试验采用了三种常见的食源性致病菌, 分别为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni, C. jejuni)(ATCC 33291)、 大肠埃希氏菌O157:H7 (Escherichia coli, E. coli)(ATCC 700728)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium, S. Typhimurium)(ATCC 14028)。 在试验前, 纯种菌株存放在-80 ℃的细菌库中。 根据每次试验需要, 将菌株从冰箱中取出并选择各自的生长培养基进行接种。 孵育时间、 温度和培养基的选择参考Difco & BBL微生物培养手册^[9]。 试验步骤主要参照Park等的研究^[10], 使用接种环从琼脂板上挑出各致病菌菌落, 并接种到100 μ L纯水中摇匀, 然后吸出3 μ L细菌悬浮液置于载玻片的中央, 并利用生物安全柜进行15分钟通风干燥制样。 随后, 在细菌载玻片中央滴入约0.8 μ L无菌水, 并用无色透明的玻璃盖玻片压住, 挤出多余气泡并在盖玻片顶部滴入少许香柏油, 便于显微高光谱成像系统进行观察和图像采集。

实验用显微高光谱成像系统如图1所示, 主要由Eclipse e80i直立显微镜(日本尼康), AOTF光谱仪(英国克罗姆, 光谱范围450~800 nm, 间隔4 nm), 高性能的16位EMCCD相机(北爱尔兰安道尔科技)以及卤钨灯(21 V, 150 W, 德国欧司朗)组成。 显微镜主体主要用于观察致病菌细胞, 光路传输方式参照暗场相差显微镜光路配置, 因此采集获得的细胞背景图像为暗。 AOTF光谱仪基于声光衍射原理, 能够通过调节不同频率的声波促使声光晶体材质进行特定波长滤波, 为后续CCD相机的图像采集准备。 EMCCD相机的采集参数调至最佳, 曝光时间设定为250 ms, 增益为15%。 通过移动载物台调整显微镜视场捕捉不同位置细胞的图像, 最终每类致病菌采集获得50张高光谱超立方体数据, 共计150(3× 50)张, 部分致病菌数据可在相关平台公开获得^[8]。

图1

Fig.1

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	图1 AOTF显微高光谱成像采集系统Fig.1 AOTF hyper-spectral microscopy imaging system

数据预处理主要包括光谱数据和形态特征数据处理两部分。 由于每张高光谱图像中的细胞分布个数存在差异, 最终实验收集并挑选出各类致病菌细胞共计3 000个, 其中空肠弯曲杆菌、 大肠埃希氏菌O157:H7、 鼠伤寒沙门氏菌样本光谱各1 000个, 整理形成数据集。 光谱数据预处理采用多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)算法消除光谱基线漂移等散射效应, 使同类细菌的光谱更具特异性。 其中, MSC算法实施步骤为先计算光谱矩阵A的均值光谱 A-, 如式(1)所示。 然后, 以均值光谱为基准计算每个样本光谱的乘性噪声m_i和加性噪声b_i, 计算方式以一元线性回归方式进行, 如式(2)所示。 最后, 对于各个样本的校正光谱利用获得的乘性噪声m_i和加性噪声b_i参数进行逆运算, 计算方式参照式(3)所示。 以上数据处理步骤采用Python(版本3.8.5, 美国)编程实现。

A-=∑i=1nAn(1)

Ai=miA-+bi(2)

Ai(MSC)=Ai-bimi(3)

细胞形态数据集则从在546 nm波段从高光谱数据中抽取细胞图像(此波段细胞成像最清晰), 并按照光谱数据集的编号顺序进行保存, 保证同一个细胞的光谱与图像数据编号一致。 细胞图像的形态特征采用自行编写的Python程序提取, 主要使用scikit-learn工具包提取细胞的面积、 周长、 长轴长、 短轴长等形态信息, 详细特征参数如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 细胞形态特征汇总 Table 1 Morphological features of the bacteria cell 名称缩写 形态特征 详细描述 Area 细胞区域的面积 细胞区域内所有像素个数 Perimeter 周长值 细胞外轮廓边界长度 Max Len 长轴距离 通过细胞圆心的最长距离 Min Len 短轴距离 通过圆心的细胞短轴距离 Diameter 拟合直径 通过拟合近似圆的直径 Eccentricity 偏心率 细胞焦距与长轴的比值 Orientation 偏置角度 细胞长轴与水平线的夹角 Extent 拟合边框面积 细胞拟合矩形中的像素个数

表1 细胞形态特征汇总 Table 1 Morphological features of the bacteria cell

对于形态数据集, 将首先使用标准归一化(Standard normal variate, SNV)的方式对形态数据以行为中心进行运算, 从而实现每行形态特征的中心化缩放, 矩阵运算方法如式(4)所示。

x^k=xk-XmeanXstd(4)

式(4)中, x^k表示形态矩阵中的第k个样本, X_mean表示特征矩阵的平均值, X_std则表示矩阵的标准方差。 形态数据经过归一化校正后, 将与光谱数据堆叠融合形成图谱数据集, 然后分别送入各分类模型进行训练和分类预测。

光谱数据集和图谱数据集分别按照7∶ 2∶ 1的比例划分为训练集(700× 3)、 验证集(200× 3)和测试集(100× 3)。 模型评价指标采用准确率(Acc)、 精确率(Pre)、 F1值和Kappa系数(K), 它们的计算分别如式(5)— 式(8)所示。

Acc=TP+TNTP+TN+FP+FN(5)

Pre=TPTP+FP(6)

F1=2PRP+R=2TP2TP+FP+FN(7)

K=Acc-Pe1-Pe(8)

其中, 准确率、 精确率和F1公式中的TP、 TN、 FP和FN分别表示真阳性、 真阴性、 假阳性和假阴性样本数, K值则用于模型的一致性评估, P_e表示偶然一致性, 可以通过对混淆矩阵进行运算获得。 实验中所有评价指标的公式运算均通过Python编程实现。 对各模型在图像、 光谱和图谱数据集的分类表现进行分析, 并探索利用图谱模型进行致病菌分类的可行性。

智能算法采用双向长短式记忆网络(Bi-directional long short-term memory, Bi-LSTM), 其主要通过正反向传播的LSTM网络组合一起实现, 对于一维光谱数据分析具有优势。 Bi-LSTM中的内部节点与LSTM网络相同, 包括输入门、 遗忘门和输出门, 主要结构如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 LSTM单元构成详解Fig.2 The structure of LSTM cell

在每个单元的顶部, 新单元的状态C_t由f_t(遗忘门), C_t-1(旧单元状态), i_t(输入门)和 C^t(新单元候选值的向量)进行控制, 运算方式参照公式4。 对于遗忘门(f_t), 输入门(i_t)和输出门(o_t), 使用一个Sigmoid层(σ )进行了整合运算, 运算方式分别如式(9)— 式(12)所示。

Ct=ft×Ct-1+it×C^t(9)

ft=σ(Wf×[ht-1, xt]+bf)(10)

it=σ(Wi×[ht-1, xt]+bi)(11)

ot=σ(Wo×[ht-1, xt]+bo)(12)

其中, x_t表示输入数据, h_t-1表示旧隐含节点的数值, W表示权重, b表示偏差。 在输入门的处理过程中, 网络通过使用tanh层来不断更新 C^t的状态, 计算方式如式(13)所示。 最后, 单个隐含单元的输出值由o_t和C_t共同决定, 运算方式参照式(14)。

C^t=tanh(Wc×[ht-1, xt]+bc)(13)

ht=ot×tanh(Ct)(14)

通过利用这种特定的单元结构, LSTM网络能够对任意光谱间隔内的数据流进行解析。 Bi-LSTM则在传统的LSTM前向传播的基础上添加反向层, 通过对前向层和后向层的隐藏向量进行堆叠实现输出, 具体堆叠方式如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 Bi-LSTM内部结构图Fig.3 The internal structure of Bi-LSTM net

其中, 前向层隐藏向量 htR的计算方式如式(15)所示, 主要计算得到从t-1时刻到t时刻的网络输出。 后向层 htL的计算与前者反向, 如式(16)所示, 主要获得t时刻到t+1时刻的输出结果。 最终, 网络的输出h_t则由 htR和 htL进行加权计算[式(17)]获得, !从而能实现光谱数据的双向分析。

htR=fRw1xt+w2ht-1R(15)

htL=fL(w3xt+w5ht+1L)(16)

ht=f(w4htR+w6htL)(17)

在建模分析环节, 采用光谱分析领域中经典的线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)和主成分分析结合支持向量机算法(principal components analysis and support vector machine, PCA-SVM)与Bi-LSTM网络进行分类比较。 其中, LDA是一种经典的线性分类器, 可以通过矩阵特征分解的方式实现光谱数据的线性降维识别。 PCA方法是目前常用的无监督光谱降维方法, 其与支持向量机的组合使用方式在光谱数据分类领域应用广泛。 各分类器将对1.3小节中划分的光谱数据集和光谱图像数据集进行各自建模, 各分类器内部的超参数将进行分别调优, 最终将分类结果汇总对比分析。

致病菌的光谱数据提取过程和结果如图4所示。 首先, 从致病菌高光谱数据[图4(a)所示]中提取较为清晰的单波段图像, 采用灰度化、 降噪滤波、 阈值分割等图像处理手段生成对应的掩膜文件[图4(b)所示]。 然后, 将原始高光谱数据中的每个波段的细胞原图像和掩膜进行异或操作, 利用阈值分割的方式提取感兴趣区域(regions of interest, ROI)。 接着, 将单波段的细胞图像按照波段序列重新叠加组合, 重新形成新的细胞ROI的超立方体数据[图4(c)所示]。 最后, 计算ROI区域内的所有光谱形成均值光谱, 并进行MSC算法校正。 图4(d)显示了不同致病菌在450~800 nm波段下的光谱曲线图, 各类致病菌的光谱峰形相似, 且都在522、 546、 574、 590和670 nm的波段取得峰值, 但是在光谱强度上表现出差异。 其中, 空肠弯曲杆菌的光谱强度最低, 大肠埃希氏菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌存在部分光谱重叠区域。 这些强度规律的形成与光子在细胞中透射、 散射和折射的相互作用有关。 首先, 入射光先通过细胞的胶囊、 细胞壁和细胞内膜进入内部, 与细胞液、 染色体DNA和核糖体相互作用, 产生光能的二次衰减。 由于各种致病菌细胞个体的差异, 导致细胞内部这些物质的含量不同, 因此光能衰减存在差异, 从而形成独特的“ 光谱指纹” ^[11]。

图4

Fig.4

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	图4 (a) 致病菌高光谱数据; (b) 细胞图像对应的掩膜图像; (c) 提取获得的单个细胞高光谱图像; (d) MSC算法校正后的三种细菌平均光谱图Fig.4 (a) Hypercube of foodborne bacteria; (b) The mask of each image; (c) Single-cell hypercube; (d) MSC corrected spectra

基于1.4所描述的模型判别方案, 建立LDA, PCA-SVM和Bi-LSTM模型。 其中, LDA使用自动调超参的方式进行优化; 在PCA-SVM分类器中, PCA选用前8个主成分, 光谱数据集的总解释变量为97.9%, 图谱数据集为94.9%。 SVM采用高斯核函数, 在两种数据集中参数C均为20, gamma参数均为0.15。 Bi-LSTM网络中内部输出维度参数units为200, dropout为0.2, 采用双向封装器对光谱数据进行前后双向运算。

在光谱数据集中, LDA、 PCA-SVM和Bi-LSTM分类器在测试集分别取得了80.1%、 88.5%和91.0%的准确率, 精确率分别为0.81、 0.89和0.91, F1值分别为0.80、 0.88和0.91, K值分别为0.7、 0.82和0.86, 详细结果如表2所示。 其中, 非线性模型PCA-SVM和Bi-LSTM性比线性LDA模型准确率更高。 各模型的精确率和F1值区别不大, 表明各模型的超参数均被调优, 评估性能稳定。 但是, 在一致性检测环节, LDA仅取得0.70的K值得分, PCA-SVM和Bi-LSTM则分别为0.82和0.86, 表明非线性模型在光谱分类任务中更加可靠。 综上, 光谱数据集的分类结果表明, 经典的PCA-SVM和神经网络算法Bi-LSTM相较于传统方法LDA, 准确率和稳定性更强。 在光谱和形态数据集中, 各分类器的分类结果均取得提升, 测试集分别取得了95.3%、 95.3%和98.1%的准确率, 精确率分别为0.96、 0.95和0.98, F1值分别为0.95、 0.95和0.98, K值分别为0.92、 0.92和0.97。 其中, LDA分类器准确率提升较大, 从80.1%提升至95.3%, 达到了与PCA-SVM同样的分类准确率。 光谱形态数据集的分类结果表明, 形态数据的加入能够显著提升各分类模型的性能, LDA提升了15.2%, PCA-SVM模型提升了6.8%, Bi-LSTM网络提升了7.1%。 Bi-LSTM分类器在图谱数据集中表现最为优异, 测试集取得了98.1%的准确率, 0.98的精确率、 0.98的F1-Score和0.97的K值。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同模型的分类结果 Table 2 Classification results from different models 数据类型 分类模型 Acc/% Precision F1-Score K 训练集 校正集 测试集 LDA 85.3 83.3 80.1 0.81 0.80 0.70 光谱 PCA-SVM 90.1 89.0 88.5 0.89 0.88 0.82 Bi-LSTM 93.5 92.8 91.0 0.91 0.91 0.86 LDA 97.5 95.1 95.3 0.96 0.95 0.92 光谱+形态 PCA-SVM 100.0 95.8 95.3 0.95 0.95 0.92 Bi-LSTM 99.2 99.0 98.1 0.98 0.98 0.97

表2 不同模型的分类结果 Table 2 Classification results from different models

如图5所示, 通过混淆矩阵可视化手段能够直观展现各分类器在三种致病菌分类任务中详细表现。 图5(a)展示了三种分类器在光谱数据集上的致病菌分类情况, 各分类器的分均能较好的区分空肠弯曲杆菌, 但是在大肠埃希氏菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的分类中表现较差。 已有的文献表明, 空肠弯曲杆菌体态为弧形, 与大肠埃希氏菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌存在明显差异^[12], 显微高光谱成像则能够捕捉这些由各致病菌细胞物理结构和化学成分不同而产生的光子能量差异。 各分类器的性能也会影响最终判别结果, 如图5(a)所示, 有60个大肠埃希氏菌O157:H7样本被误判为鼠伤寒沙门氏菌, 而有51个鼠伤寒沙门氏菌样本被误判为大肠埃希氏菌O157:H7。 虽然使用性能更佳的PCA-SVM(误判的大肠埃希氏菌O157:H7个数为30, 鼠伤寒沙门氏菌个数为16)和Bi-LSTM(误判的大肠埃希氏菌O157:H7 29个数为, 鼠伤寒沙门氏菌个数为17)分类器能够改善假阳性问题, 但依然无法显著提升各类致病菌的分类效果。 综上, 基于光谱数据集的结果表明, 仅使用光谱特征进行分类易产生误判, 这是由于大肠埃希氏菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌均拥有相似的细胞壁、 细胞膜、 细胞质和细胞核等结构。 因此, 形态特征的加入或许能够为分类效果的改善提供帮助。 空肠弯曲杆菌为空间螺旋形, 细长且呈S形弯曲; 大肠埃希氏菌O157:H7与鼠伤寒沙门氏菌虽然菌体两端均呈钝圆形, 但在杆体长短等形态特征上存在差异。 基于图像和光谱的分类结果如图5(b)所示, 在LDA分类器中, 仅有25个大肠埃希氏菌O157:H7样本被误判为鼠伤寒沙门氏菌; PCA-SVM分类器中, 这两类致病菌的误判样本数分别为15和11; Bi-LSTM网络则能更进一步的解决假阳性问题, 仅有2个鼠伤寒沙门氏菌的样本被误判。 混淆矩阵可视化的结果表明, 大肠埃希氏菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的假阳性误判问题是制约各分类器准确率的重要原因, 使用图像和光谱特征结合先进的Bi-LSTM神经网络分类器则能够显著提高致病菌的分类精度。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 (a) 基于光谱数据集的各分类器的混淆矩阵; (b)基于图像和光谱融合数据集的各分类器的混淆矩阵Fig.5 (a) Confusion matrices of all classifiers based on spectra dataset; (b) Confusion matrices of all classifiers based on spectra and morphology dataset