氯金酸, 辛硫磷, 马拉硫磷, 丙溴磷, 甲霜灵, 福美锌, 莠去津, 吡虫啉购自上海阿拉丁试剂有限公司, 柠檬酸钠, 氢氧化钠, 磷酸氢二钠, 磷酸二氢钠, 氯化钠, 乙腈, 醋酸钠, 无水硫酸钠和无水硫酸镁, 均购自上海国药集团化学试剂有限公司。 N-丙基乙二胺(PSA), C18, 石墨化碳黑(GCB)样品前处理材料购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。 所用试剂均为分析纯, 实验用水为二次去离子水。

U-3900紫外-可见分光光度计(日立, 日本), F-7000荧光分光光度计(日立, 日本), PB-10酸度计(赛多利斯, 德国), HT7700透射电子显微镜(日立, 日本), 激光纳米粒度仪(马尔文, 英国)。

1.2.1 金纳米粒子的制备

纳米金的制备根据文献略做修改^[15], 所有玻璃器皿在王水(浓盐酸:浓硝酸=3:1, V/V)中彻底清洗后, 用二次去离子水冲洗干净, 烘干备用。 制备过程: 在剧烈搅拌下, 将0.02%的HAuCl₄(96 mL)水溶液煮沸, 将2%柠檬酸三钠(4.0 mL)水溶液快速添加至上述溶液中, 溶液颜色从灰黄色变为深红色, 继续回流20 min后停止加热, 待溶液冷却后用0.45 μ m滤膜过滤, 滤液置于棕色试剂瓶中, 于4 ℃冰箱避光保存备用。

1.2.2 金纳米粒子的结构表征

取一定量上述制备的金纳米溶液, 分别对其紫外-可见吸收光谱、 透射电子显微镜、 动态光散射及表面的Zeta电位进行测定。 同时在纳米金溶胶中加入一定量的荧光染料罗丹明110, 形成纳米金-罗丹明110纳米复合粒子后, 再次对其吸收光谱和表面电荷情况进行测定。

1.2.3 比色及荧光测定

取一定量的纳米金溶胶, 加入不同浓度的目标物后, 溶液颜色由酒红色逐渐变为蓝紫色, 溶胶的吸光度值的变化与目标物浓度具有定量关系, 据此实现农药残留的比色法检测。

取一定量的纳米金溶胶, 加入一定浓度的罗丹明110, 形成纳米金复合物, 测试其荧光强度, 作为空白对照。 加入不同浓度的目标物后, 再次测试体系的荧光强度, 荧光增强的程度与目标物浓度在一定浓度范围内具有定量关系, 据此实现农药残留的荧光高灵敏检测。

分别利用紫外-可见光谱(UV-Vis), 透射电镜(TEM)和动态光散射对制备的纳米金进行形貌表征, 如图1所示。 由图1(a)曲线1可以看到金纳米粒子的最大吸收波长约为520 nm, 金纳米粒子等离子体共振紫外可见吸收特征峰。 当形成金纳米-罗丹明110纳米复合粒子后, 其最大吸收波长没有明显改变, 但其吸光强度有所下降(曲线2)。 从图1(b)的TEM图可看出所制备的Au纳米粒子尺寸约为13 nm, 呈规整的球形, 边界清晰, 分散良好。 图1(c)为金纳米-罗丹明110复合物的TEM图, 可以看出粒子的直径大小几乎没有改变。 图1(d)的动态光散射结果显示绝大多数纳米粒子直径同样保持13 nm左右, 与TEM测试粒径保持一致。 图1(e)是金纳米-罗丹明110复合物的动态光散射结果, 可以看出粒径略微有少许增加。 图1(f)显示单独金纳米粒子表面的zeta电位为-44.1 mV, 金纳米-罗丹明110纳米复合粒子表面的zeta电位明显升高, 为-30.3 mV, 这是由于金纳米表面吸附了一定量带正电荷的荧光染料罗丹明110所导致。

图1

Fig.1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 纳米金及其复合物的表征 (a): 溶液的紫外可见吸收光谱图(1)金纳米粒子, (2)金纳米-罗丹明110复合粒子, (3)罗丹明110; (b): 金纳米粒子的透射电镜图(插图为局部放大); (c): 金纳米粒子-罗丹明110的透射电镜图(插图为局部放大); (d): 金纳米溶胶的动态光散射粒径分布图; (e): 金纳米-罗丹明110溶胶的动态光散射粒径分布图; (f): 金纳米及其复合粒子的表面Zeta电位Fig.1 Characterization of AuNPs and complexes (a): UV-Vis absorption spectra of the solution, (1) AuNPs, (2) Complexes of AuNPs and rhodamine 110 and (3) Rhodamine 110; (b): TEM image of AuNPs (the illustration is a partial enlargement); (c): TEM image of AuNPs-Rhodamine 110 (the illustration is a partial enlargement); (d): Dynamic light scattering of AuNPs solution; (e): Dynamic light scattering of AuNPs-Rhodamine 110 solution; (f): Zeta potential of AuNPs and complexes

农药残留的比色和荧光双模传感原理如图2所示。 柠檬酸盐还原法制备的AuNPs表面带有较多的负电荷, 即使在一定浓度盐存在下, 粒子之间的静电排斥力使得金纳米胶处于良好的分散状态, 其溶液显示酒红色。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 比色和荧光双模式传感原理示意图Fig.2 Schematic of colorimetric and fluorescence dual mode sensing principle

当存在农药分子时, 与纳米金之间通过形成Au— N或者Au— O配位键结合, 导致分散的AuNPs在农药分子诱导作用下发生聚集, AuNPs溶液颜色由酒红色变为蓝紫色, 其在520 nm处的吸光度逐渐降低, 通过检测溶液吸光度的变化即可实现农药含量的测定。 溶液颜色的显著变色即便裸眼也可以观察, 该检测方式具有简便、 快速和成本低的优势。 单一的比色检测模式虽然简单, 但是其测试结果存在假阳性的可能。 为进一步验证结果的准确性, 同时提高检测的灵敏度, 本文利用荧光分子的发射与金纳米的紫外可见吸收产生内滤效应(IFE), 设计了荧光传感策略用于农药的高灵敏检测。 在金纳米溶胶中引入带正电的荧光染料罗丹明110, 由于静电作用, 罗丹明110会吸附在带负电荷的纳米金表面, 此时纳米金在溶胶中仍处于良好的分散状态, 溶胶显示酒红色。 而荧光染料罗丹明110发射的荧光正好可以被金纳米吸收, 此时溶液的荧光强度很弱, 甚至不发射荧光。 一旦溶液中存在农药分子, 与荧光染料产生竞争反应, 从而诱导金纳米聚集, 溶液由酒红色变为蓝紫色, 同时释放金纳米表面吸附的荧光分子到溶胶中, 实现荧光的恢复, 根据溶液吸光度和荧光强度变化实现对目标物的双模式检测。

2.3.1 比色法检测农药残留

分别对金纳米溶胶和加入辛硫磷后的金纳米溶胶进行紫外可见光谱扫描, 结果如图3(a)所示。 结果表明, 与单独的金纳米溶胶相比, 加入不同浓度的辛硫磷后的金纳米溶胶在520 nm波长处吸光度逐渐减小, 同时650 nm波长处吸光度逐渐增加。 这是由于辛硫磷的加入引起了分散的AuNPs团聚, 导致金表面等离子共振吸收峰发生位移。 溶胶在650与520 nm处吸光度的比值(A_650/520)与加入的目标物浓度具有定量关系, 据此实现比色法测定辛硫磷的含量的目的。

图3

Fig.3

Figure Option ViewDownloadNew Window

图3 实验的可行性研究 (a): 不同条件下溶液的紫外可见吸收光谱: (1)金纳米, (2)金纳米+5.0 μ mol· L-1目标物, (3)金纳米+10.0 μ mol· L-1目标物; (b):不同条件下溶液的荧光光谱: (1)罗丹明110, (2)罗丹明110+金纳米, (3)罗丹明110+金纳米+3.0 μ mol· L-1目标物; (c): 荧光的内滤光效应Fig.3 Feasibility of the strategy (a): UV-Vis absorption spectra of solution under different conditions : (1) AuNPs, (2) AuNPs+5.0 μ mol· L-1 targets, (3) AuNPs+10.0 μ mol· L-1 targets; (b) Fluorescence spectra of solutions under different conditions: (1) Rhodamine 110, (2) Rhodamine 110+AuNPs, (3) Rhodamine 110+AuNPs+3.0 μ mol· L-1 targets; (c): Internal filtering effect of fluorescence

2.3.2 荧光法检测农药残留

分别测试罗丹明110溶液, 金纳米与罗丹明110复合物溶胶以及加入一定量的农药后溶胶的荧光强度作对照, 其实验结果如图3(b)所示。 图中三条曲线的峰形及最大发射波长一致, 表明AuNPs、 辛硫磷并未与罗丹明 110作用生成新物质。 可以看出, 罗丹明110的荧光最强(曲线1), 其最大发射波长为520 nm; 而金纳米与罗丹明110复合物的荧光发射强度显著降低(曲线2), 这是由于罗丹明110分子可通过静电作用吸附在AuNPs表面, 此时, 由于AuNPs与罗丹明110分子间的IFE产生荧光猝灭效应; 当加入待测目标物农药后, 溶液的荧光强度又逐渐恢复(曲线3), 主要因为农药分子与纳米金的强结合能力, 使得吸附在纳米金表面的罗丹明110分子重新释放到溶胶中, 其荧光的恢复程度与目标农药的浓度具有定量关系, 据此, 实现高灵敏荧光检测农药残留量。

2.3.3 金纳米与罗丹明110的内滤光效应(IFE)

当溶液中某物质的吸收光谱与共存的某荧光分子的荧光光谱发生重叠或者部分重叠时, 则该物质将能猝灭荧光分子的荧光发射, 导致溶液的荧光强度减弱甚至消失, 这种现象称为IFE。 本实验金纳米粒子的吸收光谱与荧光染料罗丹明110的荧光光谱恰好发生了重叠, 如图3(c)所示。 结果进一步证实, 二者之间确实存在IFE。 上述结果表明, 本实验设计的比色和荧光双模式检测策略是可行的。

2.4.1 罗丹明110浓度的优化

实验中AuNPs和罗丹明110的相对量会直接影响荧光检测的灵敏度。 游离的罗丹明110分子在溶液中本身发射荧光, 如果其浓度过高, 会使检测的背景信号增大; 反之, 若罗丹明110浓度过低, 加入待测物质后, 形成的聚集态AuNPs使荧光恢复程度较小, 降低了测定的灵敏度。 固定金纳米溶液的浓度, 测试不同浓度罗丹明110的荧光强度与二者复合物溶液的荧光强度差值的变化情况, 如图4(a)所示。 可以看出随着罗丹明110的浓度的增加, 荧光强度差值逐渐增大, 当罗丹明110的浓度为0.5 μ mol· L^-1时, 二者的差值达到最大, 罗丹明110的浓度再增大, 荧光背景增大, 二者的差值又逐渐减小, 因此, 选择0.5 μ mol· L^-1的罗丹明110作为最佳实验条件。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 实验条件的优化 (a): 罗丹明110浓度的优化; (b): 体系的pH值优化; (c): 反应时间的优化Fig.4 Optimization of experimental conditions (a): Optimization of Rhodamine 110 concentration; (b): Optimization of pH; (c): Optimization of time

2.4.2 体系酸度的优化

分别测试了不同酸度条件下, 体系的吸光度和荧光强度的差异, 结果如图4(b)所示。 表明pH值较低时, 利于罗丹明110的质子化, 其与AuNPs的作用力大, 不利于农药分子与罗丹明110在AuNPs表面的竞争, 因此, 体系的吸光度值(A_650/520)较低, 荧光强度也比较弱。 随着pH值的增大, 吸光度和荧光强度均逐渐升高; 当溶液的pH超过7.5后, 体系的荧光强度有一定的下降, 可能是罗丹明110分子羧基中氢离子解离的缘故, 如图4(b)所示。 因此, 确定实验的最合适pH为7.5。

2.4.3 反应时间的优化

在最合适pH和浓度条件下, 分别改变目标物, 罗丹明110与金纳米作用时间, 测试溶液的吸光度和荧光强度的变化, 如图4(c)所示。 结果表明, 目标物与金纳米作用时间为60 min; 罗丹明110与金纳米作用时间30 min的情况下, 吸光度和荧光强度达到最佳。

2.5.1 农药残留的比色分析

选取辛硫磷为模型分析物, 验证基于纳米金比色传感策略的检测效果, 图5(a)是不同浓度的辛硫磷存在时, 溶胶的吸收曲线, 插图为相应浓度的目标物导致的溶液颜色的变化情况。 由图5(a)可知, 随着目标物浓度的增大, 520 nm处吸光度逐渐降低, 表现为从a到f颜色由酒红色逐渐转变为蓝紫色。 在0.05~10 μ mol· L^-1浓度范围内, 溶液在650 nm处与520 nm处的吸光度比值, 即(A₆₅₀/A₅₂₀)与目标物浓度之间有良好的线性关系, 如图5(b)所示。 线性回归方程: A_650/520=0.073c+0.083(A₆₅₀/A₅₂₀: 波长650与520 nm处吸光度比值; c: 目标物浓度, μ mol· L^-1), 相关系数为0.997, 检出限为15 nmol· L^-1。

图5

Fig.5

Figure Option ViewDownloadNew Window

图5 不同浓度目标物存在时, 体系的紫外-可见吸收和荧光响应情况 (a): 目标物浓度分别为(a— f: 0.05, 0.2, 0.5, 2.0, 5.0, 10.0 μ mol· L-1)时, 紫外-可见吸收光谱, 其中插图为溶液颜色变化情况; (b): 溶液在650 nm处与520 nm处的吸光度比值(A650/A520)与目标物浓度变化的线性关系; (c): 目标物浓度分别为(1— 6: 0.01, 0.05, 0.2, 1.0, 2.0, 5.0 μ mol· L-1)时的荧光光谱; (d): 荧光强度与目标物浓度变化的线性关系Fig.5 UV-Visible absorption and fluorescence response of the system in the presence of different concentrations of targets (a): The UV-Vis absorption spectra of the solution in the presence of different concentration targets (the concentration of a— f are 0.05, 0.2, 0.5, 2.0, 5.0, 10.0 μ mol· L-1, respectively), and the color change of the solution was illustrated; (b): The ratio of absorbance at 650 to 520 nm (A650/A520) was linear with the change of target concentration; (c): The fluorescence spectra of the solution in the presence of different concentration targets (the concentration of 1— 6 are 0.01, 0.05, 0.2, 1.0, 2.0, 5.0 μ mol· L-1, respectively); (d): Linear relationship between fluorescence intensity and different concentration of targets

2.5.2 农药残留的荧光分析

在最佳实验条件下, 测试了不同浓度模型化合物与溶液荧光强度的变化关系, 如图5(c)所示。 可以看出体系的荧光强度随着目标物浓度的增加辐逐步增大。 在目标物浓度从0.01~5 μ mol· L^-1的范围内, 体系的荧光强度和目标物浓度之间存在良好的线性关系, 如图5(d)所示。 线性回归方程: I=26.60c+ 6.82(I: 荧光强度; c: 目标物浓度, μ mol· L^-1), 相关系数为0.994, 检出限为4 nmol· L^-1。

2.5.3 干扰实验

由于实际样品中可能有多种成分同时存在, 因此, 进一步研究其他的类似物如马拉硫磷, 丙溴磷, 甲霜灵, 福美锌, 莠去津和吡虫啉等农药存在时, 体系荧光的变化情况, 结果图6所示。 所有农药浓度均为2.0 μ mol· L^-1, 可以看出, 该传感器对辛硫磷、 吡虫啉和莠去津的响应较好, 对丙溴磷和甲霜灵响应较差。 分析其分子结构可以得出, 响应好的农药分子具有较多的氮、 氧和硫原子, 但是福美锌分子同样具有较多的硫原子, 荧光响应一般, 可能是由于福美锌分子中的氮原子与锌形成了配位键, 导致其与金纳米表面作用力较弱的缘故。 同样测试了部分金属离子共存时, 体系的荧光响应情况, 结果表明, 金属离子几乎不影响体系的荧光, 可能是由于溶液中共存的金属离子经过样品预处理时, 与吸附剂中N-丙基乙二胺(PSA)的发生了配位结合而被去除的缘故。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 不同农药分子和金属离子存在时的荧光响应Fig.6 Fluorescence response of different pesticide moleculesand metal ions

在最佳实验条件下, 将该双模式传感器的荧光检测策略用于市场购买的生姜和天然水中农药残留量的测定。 新鲜生姜使用QuEChERS方法处理, 步骤如下: 取市售新姜10.000 0 g, 捣碎, 加入10 mL含1%醋酸的乙腈溶液和1 g醋酸钠, 摇匀后加入1 g氯化钠和4 g无水硫酸钠趁热剧烈震荡1 min, 以7 000 r· min^-1离心5 min。 取上清液 5.00 mL, 加入0.25 g PSA, 0.25 g C18(碳18), 0.1 g GCB石墨化碳黑和6.25 g无水硫酸镁, 再次以7 000 r· min^-1离心2 min, 取上清液待测。 天然水样取之青岛农业大学校园内虹子湖, 水样经0.45 μ m的滤膜过滤后, 待测。

在以上处理好的生姜提取液和水样中, 分别加入浓度为0.2和2 μ mol· L^-1的辛硫磷, 混合均匀进行检测, 每个浓度进行6次重复的实验, 实验结果如表1所示。 与天然湖水相比, 生姜处理液的加标回收率检测结果偏差稍大, 可能与生姜处理液的成分相对复杂有关。 研究表明本方法具有良好的抗干扰能力, 可以用于实际样品的测定。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 生姜和天然水中辛硫磷残留的测定 Table 1 Determination of pesticide residues in ginger and natural water 样品 测量值/ (μ mol· L-1) 加入的浓度/ (μ mol· L-1) 测量值/ (μ mol· L-1) RSD/% (n=6) 回收率 /% 生姜 未检出 0.20 0.185 5.44 92.5 生姜 未检出 2.00 2.150 3.87 107.5 湖水 未检出 0.20 0.204 2.86 102 湖水 未检出 2.00 1.984 5.03 99.2

表1 生姜和天然水中辛硫磷残留的测定 Table 1 Determination of pesticide residues in ginger and natural water