引用本文
叶子熠, 刘霜, 张信凤. 用于诱导纳米金快速聚集比色传感的DNA染料筛选[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(9): 2805-2810.
YE Zi-yi, LIU Shuang, ZHANG Xin-feng. Screening of DNA Dyes for Colorimetric Sensing Via Rapidly Inducing Gold Nanoparticles Aggregation[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(9): 2805-2810.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)09-2805-06  
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用于诱导纳米金快速聚集比色传感的DNA染料筛选
叶子熠, 刘霜, 张信凤*
成都理工大学材料与化学化工学院, 四川 成都 610059
*通讯作者 e-mail: zhangxinfeng09@cdut.cn

作者简介: 叶子熠, 女, 1998年生, 成都理工大学材料与化学化工学院硕士研究生 e-mail: 1635718283@qq.com

收稿日期: 2022-05-17 修回日期: 2022-11-18 接受日期: 2022-11-18
基金: 国家自然科学基金项目(21475013), 四川省科技厅应用基础项目(2018JY4066)资助
摘要

近年来, 金纳米粒子(AuNPs)因其极高的消光系数以及距离依赖性颜色而被广泛用于比色传感器的开发利用。 常见的盐诱导AuNPs聚集通过电荷屏蔽的方式进行, 聚集过程易受到干扰, 聚集后颜色往往不稳定, 而DNA染料通过电荷中和的方式实现AuNPs聚集, 该方法具有用量少, 聚集速度快, 并且稳定性好的优势, 因此对常见DNA染料进行筛选十分必要。 系统筛选了8种常见DNA染料包括EB、 AO、 TO、 SG、 PG、 TOTO-1、 TOTO-3和YOYO用于诱导AuNPs的快速聚集。 实验发现诱导AuNPs团聚的染料用量在0.18~2.6 μmol·L-1之间, 相比NaCl和Cys用量分别为60和20 mmol·L-1的传统诱导聚集方法用量仅为万分之一。 通过考察DNA染料诱导AuNPs聚集的“IC50”值(即诱导剂使AuNPs聚集的最大吸光度变化(A680/A520)的50%的浓度)评价聚集效率, 在筛选的8种DNA染料中, SG、 PG、 TOTO-1、 TOTO-3和 YOYO分子的“IC50”值在0.12~0.30 μmol·L-1之间, 相对较小, 诱导AuNPs聚集效率高。 由于带正电的N原子数量对AuNPs的聚集有关键性的作用, 即带正电的N原子数量越多, 中和AuNPs时的用量越少。 通过Marvin View中microspecies(微观结构式)和microspecies distribution(微观结构式分布)算出了具体带正电的N原子个数, 结果表明, 在pH=7条件下, SG、 PG、 TOTO-1、 TOTO-3和 YOYO分子带正电荷的N原子较多, 因此上述染料诱导AuNPs聚集效率高。 通过乔布曲线(Job)计算出双链DNA(dsDNA)碱基对与DNA染料的结合比, 结果表明相同条件下, 筛选的8种DNA染料与dsDNA碱基对的结合比相差不大。 结合实验拟合曲线计算出dsDNA与DNA染料的结合常数, 计算表明SG, YOYO, TOTO-3, PG与dsDNA的结合常数较大, 在2.75×109~3.12×1010 L·mol-1之间, 与DNA结合能力较强。 综合考虑SG、 PG、 YOYO、 TOTO-3等染料在快速诱导AuNPs聚集及比色传感方面效果较好。

关键词: DNA染料; 纳米金; 结合常数; 传感
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Screening of DNA Dyes for Colorimetric Sensing Via Rapidly Inducing Gold Nanoparticles Aggregation
YE Zi-yi, LIU Shuang, ZHANG Xin-feng*
College of Materials and Chemistry & Chemical Engineering, Chengdu University of Technology, Chengdu 610059, China
*Corresponding author
Abstract

In recent years, gold nanoparticles (AuNPs) have been widely used in developing and utilising colorimetric sensors due to their extremely high extinction coefficient and distance-dependent color. Common salt-induced AuNP aggregation is carried out using charge shielding, the aggregation process is easily disturbed, and the color is often unstable after aggregation. DNA dyes achieve AuNPs aggregation by charge neutralization, which has the advantages of less dosage and faster aggregation speed. Fast and stable. Therefore, it is necessary to screen for common DNA dyes. In this paper, eight common DNA dyes, including EB, AO, TO, SG, PG, TOTO-1, TOTO-3 and YOYO, were systematically screened for inducing the rapid aggregation of AuNPs. Experiments found that the amount of dye to induce AuNPs agglomeration was between 0.18 and 2.6 μmol·L-1, about 10 000 times lower than the traditional method of inducing aggregation with NaCl and Cys dosages of 60 mmol·L-1 and 20 mmol·L-1, respectively. In addition, the aggregation efficiency was evaluated by examining the “IC50” value of DNA dye-induced AuNPs aggregation (that is, the concentration of 50% of the maximum absorbance change ( A680 /A520) of AuNPs aggregation induced by the inducer). Among the eight DNA dyes screened, SG The “IC50” values of, PG, TOTO-1, TOTO-3 and YOYO molecules were between 0.12 and 0.30 μmol·L-1, which were relatively small, and the aggregation efficiency of AuNPs was high. Since the number of positively charged N atoms plays a key role in the aggregation of AuNPs, the more positively charged N atoms, the less the amount of neutralizing AuNPs. The number of positively charged N atoms was calculated through the microspecies and microspecies distribution in Marvin View. The results show that pH=7, SG, PG, TOTO-1, TOTO-3, And YOYO molecules have more positively charged N atoms, so the above dye-induced AuNPs aggregation efficiency is high. At the same time, the binding ratio of double-stranded DNA (dsDNA) base pairs to DNA dyes was calculated by the Job curve. The results showed that the binding ratios of the 8 kinds of DNA dyes screened to dsDNA base pairs were similar under the same conditions. Based on the binding ratio, the binding constants of dsDNA and DNA dyes were calculated by combining the experimental fitting curves. The calculation showed that the binding constants of SG, YOYO, TOTO-3, PG and dsDNA were relatively large, ranging from 2.75×109 to 3.12×1010 L·mol-1, and the binding ability to DNA is stronger. Taken together, SG, PG, YOYO, TOTO-3 and other dyes are effective in rapidly inducing AuNPs aggregation and colorimetric sensing.

Keyword: DNA dyes; Gold nanoparticles (AuNPs); Binding constant; Screening
引言

纳米材料具有特殊的尺寸效应和优异的光电性质, 已在传感分析中得到广泛应用[1, 2], 特别是金纳米粒子(AuNPs)由于局部表面等离子体共振, 其光学响应会伴随AuNPs形态、 大小以及组成的改变而发生变化[3]。 AuNPs具有极高的消光系数, 且其形状、 大小以及AuNPs之间的距离会影响其溶液所呈现的颜色[4]。 因此AuNPs已被广泛应用于构建比色生物传感器[5, 6, 7]。 目前引起AuNPs聚集的方式有两种类型[8, 9], 一类是交联作用引起的聚集, 比如Mirkin[10]等借助DNA交联分子, 通过在AuNPs上杂交两条互补的DNA链来触发AuNPs聚集; 也可以通过抗体修饰的AuNPs和目标物之间的相互作用实现AuNPs的聚集[11, 12]。 另一类是非交联作用引起的聚集, 主要是盐诱导AuNPs聚集。 盐诱导AuNPs聚集具有方便, 价廉以及颜色变化显著等优点, 在比色传感中得到广泛应用。 然而, 盐诱导AuNPs聚集动力学过程较复杂, 并且聚集后颜色以及吸光度值不断变化, 不利于准确分析[13, 14, 15]。

前期实验发现DNA染料诱导AuNPs聚集具有用量少、 速度快并且稳定性好的优势[16]。 DNA染料诱导AuNPs聚集主要通过带正电的染料中和AuNPs表面的电荷, 实现 AuNPs的聚集, 带来颜色变化。 Xing[17]等报道了利用电荷中和诱导AuNPs聚集, 并构建了无标记、 比色传感体系, 用于检测玉米烯酮。 然而, 这些研究工作仅对SYBR Green I (SG)一种DNA染料进行研究。 本研究进一步详细筛选了常见的DNA染料[18, 19, 20], 考察了其诱导AuNPs聚集的染料用量“ IC50” 、 碱基对与染料的结合比及DNA与染料的结合常数, 以筛选出最佳DNA染料。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

UV-5200PC型紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司); Nikon D7000型数码照相机(株式会社尼康); ZEN360型纳米粒度电位仪(英国马尔文仪器有限公司); F-7000型荧光分光光度计(日本株式会社日立高新技术科学)。

实验所用试剂均为分析纯, 用水均为超纯水(18.25 MΩ · cm-1, 四川优普超纯科技有限公司)。 四氯金酸(HAuCl4· 3H2O, 99.99%), 磷酸二氢钠二水合物(NaH2PO4· 2H2O), 噻唑橙(TO), 溴化乙锭(EB)购买于阿拉丁生化科技股份有限公司。 柠檬酸三钠(C6H5Na3O7· 2H2O), 二甲基亚砜(DMSO)购买于成都科龙化工试剂厂。 氢氧化钠(NaOH)购买于成都金山化学试剂有限公司。 Picogreen(PG, 10 000× ), TOTO-1碘化物(1 mmol· L-1), TOTO-3碘化物(1 mmol· L-1), YOYO-1碘化物(1 mmol· L-1), SYBRGreen(SG, 10 000× )购买于赛默飞世尔科技有限公司。 吖啶橙(AO)购买于西格玛奥德里奇科技有限公司。 本实验所用双链DNA(dsDNA)由上海生工生物工程有限公司合成并纯化, 两条链的序列为TTC CTC TGT GCG CCG GTC TCT CCT和AGG AGA GAC CGG CGC ACA GAG GAA。

1.2 方法

1.2.1 AuNPs的制备

参照文献[21]方法进行制备。 将60 mL质量分数为0.01%的HAuCl4溶液加入三颈烧瓶, 油浴加热煮沸后立即加入800 μ L质量分数2%的柠檬酸三钠, 当溶液颜色由蓝色变为酒红色后继续煮沸20 min停止加热, 可获得粒径为14 nm, 浓度为4 nmol· L-1的AuNPs颗粒, 将溶液缓慢搅拌冷却至室温后保存在4 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 DNA染料诱导AuNPs聚集

用不同的DNA染料诱导AuNPs聚集, 每种DNA染料取8种不同的浓度, 这8种浓度能使AuNPs产生红色到紫色再到蓝色的颜色变化。 将一定量DNA染料加入到250 μ L AuNPs 溶液中, 终体积为300 μ L。 用移液枪充分搅拌混匀以上溶液, 随着DNA染料浓度的增大, 溶液产生由红色到紫色再到深蓝色的颜色变化, 随后用数码相机拍摄溶液照片。

1.2.3 不同DNA染料与DNA的结合比

结合比的测定参照文献[22]介绍的方法并加以改进。 取一定量的dsDNA与一定量DNA染料于磷酸缓冲液中, 终体积为300 μ L, 保持碱基对与DNA染料的总物质摩尔浓度不变, 改变碱基对与DNA染料的摩尔分数, 在dsDNA与DNA染料的最佳激发波长下测定不同比例的荧光强度, 选出最高荧光强度的条件即为碱基对与DNA染料的结合比n值。

1.2.4 不同DNA染料与DNA的结合常数

取一定量的DNA染料和磷酸缓冲溶液于比色皿中, 终体积为1 000 μ L, 测定其DNA染料初始的荧光值Fmin, 然后逐次滴加dsDNA, dsDNA的浓度由低到高, 每滴加一次dsDNA测定一次荧光值, 直至DNA染料和dsDNA的荧光值不再发生变化, 此时的荧光值记为Fmax。

2 结果与讨论
2.1 不同DNA染料诱导纳米金聚集

筛选了一些常见的DNA染料诱导AuNPs聚集, 包括EB、 AO、 TO、 SG、 PG、 TOTO-1、 TOTO-3、 YOYO八种染料, 其分子结构分别如图1所示。

图1 不同核酸的结构式Fig.1 Structural formulas of different nucleic acids

所考察的8种染料均可诱导AuNPs快速聚集, 使AuNPs颜色由红色变为深蓝色(图2)。 这8种DNA染料诱导AuNPs聚集所使用试剂浓度大小排序为AO(2.6 μ mol· L-1), EB(1.6 μ mol· L-1), TO(1.1 μ mol· L-1), SG(0.59 μ mol· L-1), TOTO-1(0.30 μ mol· L-1), TOTO-3(0.30 μ mol· L-1), PG(0.24 μ mol· L-1), YOYO(0.18 μ mol· L-1)。 其中, 使用浓度最小的是 YOYO, 诱导 AuNPs 聚集仅需要0.18 μ mol· L-1, 使用浓度最大的是AO, 诱导AuNPs聚集也仅需要2.6 μ mol· L-1。 传统的 NaCl 和半胱氨酸(Cys)的使用浓度分别为60和20 mmol· L-1。 可见, DNA染料诱导AuNPs聚集的用量仅为NaCl和Cys用量的万分之一。

图2 DNA染料, NaCl, Cys诱导AuNPs聚集可视化图片
AuNPs浓度: 4 nmol· L-1; 溶液pH: 7.0Fig.2 Visualization of the aggregation of AuNPs induced by DNA dyes, NaCl and Cys
AuNPs concentration: 4 nmol· L-1; solution pH: 7.0

2.2 不同DNA染料诱导的聚集效率

为了定量评价DNA染料诱导AuNPs聚集的效果, 考察DNA染料诱导AuNPs聚集效率, 定义一个“ IC50” 值, 即诱导剂使AuNPs聚集的最大吸光度变化(A680/A520)50%所对应的浓度。 不同浓度的DNA染料诱导AuNPs聚集吸光度比值A680/A520的变化图3(a— h)所示。

图3 不同浓度的DNA染料诱导AuNPs聚集吸光度比值A680/A520
AuNPs浓度: 4 nmol· L-1; 溶液pH: 7.0Fig.3 Absorbance ratio of AuNPs aggregation induced by different concentrations of DNA dyes A680/A520
AuNPs concentration: 4 nmol· L-1; solution pH: 7.0

根据最大吸光度变化(A680/A520)50%所得出各个DNA染料的“ IC50” 值如表1。 DNA染料诱导AuNPs的“ IC50” 值越小, 则DNA染料诱导AuNPs聚集的用量就越少。 因此根据诱导AuNPs聚集的DNA染料用量可以得出: YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG、 SG的诱导聚集效果明显优于EB、 TO、 AO。

表1 DNA染料诱导AuNPs的IC50的比较 Table 1 Comparison of IC50 of AuNPs induced by DNA dyes

前期研究[16]发现DNA染料诱导AuNPs聚集依赖于电荷中和效应, 并且带正电的N原子数量对AuNPs的聚集有关键性的作用, 带正电的N原子数量越多, 中和AuNPs时的用量越少。 因此使用Marvin View中microspecies(微观结构式)和microspecies distribution(微观结构式分布)计算出具体带正电的N原子个数。 结果表明, 在pH=7条件下, AO有0.94个N原子带正电荷, EB和TO 有1个N原子带正电荷, SG有2.59个N原子带正电荷, PG有3.08个N原子带正电荷, TOTO-1、 TOTO-3、 YOYO有4个N原子带正电荷, 很好地解释了YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG、 SG的诱导聚集效果明显优于EB、 TO、 AO的原因。

2.3 DNA染料的结合比

DNA染料常与dsDNA结合[23], 因此碱基对与染料的结合比及dsDNA与DNA染料的结合常数会影响游离DNA染料的量, 进而影响对AuNPs聚集调控。 考察碱基对与染料的结合比以及dsDNA与DNA染料的结合常数是非常重要的。

首先通过Job曲线[22]确定碱基对与DNA染料的结合比, XBp表示碱基对物质的量比碱基对和DNA染料总的物质的量, 最高荧光强度的条件即为碱基对与DNA染料的结合比n值。 由图4(a— h)可知, 碱基对与SG、 PG、 TOTO-3、 YOYO的结合比为1:0.67; 与TO, TOTO-1的结合比为1:1, 与EB的结合比为1:1.5, 与AO的结合比为1:2.3。 结果表明, 相同条件下, dsDNA中的碱基对与8种DNA染料的结合比相差不大。

图4 不同DNA染料XBp对FL intensity的Job曲线
碱基对与DNA染料总物质摩尔浓度: EB: 10 μ mol· L-1; AO: 1 μ mol· L-1; TO: 2 μ mol· L-1; SG: 0.5 μ mol· L-1; PG: 0.2 μ mol· L-1; TOTO-1: 1 μ mol· L-1; TOTO-3: 0.2 μ mol· L-1; YOYO: 0.1 μ mol· L-1; 溶液pH: 7.0Fig.4 Job curves of different DNA dyes XBp on FL intensity
Total molar concentsation of base pairs and DNA dye: EB: 10 μ mol· L-1; AO: 1 μ mol· L-1; TO: 2 μ mol· L-1; SG: 0.5 μ mol· L-1; PG: 0.2 μ mol· L-1; TOTO-1: 1 μ mol· L-1; TOTO-3: 0.2 μ mol· L-1; YOYO: 0.1 μ mol· L-1; solution pH: 7.0

图5 不同DNA染料的实验拟合曲线
DNA染料初始浓度: EB: 1 μ mol· L-1; AO: 0.1 μ mol· L-1; TO: 0.1 μ mol· L-1; SG: 0.05 μ mol· L-1; PG: 0.05 μ mol· L-1; TOTO-1: 0.05 μ mol· L-1; TOTO-3: 0.2 μ mol· L-1; YOYO: 0.05 μ mol· L-1; 溶液pH: 7.0Fig.5 Fitting curves of different DNA dyes
DNA dye initial concentration : EB: 1 μ mol· L-1; AO: 0.1 μ mol· L-1; TO: 0.1 μ mol· L-1; SG: 0.05 μ mol· L-1; PG: 0.05 μ mol· L-1; TOTO-1: 0.05 μ mol· L-1; TOTO-3: 0.2 μ mol· L-1; YOYO: 0.05 μ mol· L-1; solution pH: 7.0

2.4 DNA染料的结合常数

研究中通过dsDNA与DNA染料的结合常数评估了两者间的相互作用[24]。 在已知结合比的基础上, 将结合比n值, Fmin, Fmax代入如式(1)— 式(5)拟合滴定曲线即可得到结合常数 Ka[25]。

Ka=dye-nDNA[DNA]n[dye](1)F=Fmin(1-X1)+FmaxX1(2)X1=[dye-nDNA][dye]+[dye-nDNA](3)F=Fmin[dye][dye]+[dye-nDNA]+Fmax[dye-nDNA][dye]+[dye-nDNA](4)F=Fmin+FmaxKaXa1+KaXn(5)

式(1)— 式(5)中, X1为结合率, Fmin为没有加入dsDNA时染料的荧光强度, Fmax为加入dsDNA饱和后染料的荧光强度。

由图5(a— h)分别可以看出, PG、 SG、 TOTO-3、 YOYO和TOTO-1的结合常数远大于AO、 EB和TO。 本实验中, 结合常数Ka越大, dsDNA与DNA染料的结合强度越大, dsDNA结合的DNA染料越多, 调控DNA染料诱导AuNPs聚集效果更显著。

将碱基对与DNA染料的结合比、 dsDNA与DNA染料的结合常数总结于表2。 dsDNA 与染料 SG、 YOYO、 TOTO-3和PG的结合常数较大, 分别为3.12× 1010, 9.49× 109, 4.25× 109和2.75× 109 L· mol-1, 远远大于dsDNA与其他染料的结合常数, 说明当dsDNA与SG、 PG、 YOYO和TOTO-3结合时, 游离的DNA染料相对较少, 在调控AuNPs的聚集上将有更好的效果, 用于检测DNA有更高的灵敏度。

表2 碱基对与DNA染料的结合比以及dsDNA与DNA染料的结合常数 Table 2 Binding ratios of base pairs to DNA dyes and binding constants of dsDNA to DNA dyes
3 结论

考察了一系列常见DNA染料诱导AuNPs的聚集效率(“ IC50” )以及DNA染料与DNA的相互作用。 从DNA染料诱导AuNPs聚集的使用量来看, YOYO、 TOTO-1、 TOTO-3、 PG和SG的用量更少, 诱导AuNPs聚集效果显著; 从dsDNA与DNA染料相互作用来看, dsDNA 与染料SG、 PG、 YOYO及TOTO-3 的结合能力比较强, 用于检测DNA将具有更高的灵敏度。 总之, SG、 YOYO、 PG和TOTO-3在调控AuNPs聚集效果及用于DNA检测的灵敏度将相差不大。 以上四种DNA染料有望用于构建高性能的AuNPs比色传感体系。

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