当归痛风方对小鼠高尿酸血症肾病的FTIR研究

引用本文

刘必旺, 路荣荣, 曹越, 王秀文, 赵换, 郝渺, 马晓霞, 马艳苗, 王永辉. 当归痛风方对小鼠高尿酸血症肾病的FTIR研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2024,44(3): 800-806.
LIU Bi-wang, LU Rong-rong, CAO Yue, WANG Xiu-wen, ZHAO Huan, HAO Miao, MA Xiao-xia, MA Yan-miao, WANG Yong-hui. FTIR Study on the Effect of DangGuiTongFengFang on Hyperuricemia Nephropathy in Mice[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2024,44(3): 800-806.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2024)03-0800-07 复制到剪切板

Permissions

《光谱学与光谱分析》期刊社所有

当归痛风方对小鼠高尿酸血症肾病的FTIR研究

刘必旺¹, 路荣荣², 曹越², 王秀文³, 赵换⁴, 郝渺³, 马晓霞³, 马艳苗², 王永辉²

1.山西中医药大学傅山学院, 山西榆次 030619

2.山西中医药大学基础医学院, 山西榆次 030619

3.山西中医药大学中药与食品工程学院, 山西榆次 030619

4.山西中医药大学附属医院药剂科, 山西太原 030024

作者简介: 刘必旺, 1979年生, 山西中医药大学傅山学院副教授 e-mail: LBW3084@sina.com

收稿日期: 2022-07-27 修回日期: 2022-11-27 接受日期: 2022-11-27

基金: 国家自然科学基金重点支持项目(U21A20410), 山西中医药大学科技创新团队(2022TD2005), 山西省高等学校大学生创新创业训练计划项目(20220718), 山西省自然科学研究面上项目(202203021211217)资助

摘要

傅里叶变换红外光谱(FTIR)是鉴别物质和分析物质结构的有效手段, 可对样品进行定性和定量分析, 广泛应用于医药化工等众多领域。 FTIR作为一种操作简便、实用、准确率高和费用低的鉴别方法, 如今已经普遍应用于各种药品检验中, 而有关其应用于药理研究中还非常少, 目前仅有采用红外光谱分析法对各种肿瘤组织进行研究的报道。高尿酸血症肾病是人体血尿酸升高后, 过高的尿酸负荷超过肾脏的清除能力, 尿酸结晶沉积于集合管、肾盂和尿道等。采用FTIR技术评价高尿酸血症肾病模型, 并评价药物的药效, 具有一定的可行性。该实验为探讨FTIR评价高尿酸血症肾病模型和当归痛风方疗效的科学性, 将60只KM小鼠随机分为6组, 正常对照组、模型组、阳性对照组和当归痛风方低、中、高组, 采用氧嗪酸钾复制高尿酸血症肾病模型, 灌胃当归痛风方, 检测血清UA、尿液UA、血清CRE、尿液CRE、血清IL-1β和肾脏IL-1β、肾脏FTIR谱图等, 并观察肾脏的病理变化。结果表明模型组各项指标与正常组比较有统计学意义( p<0.05), 当归痛风方高剂量组的血清UA、血清CRE、血清IL-1β和肾脏IL-1β等与模型组比较且有统计学意义( p<0.05)。当归痛风方高剂量组肾脏的病理变化有所改善, 无炎性细胞浸润, 管腔内无管型, 说明对肾损伤具有保护作用。各组FTIR谱有明显的差异, 模型组的强度均低于正常组, 阳性对照组和当归痛风方高剂量组谱接近正常组, 进一步说明当归痛风方对肾损伤具有保护作用。研究表明FTIR可以作为一种简便快捷灵活经济的评价动物模型及药物疗效的方法之一, 也为高尿酸血症肾病模型及有效药物的筛选提供了一个有意义的技术手段。该实验拓展了FTIR检测方法的使用范围。

关键词: 高尿酸血症肾病; 当归痛风方; 尿酸; 肌酐; 傅里叶变换红外光谱仪

中图分类号:R285.5 文献标志码:A

FTIR Study on the Effect of DangGuiTongFengFang on Hyperuricemia Nephropathy in Mice

LIU Bi-wang¹, LU Rong-rong², CAO Yue², WANG Xiu-wen³, ZHAO Huan⁴, HAO Miao³, MA Xiao-xia³, MA Yan-miao², WANG Yong-hui²

1. FUSHAN College, Shanxi University of Chinese Medicine, Yuci 030619, China

2. Basic Medicine College, Shanxi University of Chinese Medicine, Yuci 030619, China

3. College of TCM and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Yuci 030619, China

4. Pharmacy Department, Affiliated Hospital of Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030024, China

Abstract

The Fourier transform infrared spectrometer (FTIR) is an effective method to identify and analyze the structure of substances. It can be used to characterize Quantitative analysis samples and is widely used in many fields, such as medicine and the chemical industry. FTIR, as a simple, practical, accurate and low-cost identification method, has been widely used in drug testing, but its application in pharmacological research is very limited. There are only reports on the study of various kinds of tumor tissues by infrared spectrum analysis. Hyperuricemia nephropathy is a condition in which a high uric acid load exceeds the ability of the kidneys to clear the elevated level of serum uric acid. The uric acid crystals are deposited in collecting ducts, the renal pelvis and the urethra. Therefore, it is feasible to use FTIR to evaluate the Hyperuricemia nephropathy model and evaluate the efficacy of drugs. To explore the feasibility of FTIR in evaluating the Hyperuricemia nephropathy model and the therapeutic effect of DangGuiTongFengFang, 60 km mice were randomly divided into 6 groups, the Rats in the normal control group, model group, positive control group and the low, middle and high groups of the Chinese angelica gouty prescription were treated with potassium oxonateto make the model of Hyperuricemia nephropathy, serum UA, urine UA, serum CRE, urine CRE, serum IL-1β, renal IL-1β and FTIR spectra were detected. The results showed that the indexes of the model group were significantly different from those of the normal group ( p<0.05), and the serum levels of UA, CRE, IL-1β and renal IL-1β in the high-dose group were also significantly higher than those in the model group ( p<0.05). The pathological changes of the kidney in the high-dose group were improved, with no inflammatory cell infiltration and no tubular type in the lumen, indicating that the high-dose group has a protective effect on the kidney injury. The FTIR spectra of the model group were lower than that of the normal group. The FTIR spectra of the positive control group and the high-dose group of DangGuiTongFengFang were close to that of the normal group. It is further indicated that DangGuiTongFengFang has a protective effect on renal injury. The study shows that FTIR can be used as a simple, quick, flexible and economical method to evaluate the animal model and the therapeutic effect of drugs. It also provides a significant technical means for the Hyperuricemia nephropathy model and the screening of effective drugs. This experiment extends the application range of the FTIR detection method.

Keyword: Hyperuricemia nephropathy; Danggui Gout Formule; Uric acid; Creatinine; Fourier Transform Infrared Spectrometer

文章图片

引言

高尿酸血症肾病(Hyperuricemia)是人体血尿酸升高后(高尿酸血症), 过高的尿酸负荷超过肾脏的清除能力, 因尿酸结晶沉积于集合管、肾盂和尿道, 产生肾内、甚至肾外梗阻所引起肾脏损害^[1]。早期机体表现为尿浓缩功能减退, 其后逐步出现肾小球滤过率下降, 血肌酐升高, 导致慢性肾功能不全^[2]。近年来, 随着高尿酸血症发病率的日益提高, 高尿酸肾病发病率也显著逐年增高^[3]。因此, 寻求包括中医药方法在内的高尿酸肾血症病的有效防治措施, 具有重要意义。

当归痛风方国医大师王世民教授治疗高尿酸血症肾病的常用方, 该方是由《伤寒论》中的当归四逆汤基础上进行加减化裁而成, 其组成为当归、桂枝、芍药、通草、炙甘草、黄芪、土茯苓、山楂等。当归四逆汤主要用于治疗血虚受寒之证, 例如手足逆冷、舌淡苔白、脉细欲绝等症状。高尿酸血症作为一种代谢性疾病, 从中医角度是由于人体正气不足, 卫气不固, 感染了风、寒、湿、热导致经络闭阻引发的肌肉、筋骨、关节发生疼痛、屈伸不利、重者关节肿大变形。当归痛风方中黄芪鼓舞人体正气, 桂枝散寒祛风; 桂枝、芍药、当归、通草通脉活血, 土茯苓清热祛湿, 山楂健脾祛湿。故本方针对病机, 组成严谨, 疗效确切。

傅里叶变换红外光谱仪(FTIR), 同色散型红外分光的原理, 是基于对干涉后的红外光进行傅里叶变换的原理而开发的红外光谱仪^[4]; 是鉴别物质和分析物质结构的有效手段, 可对样品进行定性和定量分析, 广泛应用于医药化工等领域^[5]。 FTIR作为一种操作简便、实用、准确率高和费用低的鉴别方法, 如今已经普遍应用于各种药品检验中, 而有关其应用于药理研究中非常少。

目前已有采用红外光谱分析法对各种肿瘤组织对大小鼠死亡时间进行研究的报道。董勤等^[6]对鼻咽癌患者以及胃癌患者的指甲进行了红外光谱研究; 孙雷明等^{[7, 8]}对肺癌组织进行了研究。王磊等研究结果表明大鼠死后肾肝脾等组织FTIR光谱特征具有差异, 因此可以采用光谱推断死亡时间^{[9, 10]}。采用FTIR研究高尿酸血症肾病具有可行性。

本工作探讨高分辨率的傅里叶变换红外光谱仪快速地测定正常肾组织和高尿酸血症肾病模型肾组织以及当归痛风方高中低剂量干预的肾组织, 分析比较正常组和模型组及各给药组的红外光谱吸收差别。本工作使用FTIR技术评价高尿酸血症肾病小鼠模型, 并评价药物的药效, 为药物药理学研究及药物对生物组织微观结构的影响及其发生机制探讨提供了积极的参考。

1 实验部分

1.1 仪器

红外光谱仪(Cary50)美国赛默飞IS10型; Pannoramic250数字切片扫描仪(Pannoramic250)匈牙利3DHISTECH(Hungary); 研磨仪(KZ-Ⅱ )Servicebio; 电热鼓风干燥箱(GZX-9146MBE)上海博迅实业有限公司医疗设备厂; 酶标检测仪(Rt2100c)美国赛默飞K3 Touch; 全自动生化分析仪(AU5800)美国Beckman公司。

1.2 动物样品

SPF级健康雄性KM小鼠60只, 6~8周龄, 18~24 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 许可证号: SCXK(京)2016-006。饲养于山西中医药大学中医脑病学山西省重点实验室超净饲养单元内, 许可证号: SYXK(晋)2020-0006。

1.3 药物和试剂

当归痛风方药物组成: 当归12 g、桂枝9 g、白芍9 g、黄芪9 g、甘草6 g, 通草6 g、山楂6 g、土茯苓15 g等。中药饮片由上海康桥中药饮片有限公司提供。水煎浓缩, 药物配制好后置于-20 ℃冰箱中分装保存, 临用前恢复至室温备用。别嘌醇胶囊(黑龙江澳利达奈德制药有限公司, 批号: H20181432) 250 mg· 粒^-1。

尿酸(UA)试剂盒(20200921); 白细胞介素-1β (inter-leukin-1β )测定试剂盒(ab254360)abcam公司; 苏木素染液(ZH202509)、伊红染液(CR2011064)武汉塞维尔生物科技有限公司; 溴化钾(20190920)天津市北辰方正试剂厂; 氧嗪酸钾(C10099414)上海麦克林生化科技有限公司; 别嘌呤醇(20190901)广东彼迪药业有限公司; 羧甲基纤维素钠(2018102701)成都市科龙化工试剂厂。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模及给药

60只雄性KM小鼠适应性喂养7 d以后, 随机分为正常对照组(NC)、模型组(MC)、当归痛风方低剂量组(DD, 3.9 g· kg^-1· d^-1)、当归痛风方中剂量组(DZ, 7.8 g· kg^-1· d^-1)、当归痛风方高剂量组(DG, 15.6 g· kg^-1· d^-1)、阳性对照组(YC, 别嘌醇, 10 mg· kg^-1· d^-1), 每组10只。当归痛风方灌胃1周后, 实验组于每天上午9点给予腹腔注射0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制的氧嗪酸钾溶液14 d, 诱导高尿酸血症肾病模型^{[1, 2]}。各组小鼠造模1 h后, 灌胃相应剂量药物, 正常对照组灌胃等剂量生理盐水。腹腔注射剂量为0.1 mL· 10g^-1, 灌胃剂量为0.2 mL· 10g^-1。

1.4.2 样品收集

实验第20天, 将所有小鼠放入代谢笼中, 正常饮水和饮食, 收集尿液样本24 h, 2 000 r· min^-1离心10 min, 置于4 ℃保存, 用于测定尿尿酸、肌酐水平, 并记录24 h尿量。在第21天末次给药1 h后处死动物, 之后收集血清和肾脏。使血清凝结大约1 h, 然后4 ℃, 3 000 r· min^-1离心10 min, 用于测定血清尿酸、肌酐和IL-1β 水平。将部分肾脏制成匀浆, 进行IL-1β 水平检测。部分肾脏进行病理学组织检测和傅里叶变换红外光谱仪分析。

1.4.3 生化指标的测定

血清和尿液的尿酸(UA)、肌酐(CRE), 以及肾脏和血清中的IL-1β 水平的测定, 均按照试剂盒使用说明书进行检测。

1.4.4 肾脏苏木精-伊红(HE)染色

取肾脏组织, 经4%多聚甲醛固定, 固定状态良好后, 按照病理检测SOP程序进行染色操作, 最后镜检。每张切片先于40倍下观察全部组织, 选择肾脏髓质和皮质, 采集200倍图片, 观察具体病变。

1.4.5 傅里叶变换红外光谱分析肾组织

取各组的部分肾组织于冷冻干燥仪中干燥后, 在玛瑙研钵中研磨成细粉末, 并与溴化钾混匀, 装入模具内在压片机上压制1 mm的透明薄片, 置于傅里叶变换红外光谱仪中测定红外光谱。使用OMNIC软件分析处理所有光谱数据, 按组将数据归一化处理后, 通过统计谱图获得各组的肾组织红外光谱平均谱图, 对所得红外光谱均值中的各个谱带的峰位进行标定^[11], 并对其进行二阶导数转换以便做进一步分析模型组与正常组, 各施药组与模型组大鼠肾组织红外光谱特征的差异。

1.4.6 统计学处理

数据用平均值± 标准差( $\overset{̅}{x}$ ± s)表示, 采用SPS22.0进行单因素方差分析, LSD法进行组间进行多组间比较, p< 0.05时表示差异有统计学意义, 使用GraphPad Prism9作图。

2 结果与讨论

2.1 当归痛风方对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症肾病小鼠体重的影响

模型组中, 体重增长受到抑制。随着时间的延长, 各治疗组小鼠体重也呈现出稳定增长的趋势, 且与模型组比较有统计学差异(p< 0.05)。

Figure Option
View Download New Window

图1 当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠体重的影响(n=10)
注: 与正常组比较^#p< 0.05, 与模型组比较^*p< 0.05; NC正常对照组, MC模型组, DD低剂量组, DZ中剂量组, DG高剂量组, YC阳性对照组(下图同)Fig.1 Effect of DangGuiTongFengFang on body weight of Hyperuricemia nephropathy mice (n=10)
Note: ^#p< 0.05 vs. the normal group, ^*p< 0.05 vs. the model group; NC: Normal control group; MC: Model group; DD: Low dose group; DZ: Middle dose group; DG: High dose group; YC: Positive control group. (the same as below)

2.2 当归痛风方对血清UA、 CRE和尿液UA、 CRE的影响

尿液中CRE的变化可以作为肾脏早期损伤的标志。与正常对照组比较, 模型组血清UA、 CRE水平均升高(p< 0.05), 尿液UA、 CRE水平均降低(p< 0.05), 表明模型组已经出现早期肾功能损伤, 说明高尿酸血症肾病的小鼠模型复制成功(表1)。

表1 当归痛风方对小鼠血清和尿液的UA、 CRE的影响(

\overset{̅}{x}

± s, n=10) Table 1 Effect of Danggui Gout Formule on UA and CRE in serum and urine of mice (

\overset{̅}{x}

± s, n=10)

分组	指标
分组	Serum UA/(μ mol· L^-1)	Serum CRE/(μ mol· L^-1)	Urine UA/(μ mol· L^-1)	Urine CRE/(μ mol· L^-1)
NC	39.38± 1.24	24.16± 0.61	108.14± 5.21	150.54± 10.05
MC	98.96± 6.86^#	38.32± 0.24^#	60.36± 11.28^#	42.36± 26.05^#
DD	80.75± 14.07	32.68± 0.76^*	80.33± 10.04	103.55± 14.27^*
DZ	69.03± 10.87	32.12± 0.56^*	92.35± 6.20^*	100.12± 10.36^*
DG	62.94± 16.61^*	28.46± 1.21^*	96.75± 6.94^*	121.33± 2.94^*
YC	64.54± 4.96^*	27.67± 0.69^*	96.35± 3.77^*	125.24± 6.79^*

注: 与正常组比较^#p< 0.05, 与模型组比较^*p< 0.05(下表同)

表1 当归痛风方对小鼠血清和尿液的UA、 CRE的影响(

\overset{̅}{x}

± s, n=10) Table 1 Effect of Danggui Gout Formule on UA and CRE in serum and urine of mice (

\overset{̅}{x}

± s, n=10)

与模型组比较, 别嘌醇和当归痛风方高剂量组降低了血清UA水平(p< 0.05)。当归痛风方高、中、低剂量组也显著降低了血清CRE水平(p< 0.05)。当归痛风方各剂量组对尿液中的UA、 Cr水平均有升高趋势(p< 0.05), 表明当归痛风方有潜在的肾保护作用(表1)。

2.3 当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠24 h尿量的影响

由图2所知, 与模型组比较, 当归痛风方高剂量组可以提高24 h尿量, 有统计学意义(p< 0.05)。

	Figure Option View Download New Window
	图2 当归痛风方对小鼠24 h尿量的影响Fig.2 Effect of EangGuiTongFengFang on 24 h urine volume of mice

2.4 当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠血清和肾脏IL-1β 水平的影响

由表2所示, 与模型组比较, 当归痛风方低剂量与高剂量的小鼠血清IL-1β 和肾脏IL-1β 均有统计学意义(p< 0.05)。

表2 当归痛风方对小鼠血清IL-1β 和肾脏IL-1β 水平的影响(

\overset{̅}{x}

± s, n=10) Table 2 Effect of Danggui Gout Formule on serum IL-1β and renal IL-1β levels (

\overset{̅}{x}

± s, n=10)

分组	指标
分组	Serum IL-1β /(pg· mL^-1)	Kidney IL-1β /(pg· mL^-1)
NC	60.20± 2.02	72.14± 2.07
MC	98.38± 11.64^#	114.24± 11.37^#
DD	74.48± 9.43^*	86.07± 10.46^*
DZ	82.01± 7.13	94.32± 7.68
DG	63.46± 10.22^*	76.86± 7.25^*
YC	73.34± 7.27^*	80.04± 6.82^*

表2 当归痛风方对小鼠血清IL-1β 和肾脏IL-1β 水平的影响(

\overset{̅}{x}

± s, n=10) Table 2 Effect of Danggui Gout Formule on serum IL-1β and renal IL-1β levels (

\overset{̅}{x}

± s, n=10)

2.5 当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠肾脏组织病理学的影响

由图3可知, 正常组小鼠皮质和髓质分界清晰, 肾小球结构完整清晰, 未见炎性渗出; 肾小管上皮细胞结构正常, 未见明显坏死; 间质内未见明显炎性细胞浸润和纤维组织增生。

Figure Option
View Download New Window

图3 当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠肾脏组织病理结果的影响
(a): NC组(HE, × 200); (b): MC组(HE, × 200); (c): DD组(HE, × 200); (d): DZ组(HE, × 200); (e): DG组(HE, × 200); (f): YC组(HE, × 200)Fig.3 Effect of DangGuiTongFengFang on renal histopathology in mice
(a): NC(HE, × 200); (b): MC(HE, × 200); (c): DD(HE, × 200); (d): DZ(HE, × 200); (e): DG(HE, × 200); (f): YC(HE, × 200)

模型组肾小管轻微扩张, 部分管型内见透明管型和白细胞管型, 白细胞管型内见杆状核中性粒细胞和和单个核圆形深染的淋巴细胞, 间质内伴有炎性细胞浸润, 主要为淋巴细胞, 亦见纤维组织增生, 以核呈长梭形的纤维细胞为主, 部分集合管见透明管型。

当归痛风方低、中、高剂量组以及别嘌醇组均可以不同程度改善小鼠肾脏损伤, 主要表现在肾小管上皮细胞结构正常, 无炎性细胞浸润, 管腔内无管型。

2.6 健康小鼠肾组织红外光谱

小鼠肾组织的FTIR图谱在900~3 500 cm^-1之间共出现18个关于生物大分子的吸收峰, 分别为969.83、 1 080.83、 1 170.94、 1 236.78、 1 309.99、 1 340.46、 1 396.86、 1 454.54、 1 543.62、 1 656.89、 1 741.40、 2 852.37、 2 871.57、 2 923.49、 2 957.96、 3 013.45、 3 068.31和3 291.26 cm^-1。图4为健康小鼠肾组织的平均FTIR谱, 生物大分子的分子结构可以通过峰位大致描述, 为高尿酸血症肾病小鼠找到标准化健康对照。表3列出关于生物大分子谱带的指认结果。

	Figure Option View Download New Window
	图4 健康小鼠不同波数范围的平均傅里叶变换红外光谱Fig.4 Average FTIR of healthy mice in different wave number ranges

表3 健康小鼠生物大分子的图谱指认 Table 3 Identification of biomacromolecules in healthy mice

频率/cm^-1	振动方式	主要贡献
969.83	$ν_{s_{P O_{3}^{- 2}}}$	核酸、磷酸化蛋白质
1 080.83	$ν_{s_{P O_{2}^{-}}}$	DNA、 RNA、磷脂
1 170.94	ν _C-O	蛋白质中的C-O和脂类中的C-O
1 236.78	$ν_{a s_{P O_{2}^{-}}}$	RNA、 DNA
1 309.99	酰胺Ⅲ + $δ_{s_{C H_{3}}}$	胶原
1 340.46	酰胺Ⅲ + $δ_{s_{C H_{3}}}$	胶原
1 396.86	$δ_{s_{C H_{3}}}$	蛋白质
1 454.54	$δ_{a s_{C H_{3}}}$	蛋白质、脂类、核酸
1 543.62	酰胺Ⅱ 的、 δ _N-H	蛋白质
1 656.89	酰胺Ⅰ 的ν _C=O	蛋白质
1 741.40	ν _C=O	脂类
2 852.37	$ν_{s_{C H_{2}}}$	脂类、蛋白质
2 871.57	$ν_{s_{C H_{3}}}$ 脂类
2 923.49	$ν_{a s_{C H_{2}}}$	脂类、蛋白质
2 957.96	$ν_{a s_{C H_{3}}}$	脂类、核酸、蛋白质
3 013.45	ν _C-H	脂类的不饱和碳上的C-H
3 068.31	ν _N-H	蛋白质酰胺B带
3 291.26	ν _N-H蛋白质酰胺A带

注: ν : 伸缩振动; ν _s/ν _as: 对称/非对称伸缩振动; δ : 弯曲振动; δ _s/δ _as: 对称/非对称弯曲振动

表3 健康小鼠生物大分子的图谱指认 Table 3 Identification of biomacromolecules in healthy mice

2.7 高尿酸血症肾病模型小鼠与健康小鼠的肾组织FTIR光谱谱图比较

高尿酸血症肾病模型小鼠和健康小鼠的肾组织傅里叶变换红外谱吸收峰主要集中在900~1 800、 2 800~3 500 cm^-1两个波段内。

图5和图6分别为高尿酸血症肾病模型组与正常对照组肾组织的红外光谱, 两者的峰位、峰强、峰形均有差异, 结果见表4。

	Figure Option View Download New Window
	图5 MC与NC肾组织900~1 800 cm^-1 FTIRFig.5 The FTIR on 900~1 800 cm^-1 renal tissue of NC and MC

	Figure Option View Download New Window
	图6 MC与NC肾组织2 800~3 500 cm^-1 FTIRFig.6 The FTIR of 2 800~3 500 cm^-1 renal tissue of MC and NC

表4 高尿酸血症肾病小鼠与健康小鼠肾组织波数与吸光度 Table 4 Wave number and absorbance of renal tissue in Hyperuricemia mice

由图5与图6、表4可以看出, MC与NC小鼠肾组织的红外光谱特征有一定差异, 在MC肾组织光谱中, 3 013 cm^-1附近为脂类的不饱和碳C-H的吸收, 3 068 cm^-1附近为蛋白质酰胺B带的吸收, 处于3 013 cm^-1附近吸收峰的强度高于3 068 cm^-1附近的吸收峰, 而NC小鼠肾组庄光谱中则相反。

MC肾组织中1 170和1 741 cm^-1附近是蛋白质与脂类C-O、脂类C=O的吸收谱带, 肾组织病变后的吸收峰强度有所降低, 甚至消失。与NC小鼠肾组织相比, MC小鼠肾组织在1 170 cm^-1附近峰强较弱的谱带有蓝移现象, 其主要来自于蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的C-O(H)伸缩振动, 表明肾组织病变后破坏了氨基酸残基C-O(H)基团的结合氢键。

与NC肾组织相比, MC小鼠肾组织在969、 1 080、 1 236、 1 340、 2 852、 2 923、 3 013和3 291 cm^-1附近的吸收峰发生红移, 其他吸收峰发生蓝移。从NC小鼠正常组织到高尿酸血症病变组织, 969 cm^-1附近由于磷酸化蛋白振动的谱带吸收强度逐渐减弱^[7]。 1 080.38 cm^-1的吸收峰表明高尿酸血症肾病小鼠肾组织中细胞的DNA含量有所减少, 可能与高尿酸血症肾病导致肾小管上皮细胞凋亡有关。 1 236.67 cm^-1表明细胞内核酸氢键化程度有所降低。

1 741、 2 871和3 013 cm^-1附近的各特征带均与脂类相关, 1 170、 1 543、 1 656和3 068 cm^-1附近来自蛋白质分子, 1 080和1 236 cm^-1附近则与核酸相关。在不同生理或病症条件下, 大分子浓度信息可以从各特征带的分配、吸光度比值观察出来, 进一步了解生物大分子的组成及结构的改变。与NC比较, MC小鼠肾组织的特征吸光比A_{1 080}/A_{2 871}、 A_{1 236}/A_{2 871}明显降低; A_{1 543}/A_{2 871}、 A_{3 068}/A_{2 871}、 A_{1 543}/A_{1 080}、 A_{1 656}/A_{1 080}明显升高。 A_{1 080}/A_{2 871}、 A_{1 236}/A_{2 871}表现为核酸相对于脂类的含量; A_{1 543}/A_{2 871}、 A_{3 068}/A_{2 871}为蛋白质相对于脂类的含量; A_{1 543}/A_{1 080}、 A_{1 656}/A_{1 080}为蛋白质相对于核酸的含量, 表明高尿酸小鼠肾组织中蛋白质的含量相对于脂类含量、蛋白质含量相对于核酸含量呈明显上升趋势, 核酸含量相对于脂质含量呈下降趋势。

2 852与2 871 cm^-1附近分别指代脂质的亚甲基对称振动、甲基对称振动, 2 923 cm^-1附近处与2 957 cm^-1附近处分别指代亚甲基非对称振动、甲基非对称振动。与NC比较, MC小鼠肾组织A_{2 852}/A_{2 871}, A_{2 923}/A_{2 957}比值增大, 表明细胞膜脂质中甲基、亚甲基基团数量发生了相对变化, 烃链变长。

1 396 cm^-1附近处与1 454 cm^-1附近处分别指代蛋白质的甲基对称与非对称弯曲振动。 MC小鼠肾组织的A_{1 454}/A_{1 396}比NC小鼠肾组织的数值大, NC中1 454 cm^-1处的吸收峰相对强度弱于1 398 cm^-1处的相对强度。而在MC中这两处吸收峰的相对强度大小相等, 表明与健康肾组织比较, 高尿酸血症肾病肾组织中蛋白质分子的甲基反对称弯曲振动相对于对称弯曲振动基团数目增加^[5]。

2.8 当归痛风方的肾组织FTIR光谱谱图比较

由图7可以看出, 当归痛风方各剂量组肾组织傅里叶变换红外谱吸收峰主要集中在900~1 800、 2 800~3 500 cm^-1两个波段内, 且排列比较有规律。越接近模型组, 峰逐渐变小, 谱图变得越扁平。推测可能对肾组织损伤越大, 肾组织中的成分越单一。

	Figure Option View Download New Window
	图7 当归痛风方的肾组织FTIR光谱谱图Fig.7 FTIR spectra of kidney tissue of Danggui Gout Formule

从当归痛风方对高尿酸血症肾病小鼠体重、血清UA血清CRE、尿液UA、尿液CRE、血清IL-1β 、肾脏IL-1β 和病理切片等的影响可知, 当归痛风方的高剂量组和阳性对照组与模型组比较有统计学意义。由图7当归痛风方的肾组织FTIR光谱比较可进一步证明了以上的分析。由图7分析可知, NC、 MC、 YC、 DD、 DZ、 DG之间有明显变化差异, MC的强度均低于NC。 DG与YC的谱图接近NC, 说明当归痛风方高剂量和阳性对照药物对高尿酸血症肾病治疗效果好。从图8当归痛风方肾组织FTIR的二阶导数谱也进一步证明了以上分析。

	Figure Option View Download New Window
	图8 当归痛风方肾组织FTIR的二阶导数谱图Fig.8 Second derivative FTIR spectra of kidney tissue of Danggui Gout Formule

3 结论

目前高尿酸血症肾病的辅助诊断有影像学技术, 包括肌骨超声、高频超声等, 但超声主要有超声波穿透力弱、无法完整的显示解剖结构、受气体影响大、与操作者的经验、技术水平密切相关等局限性^[12]。近年来, 傅里叶变换红外光谱技术因其能快速、准确、直观地观察出患病组织的红外谱变化而广泛用于诊断乳腺癌、关节炎、白血病等多种疾病, 许多学者通过傅里叶变化红外光谱技术观察正常与患病组织的蛋白质、核酸、糖类、脂质等生物大分子的红外光谱变化, 进而鉴别和区分正常组织与患病组织, 找到疾病诊断的新途径^{[13, 14]}。

本实验首先建立小鼠高尿酸血症肾病模型, 通过体重、血清UA、血清CRE、尿液UA、尿液CRE、血清IL-1β 、肾脏IL-1β 和病理切片等指标评价了当归痛风方治疗高尿酸血症肾病的效果。实验结果表明当归痛风方治疗高尿酸血症肾病疗效确切, 即当归痛风方具有促尿酸排泄和改善肾功能的作用, 体现为使高尿酸血症肾病小鼠血清尿酸、肌酐水平降低, 尿液尿酸、肌酐水平增多, 同时改善了高尿酸血症肾病小鼠的肾脏病理结果。

高尿酸血症肾病模型小鼠与健康小鼠的肾组织FTIR光谱图及比较分析, 当归痛风方对高尿酸血症肾病的肾组织FTIR光谱图及比较分析, 也证明模型复制成功, 并说明当归痛风方具有改善高尿酸血症肾病的作用, 这与前面的分析结果一致。 FTIR检测比尿酸、肌酐检测及病理分析经济、快速、简便、实用、准确率高, 并能分析药物对生物组织微观结构的影响及其发生机制^[12], 因此具有其他检测方法无可比拟的优势。本工作首次采用FTIR检测方法评价高尿酸血症肾病小鼠模型, 并首次采用FTIR检测方法对药物的疗效进行评价。为高尿酸血症肾病的动物实验及药物评价具有重要的参考意义和价值, 这种意义和价值并可进一步向临床转化, 并拓展FTIR检测方法的使用范围。

参考文献

文献列表

[1]	LEI Huan, DENG Qin, LIU Zi-yuan, et al(雷欢, 邓琴, 刘子源, 等). Shand ong Medical Journal(山东医药), 2022, 62(14): 9. [本文引用:2]
[2]	GUO Ya-fang, DING Ling, QIAO Chun-ping, et al(郭亚芳, 丁铃, 乔春萍, 等). World Chinese Medicine(世界中医药), 2022, 17(7): 965. [本文引用:2]
[3]	SHUI Guang-xing, YE Jiong, LI Sha-luo, et al(水光兴, 叶炯, 李莎罗, 等). Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Nephrology(中国中西医结合肾病杂志), 2021, 22(10): 878. [本文引用:1]
[4]	WANG Zhong-hui(王忠辉). Laboratory Science(实验室科学), 2021, 24(5): 15. [本文引用:1]
[5]	WANG De-fa, ZHOU Feng-ran, YE Jing, et al(王德发, 周枫然, 叶菁, 等). Metrology Science and Technology(计量科学与技术), 2021, 65(5): 67. [本文引用:2]
[6]	DONG Qin, KONG Guang-zhong, QIN Fei, et al(董勤, 孔广忠, 秦斐, 等). Acta Acad. Med. Nei Mongol. (内蒙古医学院学报), 2002, 24(4): 236. [本文引用:1]
[7]	SUN Lei-ming, TANG Wei-yue, GUO Ke-min, et al(孙雷明, 唐伟跃, 郭克民, 等). Laser & Infrared(激光与红外), 2005, 35(8): 587. [本文引用:2]
[8]	TANG Wei-yue, LIU Wan-hua, SUN Lei-ming, et al(唐伟跃, 刘婉华, 孙雷明, 等). Laser Journal(激光杂志), 2007, 28(3): 91. [本文引用:1]
[9]	WANG Lei, WANG Qi, LIN Han-cheng, et al(王磊, 王琪, 林汉成, 等). Journal of Forensic Medicine(法医学杂志), 2018, 34(3): 223. [本文引用:1]
[10]	LI Gun, PANG Xiao-feng(李滚, 庞小峰). Laser Journal(激光杂志), 2013, 34(3): 43. [本文引用:1]
[11]	XUAN Miao-gen, FU Gao-wen, LIU Feng, et al(宣妙根, 付高文, 刘峰, 等). Journal of Forensic Medicine(法医学杂志), 2013, 29(1): 1. [本文引用:1]
[12]	YUAN Yi-zhong, CUI Jian-min, SHEN Wen(袁仪忠, 崔建民, 沈文). International Journal of Medical Radiology(国际医学放射学杂志), 2021, 44(2): 197. [本文引用:2]
[13]	HE Ya-feng, LI Hai-bin, SONG Bo-feng(贺亚峰, 李海滨, 宋博峰). Guizhou Medical Journal(贵州医药), 2021, 45(12): 1905. [本文引用:1]
[14]	Mortada I. Curr. Hypertens Rep. , 2017, 19(9): 69. [本文引用:1]

2022

0.0

... 引言高尿酸血症肾病(Hyperuricemia)是人体血尿酸升高后(高尿酸血症), 过高的尿酸负荷超过肾脏的清除能力, 因尿酸结晶沉积于集合管、肾盂和尿道, 产生肾内、甚至肾外梗阻所引起肾脏损害^[1] ...

... 5%羧甲基纤维素钠溶液配制的氧嗪酸钾溶液14 d, 诱导高尿酸血症肾病模型^[1,2] ...

2022

0.0

... 早期机体表现为尿浓缩功能减退, 其后逐步出现肾小球滤过率下降, 血肌酐升高, 导致慢性肾功能不全^[2] ...

... 5%羧甲基纤维素钠溶液配制的氧嗪酸钾溶液14 d, 诱导高尿酸血症肾病模型^[1,2] ...

2021

0.0

... 近年来, 随着高尿酸血症发病率的日益提高, 高尿酸肾病发病率也显著逐年增高^[3] ...

2021

0.0

... 傅里叶变换红外光谱仪(FTIR), 同色散型红外分光的原理, 是基于对干涉后的红外光进行傅里叶变换的原理而开发的红外光谱仪^[4] ...

2021

0.0

... 是鉴别物质和分析物质结构的有效手段, 可对样品进行定性和定量分析, 广泛应用于医药化工等领域^[5] ...

... 而在MC中这两处吸收峰的相对强度大小相等, 表明与健康肾组织比较, 高尿酸血症肾病肾组织中蛋白质分子的甲基反对称弯曲振动相对于对称弯曲振动基团数目增加^[5] ...

2002

0.0

... 董勤等^[6]对鼻咽癌患者以及胃癌患者的指甲进行了红外光谱研究 ...

2005

0.0

... 孙雷明等^[7,8]对肺癌组织进行了研究 ...

... 从NC小鼠正常组织到高尿酸血症病变组织, 969 cm^-1附近由于磷酸化蛋白振动的谱带吸收强度逐渐减弱^[7] ...

2007

0.0

... 孙雷明等^[7,8]对肺癌组织进行了研究 ...

2018

0.0

... 王磊等研究结果表明大鼠死后肾肝脾等组织FTIR光谱特征具有差异, 因此可以采用光谱推断死亡时间^[9,10] ...

2013

0.0

... 王磊等研究结果表明大鼠死后肾肝脾等组织FTIR光谱特征具有差异, 因此可以采用光谱推断死亡时间^[9,10] ...

2013

0.0

... 使用OMNIC软件分析处理所有光谱数据, 按组将数据归一化处理后, 通过统计谱图获得各组的肾组织红外光谱平均谱图, 对所得红外光谱均值中的各个谱带的峰位进行标定^[11], 并对其进行二阶导数转换以便做进一步分析模型组与正常组, 各施药组与模型组大鼠肾组织红外光谱特征的差异 ...

2021

0.0

... 3 结论目前高尿酸血症肾病的辅助诊断有影像学技术, 包括肌骨超声、高频超声等, 但超声主要有超声波穿透力弱、无法完整的显示解剖结构、受气体影响大、与操作者的经验、技术水平密切相关等局限性^[12] ...

... FTIR检测比尿酸、肌酐检测及病理分析经济、快速、简便、实用、准确率高, 并能分析药物对生物组织微观结构的影响及其发生机制^[12], 因此具有其他检测方法无可比拟的优势 ...

2021

0.0

... 近年来, 傅里叶变换红外光谱技术因其能快速、准确、直观地观察出患病组织的红外谱变化而广泛用于诊断乳腺癌、关节炎、白血病等多种疾病, 许多学者通过傅里叶变化红外光谱技术观察正常与患病组织的蛋白质、核酸、糖类、脂质等生物大分子的红外光谱变化, 进而鉴别和区分正常组织与患病组织, 找到疾病诊断的新途径^[13,14] ...

2017

0.0