黄瓜品种为黑优868, 产地山东聊城, 总质量400 kg, 2021年10月10日采购于当地超市, 并于当天转移到贮藏室。 由于低温贮藏仅延长贮藏时间, 并不影响贮藏品质变化规律的研究结果, 故为了减少试验时间, 选择在常温下贮藏黄瓜。 贮藏温度19.0~20.9 ℃, 湿度64%~65%RH。 在8 d的贮藏期间, 每天采集贮藏室气氛样本并测量黄瓜的叶绿素含量、 硬度和失重率。

采集贮藏室气氛样本: 广东环凯微生物科技有限公司生产的HKM-Ⅱ 型空气浮游微生物采样器。

离心浓缩气氛样本溶液: 上海卢湘仪离心仪器有限公司生产的TG16A台式高速离心机。

均匀混合离心后的样本溶液: 采用海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产的XW-80A型漩涡混合器。

测量贮藏室气氛3D荧光信息: 实验室自制的紫外增强型三维荧光光谱仪, 其光源为150 W紫外增强型连续氙灯, 激发、 发射带宽均为5 nm, 波长精准度± 1 nm, 信噪比大于800:1, 积分时间为0.1~24 s。

测定黄瓜叶绿素: 上海仪电分析仪器有限公司制造的722N可见分光光度计。

测定黄瓜硬度: 英国Stable Micro Systems公司生产的SMS TA.XT Express型质构仪。

测定黄瓜质量: 常熟市佳衡天平仪器有限公司生产的DT-500B型电子天平。

1.3.1 气氛样本3D荧光信息采集

(1)贮藏室气氛样本制备

采用空气浮游微生物采样器采集1 000 L贮藏室气氛, 并将气氛用生理盐水制成溶液, 再将其离心浓缩得到2 mL样本溶液, 详见文献[9, 11]。

(2)3D荧光信息测量

用自制的3D荧光光谱仪进行三维荧光检测。 参数设置为: 激发波长为200~450 nm, 步长为5 nm; 发射波长为260~800 nm, 步长为0.4 nm; 积分时间为1 s。 实验过程中所使用的生理盐水、 玻璃培养皿、 移液枪枪头和离心管均经121 ℃, 20 min灭菌, 空气浮游微生物采样器用浸湿75%乙醇的脱脂棉花擦拭消毒。

1.3.2 黄瓜样本理化数据采集

(1)叶绿素含量测定

样品叶绿素提取采用95%乙醇研磨-过滤法, 用削皮刀削下黄瓜头部外皮, 称取5.0 g置于研钵中, 加入10 mL95%乙醇研磨成浆, 匀浆过滤到25 mL棕色容量瓶中。 分别测定665、 649 nm处的吸光度并计算叶绿素含量。 具体测量要求按NY/T 3082— 2017《水果、 蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定 分光光度计法》执行。

(2)硬度测定

样品硬度采用质构仪在距黄瓜顶部2 cm处穿刺测量, 每天随机选取3个样本, 平行测量三次。 具体测量要求按NY/T 2009— 2011《水果硬度的测定》执行。

(3)失重率测定

实验开始前一天, 在贮藏室随机选取6根黄瓜并编号, 用电子天平测量其质量, 记为m₀。 每个贮藏日黄瓜质量记为m, 根据式(1)计算失重率X, 6根黄瓜的失重率取平均值。

X=m0-mm0×100%(1)

1.4.1 气氛样本荧光数据预处理

在提取样本3D荧光数据特征信息之前, 要对原始数据进行预处理。 采用eemscat函数消除瑞利散射的影响^[9], 采用SG多项式平滑法消除噪声信号的影响。

1.4.2 特征激发波长提取方法

采用Wilks Λ 统计量结合主成分分析(principal component analysis, PCA)的方法选择特征激发波长。 Wilks Λ 统计量可用于验证多个样本中每个变量的辨别能力, 可以根据Λ 值来选择具有最高判别能力的特征向量。 由于Wilks Λ 统计量要求所输入的变量是相互无关的, 因此预先处理的荧光数据不能直接用于Λ 值的计算, 需要对数据进行转换, 以消除波长变量之间的相关性。 作为一种数据融合方法, PCA具有一个重要性质: 每个主成分变量是相互正交的, 因此运用PCA得到的主成分变量代替原始荧光数据来构造Wilks Λ 统计量^[9]。

贮藏过程中黄瓜的品质每天都会发生微小的变化, 因此把每天设为1个级别, 8天即为8个级别。 每天的光谱数据为651× 41的矩阵(41是激发波长的个数, 651是发射波长的个数, 每一列数据是相应激发波长下不同发射波长对应的荧光强度, 不同的发射波长可看成这一级别下的不同样本), 把8 d的试验数据组合到一起得到一个5 208× 41的分析矩阵。 对该矩阵进行PCA分析得到主成分矩阵, 然后运用各主成分变量构造Wilks Λ 统计量, 当Λ 统计量较小时, 表示不同级别样本的差异性越显著, 选择的特征向量越容易识别不同级别的样本。 Λ 统计量的计算如式(2)所示

Λ=|D||T|(2)

式(2)中, D为类内离差的平方和矩阵, 即主成分矩阵中一列数据(一列代表一个主成分变量)的组内离差, T为每一列数据的总离差。

Λ 值越小, 选出的主成分变量的鉴别能力越强。 再根据选取的主成分变量选择原始数据特征激发波长变量。 各主成分变量均为原始变量的线性组合, 因此在确定了主成分之后, 可以根据主成分构造时的各组合系数来选择特征激发波长。 系数绝对值越大, 说明该原始变量对主成分的贡献度越大, 该变量也越能够体现不同样本间差异性, 即越能反映不同贮藏日黄瓜品质的变化。

1.4.3 特征发射波长提取

特征发射波长的提取可按如下步骤实施:

(1)对由特征激发波长构造的荧光光谱矩阵按发射波长从小到大进行波段划分, 然后对每个波段中的光谱信息按特征激发波长由小到大进行首尾连接, 构造出对应每个波段的一维光谱数据, 最后分别对每个波段的一维光谱数据进行小波包分解(wavelet packet decomposition, WPD)。

(2)计算每个波段中的小波包能量, 选取能量最大的波段中的发射波长作为初选的特征发射波长。

(3)运用偏最小二乘回归结合理化指标对初选的特征发射波长进行特征发射波长精选。

小波包分解可以在几乎不损失信息的情况下对信号进行分解和重构, 并且对于含有大量中、 高频信息的信号提供了更好的时频分析能力^[12]。 以三层分解为例, 小波包分解的树示意图如图1所示, 低频部分为A0, 高频部分为A1, 第三层小波包分解共有8个节点, 每个节点都对应一个频段和一组小波包分解系数, 小波包分解系数表示原信号与从处理后信号中捕获的信息之间的相似性。

图1

Fig.1

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	图1 三层小波包分解的树示意图Fig.1 Tree diagram of three-level wavelet packet decomposition

小波包节点的能量是该节点相应频带小波包分解系数的平方和, 以小波包分解第3层为例, 节点能量计算可用式(3)表示

E3j=∑k=1n|C3j, k|2 j=0, 2, …, 7(3)

式(3)中, E_3j是信号小波包分解第3层的第j个小波包节点(第j个频带)的能量, C_{3j, k}是信号小波包分解第3层第j个频带中第k个小波包系数, n是小波包分解第3层的每个频带中小波包系数的数量。

小波包分解的低频部分保留了更多的原始信号, 是有效信息, 而高频部分是噪声, 因此选择第3层中最低频段部分作为提取特征发射波段的工具。 在小波包分解过程中, 最低频段能量越大的波段, 小波包系数绝对值也相应越大, 说明小波包基函数与原信号的逼近程度越高, 特征提取的效果越好^[13], 因此选择小波包分解后最低频段中能量值最大的波段作为初选发射波段, 此波段中的发射波长初选为特征发射波长。 这不仅大大简化了计算, 而且很大程度的保留了原始光谱数据所包含的信息。

为了进一步简化数据, 更精确地提取特征发射波长, 采用偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLS)^[4]结合黄瓜硬度、 失重率和叶绿素含量对小波包分解初选的特征发射波长进行回归分析。 回归系数绝对值越大, 对应的波长越能表征黄瓜贮藏过程中的品质变化, 因此可根据回归系数选择合适且能表征黄瓜品质变化的特征波长。

1.4.4 黄瓜品质监测基准确定方法

由于无法准确判断第一个贮藏日黄瓜的成熟度、 新鲜度, 因此拟选择黄瓜品质迅速转变, 即腐败的当天作为监测基准日。 贮藏过程中黄瓜品质不断发生变化, 水分不断丧失, 果实硬度下降, 表皮颜色逐渐由墨绿转黄绿。 由于果蔬品质变化速率不恒定, 一般贮藏前期品质下降速率快, 后期变缓, 而中间转折处正是果蔬品质迅速转变的节点, 因此可以通过对黄瓜理化指标变化趋势的分析再结合试验过程中感官分析共同确定黄瓜品质监测基准日。 考虑到每天试验时间长短对黄瓜水分蒸发速度影响较大, 可能会影响其对品质转折点的判断, 因此选择黄瓜硬度和表皮叶绿素含量的变化趋势作为监测基准日的选择依据。

1.4.5 黄瓜品质变化监测方法

马氏距离是一种有效计算两个样本相似性的方法, 独立于量纲和变量之间的相关性。 选择一个监测基准, 根据式(4)计算不同贮藏日的特征光谱矩阵与监测基准之间的距离。

DM(x)=(x-y)TΣ-1(x-y)(4)

式(4)中, x为不同贮藏日的特征光谱矩阵中元素依次展开排成一行得到的向量, y为监测基准日特征光谱矩阵按同样方法得到的表征向量, ∑为监测基准日特征光谱表征向量的协方差。

根据D_M(x)值的大小, 可以判断不同贮藏日的光谱信息偏离基准的程度, 也是不同贮藏日黄瓜的品质偏离监测基准日的程度。 马氏距离值越大, 说明黄瓜品质越接近监测基准日, 反之, 说明黄瓜品质越远离监测基准日, 以此实现对贮藏室黄瓜品质的监测。

为了消除散射和噪声信号的影响, 对三维荧光数据进行去瑞利散射和SG多项式平滑法处理。 以第一个贮藏日采集的贮藏室气氛数据为例, 得到如图2所示的荧光光谱等高线图。 对比图2(a)和图2(b), 可以看出, 经去瑞利和SG平滑处理后, 瑞利散射峰已经被去除, 样本的实际光谱曲线在等高线图中显现出来, 且光谱曲线平滑。 同时, 从每天观察试验得到的三维荧光光谱等高线图发现, 发射波长520~800 nm间荧光强度几乎为零, 分析价值不大, 甚至还会带来较大的试验误差, 因此去除发射波长520~800 nm间的数据, 260~520 nm之间共计651个发射波长。 从全部8天试验的等高线图可知, 荧光峰主要都集中在激发波长250~450 nm之间, 且位置基本固定, 而激发波长200~250 nm之间的荧光峰时而显现时而消失, 为了避免对后面特征信息提取的干扰, 去除激发波长200~250 nm间的数据, 250~450 nm之间共计41个激发波长。 三维荧光光谱预处理均在MATLAB2014b软件平台上完成。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 散射去除及平滑处理前后等高线荧光光谱对比图 (a): 处理前; (b): 处理后Fig.2 Contour fluorescence spectra before and after of scatter removal and SG smoothing (a): Before processing; (b): After processing

首先对预处理后荧光数据进行PCA处理, 对主成分变量采用Wilks Λ 统计量的方法进行变量选取。 通过计算, 最小Λ 值对应的主成分变量为第11主成分。 图3为第11主成分的权重系数变化图, 根据1.4.2的原理和方法共选取8个特征激发波长: 255、 260、 360、 380、 390、 410、 415和445 nm。

图3

Fig.3

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	图3 第11主成分的权重系数图Fig.3 Weight coefficient diagram of the eleventh principal component

特征激发波长提取后, 按照1.4.3的方法对得到的光谱矩阵进行3层sym4小波包分解。 采用sym4小波是因为其波形比较接近试验的原始荧光信号^[10]。 小波包分解提取特征波段作为特征激发波长的初选, 波段不宜过大也不宜过小, 考虑到常见荧光仪波长步长设置一般选为2、 5、 10和12 nm, 故将每个波段长度设置为10 nm。 图4为不同波段分解出的最低频段的能量值变化曲线。 根据计算出的能量值提取特征发射波段为11~14, 即初选的发射波长范围为370~399.6 nm。

图4

Fig.4

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	图4 不同波段分解出的最低频段的能量值变化曲线Fig.4 The energy value change curve of the lowest frequency band decomposed by different bands

图5为在此发射波长范围内运用PLS提取特征波长的权重系数变化图。 根据1.4.3中的原理提取了7个特征发射波长: 375.6、 378、 382、 386、 391.2、 394.8和398 nm。

图5

Fig.5

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	图5 基于PLS的特征波长提取结果Fig.5 Extraction results of characteristic wavelength based on PLS

2.4.1 监测基准选择

图6为黄瓜贮藏过程中硬度变化曲线, 分析图6可知, 贮藏前5天, 黄瓜硬度下降迅速, 而第5天之后黄瓜软化速度变慢, 说明黄瓜已经不再新鲜, 逐渐丧失商品价值, 第5天就是黄瓜质量转变的节点。 通过图6中黄瓜硬度变化曲线发现, 贮藏第5天之后硬度变化呈波动趋势, 但整体是慢下降, 贮藏第7天黄瓜硬度值高于前两天, 这可能是由于每次测试的随机取样和黄瓜软化速度变慢造成的。

图6

Fig.6

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	图6 黄瓜贮藏过程中硬度变化曲线Fig.6 Hardness curve of cucumber during storage

对黄瓜叶绿素含量进行5阶多项式拟合, 结果如图7所示, 拟合度R²为0.997 7, 说明拟合效果极佳。 从图7可以看出, 贮藏前两天, 叶绿素含量下降, 第3到第4天略微上升, 第5天又迅速降低, 第6到第8天微微上升, 总体呈下降趋势。 图8为叶绿素多项式拟合曲线的一阶导数, 贮藏1~8天之中共有3个拐点, 第1个拐点大约在第3个贮藏日, 对应一阶导数值为正值; 第2个拐点在第5个贮藏日, 对应一阶导数值为负值; 第3个拐点在第7个贮藏日对应一阶导数值为正值。 一阶导数为正表示原函数呈上升趋势, 一阶导数为负则相反。 拐点是曲线凹弧与凸弧的分界点, 也就是原函数曲线方向向上和向下趋势改变的点。 结合图7, 第5个贮藏日黄瓜的叶绿素含量迅速下降, 说明黄瓜品质在第5个贮藏日迅速变劣。

图7

Fig.7

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	图7 黄瓜叶绿素含量的多形式拟合曲线Fig.7 Multi-form fitting curve of chlorophyll content in cucumber

图8

Fig.8

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	图8 黄瓜叶绿素含量多项式拟合曲线的一阶导数Fig.8 First derivative of cucumber chlorophyll content polynomial fitting curve

结合贮藏过程中感官情况: 前4个贮藏日, 黄瓜颜色墨绿, 光泽度高, 手触摸硬度高, 光滑度低, 瓜刺多, 顶花带刺, 个别黄瓜出现腐败, 贮藏室有黄瓜香味, 几乎无腐败气味; 从第5个贮藏日开始, 黄瓜颜色逐渐由绿转黄, 光泽暗淡, 果实变软, 光滑度高, 瓜刺部分脱落, 顶花萎蔫, 贮藏室黄瓜部分腐败, 贮藏室腐败气味明显。 综上所述, 选择第5个贮藏日为贮藏监测基准日。

2.4.2 品质监测模型

构建黄瓜品质监测模型时考虑了两种情况, 第一种情况是通过小波包分解初选的特征发射波段为切入点, 第二种情况是以精选后的特征发射波长为切入点, 分别得到相应的特征光谱信息, 并用1.4.5的方法构建了不同贮藏日到监测基准日之间马氏距离值变化趋势模型, 如图9(a, b)所示。 通过对比发现, 随着贮藏时间的延长, 二者的马氏距离值都是越来越小直到零, 表明黄瓜品质逐渐下降直至腐败。 同时, 随着贮藏天数的增加, 二者马氏距离下降趋势差别不大。 说明上述两种情况提取得到的特征光谱信息构建的马氏距离模型均可实现对黄瓜品质的监测。 但后者大大减少了特征发射波长的个数, 既简化了计算, 又保证了较好的黄瓜品质监测效果。 因此在小波包能量初选的发射波段内采用PLS进行发射波长的精选十分必要。

图9

Fig.9

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	图9 不同贮藏时间气氛样本的马氏距离折线图 (a): 第一种情况; (b): 第二种情况Fig.9 Mahalanobis distance broken line diagram of atmosphere samples at different storage time (a): The first case; (b): The second case