引用本文
宋鸽, 孔祥仕. 丙酮盐酸混合液提取土壤腐殖质组分的光谱学特征[J]. 光谱学与光谱分析, 2024,44(2): 474-479.
SONG Ge, KONG Xiang-shi. Spectroscopic Characteristics of Soil Humus Components Extracted With Acetone Hydrochloric Acid Mixture[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2024,44(2): 474-479.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2024)02-0474-06  
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丙酮盐酸混合液提取土壤腐殖质组分的光谱学特征
宋鸽1,2, 孔祥仕3,*
1.黑龙江大学中俄学院, 黑龙江 哈尔滨 150080
2.Institute of Earth Sciences, St. Petersburg State University, St. Petersburg 199034, Russia
3.吉首大学旅游学院, 湖南 吉首 416000
*通讯作者 e-mail: kongxiangshi@126.com

作者简介: 宋 鸽, 女, 1986年生, 黑龙江大学中俄学院讲师 e-mail: 1093972779@qq.com

收稿日期: 2022-08-08 修回日期: 2022-12-07 接受日期: 2022-12-07
基金: 黑龙江省高校基本科研业务费黑龙江大学专项资金项目(2021-KYYWF-0025), 国家自然科学基金项目(32160356), 湖南省教育厅科学研究重点项目(21A0334)资助
摘要

采用丙酮盐酸混合液提取土壤胡敏酸(HA)和胡敏素(HU)组分, 利用元素分析、 紫外-可见漫反射光谱和红外光谱进行结构表征。 元素分析表明, HA中C、 H、 N和S含量均高于HU, O含量低于HU。 原子比分析表明HA的缩合度相对较高, 分子结构相对复杂, HU的缩合度相对较低, 分子结构相对简单。 紫外-可见漫反射光谱分析表明, 由于腐殖质(HS)的组成复杂, 多种官能团互相干扰, HA和HU紫外-可见漫反射光谱无明显特征峰, 吸光度值随着波长的增加呈下降趋势, 且HA包含的吸光有机成分较多, 化学组成较复杂。 HA和HU紫外特征参数SUV254和 E4 /E6比较分析表明, 与HU相比, HA芳香性较大, 腐殖化程度较高。 红外光谱分析表明, HA和HU具有相似的红外光谱, 各研究对象特征吸收峰的吸收强度不同, 其中开垦黑土20~40 cm和未开垦灰土18~37 cm土层HA的振动幅度较大, 说明其包含的酚类化合物、 含羟基化合物、 脂肪族化合物和羧酸, 以及含羰基的醛、 酮、 醚等化合物的含量较多。 开垦黑土10~20 cm土层和未开垦灰土18~37 cm土层HU在各特征吸收峰振动幅度较大, 说明其包含的酚类化合物、 羧酸、 脂肪烃和糖类化合物含量较多。 红外光谱各吸收峰强度比较分析表明, 开垦后黑土HA和HU酚类化合物、 羟基官能团和脂肪族化合物等含量增加, 而开垦后灰土HA和HU酚类化合物、 羧酸和脂肪族化合物含量下降, 表明开垦对黑土土壤有机质影响相对较小, 并且在一定程度上增加了土壤有机质含量, 而促进了灰土土壤有机质的分解。 综上所述, 丙酮盐酸混合液提取法为HS生物化学和生理活性的研究提供了新的技术手段, 为合理利用土壤资源提供理论依据。

关键词: 胡敏酸; 胡敏素; 元素分析; 紫外-可见漫反射光谱; 近红外光谱
中图分类号:S153.1 文献标志码:A
Spectroscopic Characteristics of Soil Humus Components Extracted With Acetone Hydrochloric Acid Mixture
SONG Ge1,2, KONG Xiang-shi3,*
1. Sino-Russia Institute, Heilongjiang University, Harbin 150080, China
2. Institute of Earth Sciences, St. Petersburg State University, St. Petersburg 199034, Russia
3. School of Tourism, Jishou University, Jishou 416000, China
*Corresponding author
Abstract

The components of soil humic acid (HA) and humin (HU) were extracted by acetone hydrochloric acid mixture, their elemental components were analyzed, and their spectroscopic characteristics were analyzed by UV-Vis diffuse reflectance and infrared spectroscopy. Elemental analysis showed that HA had higher carbon, hydrogen, nitrogen, and sulfur contents while having lower oxygen content than HU. Atomic ratio analysis showed that HA had a higher condensation degree and more complex molecular structure than HU. The UV-Vis diffuse reflectance spectrum analysis showed that HA and HU had no obvious characteristic peak because of the complex composition of humic substances and the mutual interference of various functional groups. The UV absorbance decreased with the increase of wavelength, and HA contained more light absorbing organic components. The UV characteristic parameters of SUV254 and E4 /E6 showed that HA had higher aromaticity and humification degree than HU. Infrared spectrum analysis shows that HA and HU have similar infrared spectra. However, the absorption intensity of characteristic absorption peaks of each research object is different. The vibration amplitude of HA in soil layer of 20~40 cm cultivated black soil and 18~37 cm uncultivated gray soil is larger, indicating that they had high contents of phenolic compounds, hydroxyl functional groups, aliphatic compounds, carboxyl groups, aldehydes, ketones, ethers, carbohydrate and amine compounds. The vibration amplitude of HU in soil layer of 10~20 cm cultivated black soil and 18~37 cm uncultivated gray soil is large, indicating that they contain more phenolic compounds, carboxylic acid, aliphatic hydrocarbons and sugars. In addition, intensity comparison of each absorption peak in the infrared spectrum showed that the content of phenolic compounds, hydroxyl functional groups and aliphatic compounds in HA and HU of black soil increased after cultivation. In contrast, the content of phenolic compounds, carboxyl groups and aliphatic compounds in HA and HU of gray soil decreased after cultivation. These results showed that cultivation has relatively little impact on black soil organic matter, and to a certain extent, increased soil organic matter content, but promoted the decomposition of gray soil organic matter. In conclusion, the acetone hydrochloric acid mixture extraction method provides new technical support for studying the biochemical and physiological activities of humic substances, which provide a theoretical basis for rational utilization of soil resources.

Keyword: Humic acid; Humin; Elemental analysis; Ultraviolet-visible diffuse reflectance spectroscopy; Infrared spectroscopy
引言

腐殖质(humic substances, HS)是动植物残余物经化学、 生物转化, 以及微生物代谢等形成的天然高分子化合物, 是地球表面主要有机碳库[1]。 在腐殖化过程中, 原本结构明确的四大类生物分子单体(蛋白质、 多糖、 脂质和木质素)经缩合, 转化为功能相似但结构各异的HS, 形成的HS并不是前体生物分子单体间的简单加和, 而是形成了具有独特结构属性的一系列高分子化合物或混合物[2]。 HS呈棕褐色、 无定形、 具有亲水性、 多分散性和酸性, 因此IHSS建议采用混合碱液(NaOH+Na4P2O7)提取法获取HS, 事实上此种方法提取费时、 提取率低。 土壤HS包括胡敏酸(HA)、 富里酸(FA)和胡敏素(HU)。 HA和FA统称为腐殖酸, 是HS中的活性部分[3], 其化学组成中羧基和羟基等含氧官能团的存在能够促进植物生长发育。 HU与无机矿物紧密结合, 在任何pH水溶液中都不溶解, 在维持土壤结构、 保持土壤养分和调节土壤营养元素循环等方面具有重要作用。

不同的提取方法获取HS组分在化学组成和分子结构上存在差异。 近年来, 众多学者通常采用IHSS(国际腐殖质协会)推荐的混合碱液提取法, 比较不同来源HS化学组成和分子结构差异, 研究HS化学组成和分子结构某些“ 重要结构原件” 与其生理活性的相关性。 由于传统的碱液提取法对土壤HS提取不够充分, 碱液能够水解土壤有机质并破坏其化学结构, 现今的研究技术和手段无法明确HS化学结构等, 因此已有的研究成果仅停留在理论假设阶段。 目前土壤HS研究更多的关注不同外界因素影响下HS组分含量的变化, 对于在不同土地利用方式下HS化学组成和结构特征变化规律的研究较少。 本文首次采用丙酮盐酸混合液, 从开垦和未开垦土壤样品中提取HA和HU, 利用元素分析、 紫外-可见漫反射光谱和近红外光谱等手段研究HS化学组成和分子结构特征, 比较开垦和未开垦不同类型土壤HA和HU化学组成和结构特征的变化, 力争为HS生物化学和生理活性的研究提供新的技术手段, 为合理利用土壤资源提供理论依据。

1 实验部分
1.1 土壤样品

土壤样品采自俄罗斯西南部贝尔戈罗德地区, 该地区的特点是温带大陆性气候, 夏季炎热干燥, 冬季寒冷。 年平均气温+6 ℃, 1月平均气温-8.1 ℃, 7月平均气温+19.9 ℃。 本研究所选土壤样品分别为未开垦黑土(10~20 cm, AU1; 20~40 cm, AU2)、 开垦黑土(10~20 cm, PU1; 20~40 cm, PU2)、 未开垦灰土(0~18 cm, AY; 18~37 cm, AEL)、 开垦灰土(0~15 cm, PY1; 15~30 cm, PY2)。 各样地采用五点取样法收集土样, 风干去除草根、 砂粒等, 研磨过2 mm筛备用。

1.2 HS组分提取及纯化

称取100 g过筛风干土样, 溶于1 L丙酮盐酸(90%丙酮∶ HCl=9∶ 1, m∶ m)混合溶液, 静置过夜, 3 000~4 000 r离心30 min, 过滤收集滤液, 滤液用去离子水稀释2倍, 静置过夜后, 3 000~4 000 r离心 30 min, 收集沉淀, 保留上清液。 沉淀用0.02 mol· L-1 NaOH溶液溶解, 过阳离子交换树脂进行纯化, 洗脱液冷冻干燥得到HA干物质。 将保留上清液用0.1 mol· L-1 NaOH溶液滴定至pH 7, 获得HU沉淀, 弃掉上清液, 沉淀多次用去离子水洗涤, 直至AgNO3溶液滴定上清液检测不到Cl-, 将沉淀冷冻干燥, 获取HU干物质备用。

1.3 元素分析

分别称取冷冻干燥HA和HU样品约2 mg于德国Elementar公司生产的Vario Microcube元素分析仪上测定C、 H、 N和S元素含量, 其中O元素含量采用差减法计算。

1.4 紫外-可见漫反射光谱

采用紫外-可见漫反射光谱仅对HA和HU固体粉末进行扫描, 波长范围200~800 nm。 在254 nm处测定吸光度, 记为SUVA254。 在465和665 nm处分别测定吸光度, 记为E4和E6, 并计算E4/E6值[4]。

1.5 近红外光谱分析

分别称取2 mg冷冻干燥HA和HU样品与100 mg KBr混合, 充分研磨后压片并放入红外干燥箱中干燥以除去样品中水分子的影响。 采用Vertex 70型傅里叶变换红外光谱仪(Bruker, 德国)进行红外光谱分析, 测定参数为: 分辨率4 cm-1; 测定范围: 4 000~400 cm-1。 对谱线选取特征峰, 并对相应的官能团进行半定量分析。

1.6 数据统计分析

紫外-可见漫反射光谱和近红外光谱数据采用OriginPro8.0软件绘图。

2 结果与讨论
2.1 HS元素分析

土壤HA和HU元素组成中C和O占比最大, 其次是H、 N和S。 土壤HA的C含量在41.29%~49.55%之间, H含量在4.31%~6.01%之间, O含量在42.94%~52.78%之间, N含量在1.22%~1.40%之间, S含量在0.23%~0.32%之间(表1)。 土壤HU的C含量在12.19%~20.73%之间, H含量在2.87%~3.58%之间, O含量在74.93%~84.51%之间, N含量在0.34%~0.66%之间, S含量在0.05%~0.1%之间(表2)。 两者元素组成相比, HA中C、 H、 N和S含量均高于HU, 只有O含量低于HU。 H/C和O/C原子比分别表征HS缩合度和氧化度。 H/C比值低, 表明缩合度高, 存在大量不饱和结构; 相反H/C比值高, 表明缩合度低, 即H元素含量的增加表明脂肪族碳(CH2)的数量多于芳香族碳(C=C)[5] O/C比值高, 表明氧化度高且碳水化合物、 羧酸(芳香族和脂肪族)等含氧官能团含量较高[6]。 C/N原子比值越低, 则HS腐殖化程度越高, 稳定性越高[7]。 (N+O)/C表示HS极性[3], 与芳香度、 氧化度和含氧官能团等相关。 本研究发现采用丙酮盐酸混合液提取HU的H/C、 O/C和(N+O)/C的原子比值均高于HA, 说明HU包含的脂肪烃类和羧酸类物质较多, 极性较大, 而HA的缩合度较高, 分子结构较复杂(表1和表2)。

表1 HA各种元素含量和原子比 Table 1 Elemental concentration and atom ratio of humic acid
表2 HU各种元素含量和原子比 Table 2 Elemental concentration and atom ratio of humin

比较开垦和未开垦土壤的不同土层中提取HA的元素组成, AY的C和H元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最大, O/C比值最小, 说明缩合度最小, 分子结构最简单, 氧化度最小, 羧酸等含氧官能团含量最少, 而C/N比值最大, 腐殖化程度最低, 稳定性最小, 而(N+O)/C比值最小, 极性最小。 PU2的C和N元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 说明羧酸等含氧官能团含量、 氧化度和极性最大(表1)。 对于开垦和未开垦土壤的不同土层中提取HU的元素组成, AY的C、 H、 N和S元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最小, 说明缩合度最大, 结构较为复杂, 而PY1的C、 H和S元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 说明氧化度、 羧酸等含氧官能团含量和极性最大(表2)。 比较开垦因素对黑土和灰土HA和HU各种元素含量和原子比的影响, 可知开垦因素对黑土HA和HU元素组成和原子比影响相对较小, 而开垦因素明显增加了灰土HA和HU中O元素和含氧官能团的含量、 氧化度和极性, 原因可能是黑土成土条件和过程相对复杂, 外界扰动因素对其影响相对较小, 而开垦因素促进灰土土壤有机质的分解, 复杂的有机大分子结构氧化分解转变为相对简单的小分子结构。

2.2 HS紫外-可见漫反射光谱

开垦和未开垦土壤的不同土层中HA和HU紫外-可见漫反射光谱形状相似, 吸光度值随着波长的增加呈下降趋势。 由于HS的组成复杂, 多种官能团互相干扰, HA和HU紫外-可见漫反射光谱无明显特征峰, 吸光度值大表明其包含的吸光基团较多。 PY2的HA吸光度值最大, AU1吸光度值最小, 表明PY2包含的吸光有机成分最多, AU1包含的吸光有机成分最少(图1)。 AY的HU吸光度值最大, 其余研究对象的吸光度相对较小, 说明AY包含的吸光有机成分最多(图2)。 各研究对象HA吸光度值大于HU吸光度值, 说明HA包含的吸光有机成分较多, 化学组成较为复杂。

图1 HA紫外-可见漫反射光谱Fig.1 Ultraviolet-visible diffuse reflectance spectra of humic acid

图2 HU紫外-可见漫反射光谱Fig.2 Ultraviolet-visible diffuse reflectance spectra of humin

紫外特征参数SUVA254常被用来表征HS的芳香性[8]。 比较HA和HU的SUVA254可知(表3和表4), HA芳香性大于HU, 即HA包含更多的芳香结构, 与元素分析中原子比C/H分析结果完全相符。 此外, E4/E6与HS的芳香度和芳香碳链的缩合程度有关, 可以作为腐殖化程度的指标[9]。 E4/E6值越大, 芳香族组分的缩合度越小, 分子结构越简单, 分子量越小[10], 腐殖化程度越低。 事实上E4/E6值与分子量相关性的研究还存在争议[11]。 比较HA和HU的E4/E6可知(表3和表4), HU芳香族组分的缩合度较小, 分子结构较为简单且腐殖化程度低, 这与元素分析的结果基本一致。 将开垦和未开垦土壤某一土层中HA和HU紫外特征参数与元素分析原子比计算结果进行对比分析, 二者结论不完全相符, 由于HS超分子结构和官能团组成的复杂性, 对于相同来源同一HS组分结构的全面表征还需要多种技术手段联用。

表3 HA紫外特征参数 Table 3 UV-Vis parameters of humic acid
表4 HU紫外特征参数 Table 4 UV-Vis parameters of humin
2.3 HS红外光谱

开垦和未开垦土壤不同土层中HA具有相似的红外光谱, 但是一些主要吸收峰的强度在不同的研究对象之间具有明显的差异, 表明HA的分子结构和官能团数量不同(图3)。 3 386 cm-1表示酚、 乙醇和有机酸中— OH伸缩振动, 说明形成了以H键相连的多聚体, 主要来自于碳水化合物、 蛋白质或氨基酸[12, 13, 14]。 2 917和2 849 cm-1是脂肪族成分的伸缩振动, 其中2 917 cm-1为C— H伸缩振动, 2 849 cm-1是— CH2伸缩振动[15], 主要来自细胞膜和细胞壁等组织成分。 1 714 cm-1表征羧基和羰基官能团的C=O伸缩振动[16], 1 598 cm-1表征— COO伸缩振动[17], 1 378 cm-1表征脂族C— H变形振动[2], 1 044 cm-1是糖或脂族C— O伸缩振动, 主要来自于植物和微生物残体中的碳水化合物[4]。 PU2和AEL在吸收峰3 386、 2 917、 2 849、 1 714、 1 598和1 378 cm-1处的振幅较大, 说明PU2和AEL所包含的酚类化合物、 含羟基化合物、 脂肪族化合物、 羧酸、 以及含羰基的醛、 酮和醚等化合物的含量较多(表5)。 HU的红外吸收峰中3 391 cm-1表征— OH伸缩振动、 1 583 cm-1表征— COOH伸缩振动、 1 396 cm-1表征脂族C— H变形振动、 1 046 cm-1峰为糖或脂族C— O伸缩振动(图4)。 各研究对象HU的红外光谱具有相似的特征, 但各主要吸收峰的吸收强度不同。 AEL和PU1在吸收峰3 391、 1 583、 1 396和1 046 cm-1处振幅较大, 说明AEL和PU1的HU中包含的酚类化合物、 羧酸、 脂肪族和糖类化合物含量较多(表5)。 开垦和未开垦土壤不同土层HA和HU的红外光谱各吸收峰强度的比较分析表明(表5和表6), 开垦因素对黑土和灰土的影响不同, 开垦后黑土HA和HU的酚类化合物、 含羟基化合物和脂肪族化合物等含量增加, 而开垦后灰土HA和HU的酚类化合物、 含羟基化合物和脂肪族化合物含量下降, 原因可能是黑土成土条件和过程相对复杂, 土壤有机碳分解缓慢不易流失, 而且外界开垦因素在一定程度上增加了土壤有机质含量, 而开垦因素促进灰土土壤有机质的分解, 这在一定程度上与元素分析的结果基本相符。

图3 HA红外光谱Fig.3 IR spectra of humic acid

表5 HA红外光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量) Table 5 The relative intensities of the main absorption peak of humicacid (semi-quantitative, cm-1)

图4 HU红外光谱Fig.4 IR spectra of humin

表6 HU红外光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量) Table 6 The relative intensities of the main absorption peak of humin (semi-quantitative, cm-1)
3 结论

HA是土壤有机质中的活性组分, 而HU是土壤有机质中的惰性组分, 与矿物质紧密结合具有碱不溶性和大分子结构的特性, 呈现不均一性。 本研究采用丙酮和盐酸混合液从土壤样品中分离提取HA和HU组分, 为HS生物化学和生理活性的研究提供了新的技术手段。 采用元素分析和光谱学等对HA和HU进行元素分析和光谱学特征研究, 结果表明, HA和HU具有相似的元素和官能团组成, HA和HU的元素组成以C和O元素为主, 原子比分析表明, HA的结构以芳香族结构为主, 而HU的结构以脂肪族结构为主。 HA和HU紫外-可见漫反射光谱形状相似, 无明显特征吸收峰, 吸光度随着波长的增加呈下降趋势。 与HU相比, HA包含的吸光有机成分较多, 化学组成较为复杂。 此外, HA和HU的紫外特征参数SUV254和E4/E6与元素分析中原子比分析结果基本相符, 而对于相同HS组分某一土层中HA和HU的分析不完全相符, 需要多种光谱学手段联用全面表征HS结构特征。 HA和HU具有相似的红外光谱图, 各主要特征吸收峰的吸收强度不同。 开垦黑土20~40 cm(PU2)和未开垦灰土18~37 cm(AEL)的HA在各特征吸收峰的振动幅度均最大, 表明两者所包含的酚类化合物、 含羟基化合物、 脂肪族化合物、 羧酸、 以及含羰基的醛、 酮和醚等化合物含量最多, 而未开垦灰土18~37 cm(AEL)和开垦黑土10~20 mm(PU1)的HU在各特征吸收峰振动幅度最大, 说明其包含的酚类化合物、 羧酸、 脂肪族和糖类化合物含量较多。

不同的土地利用方式下, 由于管理措施、 凋落物量和质量差异的影响, 可能导致土壤HS结构和性质等方面发生改变。 由红外光谱分析可知, 开垦对黑土和灰土的影响不同, 开垦后黑土HA和HU酚类化合物、 羟基官能团和脂肪族化合物等含量增加, 而开垦后灰土HA和HU酚类化合物、 羧基和脂肪族化合物含量下降, 原因可能是黑土成土条件和过程相对复杂, 外界扰动因素对土壤有机质影响相对较小, 外界开垦因素在一定程度上增加了土壤有机质含量, 而开垦因素促进灰土土壤有机质的分解, 这与元素分析的结果基本相符。

丙酮盐酸混合液提取法为HS生物化学和生理活性的研究提供了新的技术手段, 为合理利用土壤资源提供理论依据。

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