸收峰消失, 表明在微生物的作用下, CH₃和CH₂的含量不断减少, 即脂肪族烷烃类物质减少, 微生物主要以脂肪族烷烃类物质作为主要碳源, 这也从侧面进一步证实了污泥释放DOM中芳香性物质和腐殖质的积累。 1 593 cm^-1处吸收峰是芳香烃C=C骨架振动引起, 整个过程中1 593 cm^-1处吸收峰发生红移, 最终在1 580 cm^-1出现明显的吸收峰, 这是由于污泥DOM分子中不断出现新的芳香性物质结构, 邻近原子或基团的诱导效应或共轭效应使芳香烃C=C基团中电荷分布或双键性质发生改变, 导致吸收峰红移。 脂肪族烷烃类物质的减少和芳香烃物质生成, 与SUVA₂₅₄指示的污泥DOM芳香性逐渐增加相一致。

核磁共振(NMR)波谱是研究DOM中官能团的方法之一。 ¹H NMR可以提供DOM中不可交换的结构质子分布信息, 以量化DOM的芳香性和腐殖化程度^[19]。 图7为(0~60尺)污泥DOM的¹H NMR谱图。 其中, 化学位移4.5~6.25 ppm区域是溶剂氘代水的吸收峰。 如表3所示, DOM样品中芳香结构中H的含量呈现增加趋势, 与SUVA₂₅₄结果一致, 表明污泥农用后释放的DOM中芳香性物质不断积累。 然而, ¹H NMR结果显示在第0.5~60 d DOM样品中芳香结构中H的含量始终低于2%, 表明污泥DOM中的芳香族化合物较少, 与光谱结果中DOM分子腐殖化程度高相矛盾。 究其原因, ¹H NMR只能指示DOM中H的信息, 无法指示部分不含H的芳香结构信息。 在第0.5~60 d DOM样品中硫醚的H或连N的C上H的含量持续降低, 从22.2%被消耗至11.2%。 含氮有机质可以影响微生物合成蛋白质和核酸, 因此微生物主要以含氮和含硫的有机质作为碳源和氮源。 硫醚类和含氮有机质最终被转化为醇类、 酯类和芳香类物质等, 此过程可能包含有机质的分解、 缩合、 聚合产生新的衍生物等一系列复杂变化。

图7

Fig.7

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	图7 污泥释放DOM的1H NMR图Fig.7 1H NMR spectra of DOM release from sludge

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 污泥释放DOM中H的含量 Table 3 H content in DOM release from sludge 化学位移/ppm 归属 0.5 d 7 d 20 d 60 d 0.25~1.75 脂肪族烷基中H的吸收 24.1 22.0 28.2 30.3 1.75~3.25 硫醚中H或连N的C上H的吸收峰 22.2 21.1 14.1 11.2 3.25~4.5 醇类、 醚类、 酯类上的H或与卤素相连C上的H的吸收 52.5 56.0 57.1 57.0 6.25~8.5 芳香结构中H的吸收 1.2 0.9 0.7 1.5

表3 污泥释放DOM中H的含量 Table 3 H content in DOM release from sludge