实验以郑单958玉米品种为例, 采用种子老化箱, 在温度为40 ℃、 100% RH(相对湿度)条件下将种子样本分批老化0、 18、 36、 54、 72 h, 如图1(a)所示。

图1

Fig.1

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	图1 样本制备 (a): 老化玉米种子样本; (b): 纯淀粉标样Fig.1 Sample preparation (a): Aged corn seed sample; (b): Pure starch specimen

纯淀粉标样所需的玉米淀粉及聚乙烯粉末均购自于赛谱锐思公司, 将玉米淀粉与高密度聚乙烯粉末按照1:1的比例进行充分混合, 在压片机下制成厚度约为1 mm的薄片样本, 图1(b)所示。

采用英国Teraview公司的TeraPulse 4000太赫兹时域光谱仪以及反射成像附件, 参数设定如下: 成像区域为20 mm× 20 mm, 横/纵向步长为200 μ m。

将老化0、 18、 36、 54、 72 h的玉米种子样本(胚朝下)及纯淀粉标样分别置于反射成像系统中心位置, 单个像素点扫描3次取平均。 环境温度为22 ℃。 图2所示为反射成像采集实验。

图2

Fig.2

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	图2 THz光谱反射成像仪器Fig.2 THz spectral reflectance imaging instrument

相关系数成像法^[15]以某一条光谱为标准, 计算图像上每一个像素点的光谱与标准光谱的相关系数来衡量两个变量因素的相关密切程度, 再根据相关系数值进行伪彩色成像。 相关系数计算如式(1)所示

r=∑i=1n(xi-x̅)(yi-y̅)∑i=1n(xi-x̅)2∑i=1n(yi-y̅)2(1)

式(1)中, x和y分别为玉米种子单像素点光谱和纯淀粉标样光谱, x̅和 y̅分别为玉米种子单像素点光谱列均值和纯淀粉光谱列均值, n为光谱维度, i∈ n。 相关系数r的取值范围在0~1之间, 其值大小可以反映出各像素点光谱与纯淀粉标样光谱的相关程度: 当r=1时, 说明光谱之间完全相关; 当r=0时, 说明光谱之间完全不相关; 当0.3< r< 0.5时, 光谱之间存在较低的相关性; 当0.5< r< 0.8时, 光谱之间呈现显著相关性; 当0.8< r< 1时, 反映出该像素点处光谱与淀粉光谱存在强相关性, 可基本判定该像素点成分为淀粉。

采用上述相关系数成像法计算种子各像素点光谱与纯淀粉标样光谱之间的相关系数, 对相关系数进行伪彩色成像得到种子淀粉分布图。

单个样本的THz反射成像数据集共包含0~269.5 cm^-1区间内281个波长的灰度图像(如图3所示), 灰度值即为样本在该波长处的吸光度值。 在> 70 cm^-1后的图像质量较差, 种子轮廓信息几乎被噪点淹没, 因此仅保留0~70 cm^-1区间内71个波长的灰度图像做后续分析。

图3

Fig.3

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	图3 部分波长下的种子灰度图Fig.3 Grayscale map of seeds at some wavelengths

以与非目标区域区分较为明显的16.35 cm^-1的灰度图像为基准, 采用阈值分割方法剔除背景, 提取种子种胚、 胚乳以及纯淀粉标样区域。

以老化0 h样本为例, 图4所示为玉米种子样本中提取的胚乳、 种胚及纯淀粉标样区域内计算得到的THz吸光度平均谱。 其中红色实线所示的胚乳在28.86和51.96 cm^-1处存在明显吸收峰; 蓝色实线所示的种胚在0~70 cm^-1范围内无明显吸收峰; 黑色实线所示的淀粉纯物质在3.84以及51.96 cm^-1有明显的吸收峰。 从图4中可见胚乳和种胚光谱差异明显, 这是由于两者所含的主要成分不同导致的: 玉米种子胚乳成分以淀粉为主, 而种胚成分则以蛋白和脂肪为主。 胚乳和淀粉纯物质在51.96 cm^-1附近存在明显的共同吸收峰, 也从侧面反映了胚乳中主要成分以含淀粉为主。

图4

Fig.4

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	图4 太赫兹吸光度平均谱Fig.4 THz absorbance average spectrum

以老化0 h的种子样本为例, 应用移动窗口相关系数成像法构建淀粉可视化分布图, 步骤如下:

①移动窗口划分: 不同区间的光谱信息所反映的种子成分信息不同, 为找到能够表征淀粉成分的合适谱区窗口, 实验设窗口宽度为20, 移动步长为10, 在0~70 cm^-1范围内划分得到如下6个子窗口: 1— 21(0~19.24 cm^-1), 11— 31(9.62~28.87 cm^-1), 21— 41(20.21~38.49 cm^-1), 31— 51(29.83~48.11 cm^-1), 41— 61(38.49~57.74 cm^-1), 51— 71(48.11~67.36 cm^-1);

②相关系数计算: 采用式(1)分别计算玉米种子各像素点与淀粉纯物质光谱在6个子窗口中的相关系数;

③伪彩色成像: 根据相关系数值以及坐标信息绘制伪彩色热力图, 以相关系数值大小划分色阶, 其中相关系数为1用红色表示, 表明该像素点成分主要为淀粉, 相关系数为0用蓝色表示, 表明该像素点成分与淀粉基本无关, 最终6个子窗口的玉米种子-淀粉纯物质相关系数值可视化分布图如图5(a— f)所示。

图5

Fig.5

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图5 六个移动子窗口相关系数成像图 (a): 1— 21(0~19.24 cm-1); (b): 11— 31(9.62~28.87 cm-1); (c): 21— 41(20.21~38.49 cm-1); (d): 31— 51(29.83~48.11 cm-1); (e): 41— 61(38.49~57.74 cm-1); (f): 51— 71(48.11~67.36 cm-1)Fig.5 Six moving subwindow correlation coefficient imaging plots (a): 1— 21(0~19.24 cm-1); (b): 11— 31(9.62~28.87 cm-1); (c): 21— 41(20.21~38.49 cm-1); (d): 31— 51(29.83~48.11 cm-1); (e): 41— 61(38.49~57.74 cm-1); (f): 51— 71(48.11~67.36 cm-1)

图5(d)— (f)能够较为明显地分辨种胚和胚乳区域淀粉分布情况, 其中胚乳区域内的相关系数大多在0.5~1.0之间, 而种胚区域内的相关系数大多在0~0.5之间。 胚乳区域大部分呈现红色, 表明淀粉主要分布在胚乳区域, 与实际情况较为相符。

当0.8< r< 1时, 像素点光谱与纯淀粉光谱存在强相关性, 可判定该像素点成分主要为淀粉。 定义式(2)即目标区域内相关系数> 0.8的像素点占比来量化统计不同活力阶段的淀粉分布变化。 Ratio_{r> 0.8}值越大表明种子淀粉含量越高。

Ratio=相关系数> 0.8的像素点个数像素点总数×100%(2)

由于淀粉在胚乳和种胚中含量存在显著差异, 为精细化分析不同活力阶段胚乳和种胚中淀粉的分布变化, 实验分别针对胚乳、 种胚、 整粒的Ratio_{r> 0.8}进行统计分析。

2.3.1 胚乳淀粉分布分析

根据式(2)计算相关系数> 0.8的像素点占胚乳比Ratio_{r> 0.8}, 统计信息如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 胚乳Ratior> 0.8统计信息表 Table 1 Statistical information of endosperm Ratior> 0.8 老化 时间/h 窗口 1— 21 11— 31 21— 41 31— 51 41— 61 51— 71 0 13.92% 15.43% 0.35% 24.48% 40.37% 29.7% 18 0.99% 78.29% 1.48% 55.43% 44.9% 19.74% 36 1.06% 18.06% 3.48% 19.75% 14.47% 12.57% 54 11.75% 24.89% 0.69% 30.21% 24.09% 15.0% 72 17.47% 58.31% 0.37% 3.35% 4.55% 3.75%

表1 胚乳Ratior> 0.8统计信息表 Table 1 Statistical information of endosperm Ratior> 0.8

根据表1可得图6所示胚乳Ratio_{r> 0.8}折线图。 在6个子窗口下, 可以直观的观察到Ratio_{r> 0.8}在不同老化阶段的数值并线性拟合出Ratio_{r> 0.8}的趋势线。 (a)— (f)窗口Ratio_{r> 0.8}没有统一的变化趋势。 然而根据2.2节移动窗口相关系数成像分析可得, 子窗口(d)— (f)的淀粉可视化分布图与淀粉实际分布情况较为相符。 因此这里重点分析子窗口(d)— (f)下淀粉分布变化情况: 随着老化时间增加, 活力逐渐下降过程中, 三个子窗口中的Ratio_{r> 0.8}也在不断变化, 可能是淀粉在分解过程中直链淀粉增加与支链淀粉减少相互抵消所导致; 三个子窗口中淀粉含量分布总体上均呈下降趋势, 与种子活力下降成正相关关系。

图6

Fig.6

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	图6 胚乳Ratior> 0.8折线图 (a), (b), (c), (d), (e), (f)为窗口Fig.6 Line chart of endosperm Ratior> 0.8 (a), (b), (c), (d), (e), (f) is windows

2.3.2 种胚淀粉分布分析

与2.3.1节分析类似, 首先根据式(2)计算相关系数r> 0.8的像素点占种胚比Ratio_{r> 0.8}, 统计信息如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 种胚Ratior> 0.8统计信息表 Table 2 Statistical information of embryo Ratior> 0.8 老化 时间/h 窗口 1— 21 11— 31 21— 41 31— 51 41— 61 51— 71 0 3.95% 9.95% 0.95% 8.72% 9.26% 4.63% 18 0.83% 6.77% 3.8% 6.6% 6.11% 3.8% 36 0.53% 3.89% 2.0% 8.1% 6.31% 5.05% 54 4.57% 5.22% 3.43% 5.87% 5.38% 8.16% 72 14.19% 13.79% 2.14% 3.35% 4.55% 3.75%

表2 种胚Ratior> 0.8统计信息表 Table 2 Statistical information of embryo Ratior> 0.8

根据表2得到图7所示种胚Ratio_{r> 0.8}折线图。 种胚的Ratio_{r> 0.8}总体上小于胚乳的Ratio_{r> 0.8}, 这与淀粉实际分布情况相符。 种胚6个子窗口的Ratio_{r> 0.8}也没有统一的变化趋势。 选取与胚乳分析相同的子窗口(d)— (f)可得: 随着老化时间延长, 活力逐渐下降过程中, 三个子窗口中的Ratio_{r> 0.8}也在不断变化, 可能是淀粉在分解过程中直链淀粉增加与支链淀粉减少相互抵消所导致; (d)、 (e)子窗口中淀粉含量拟合曲线呈下降趋势, 与种子活力下降成正相关关系, 但(f)窗口例外, 尽管72 h的Ratio_{r> 0.8}小于0 h的Ratio_{r> 0.8}, 但拟合曲线整体呈上升趋势。

图7

Fig.7

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	图7 种胚Ratior> 0.8折线图 (a), (b), (c), (d), (e), (f)为窗口Fig.7 Line chart of embryo Ratior> 0.8 (a), (b), (c), (d), (e), (f) is windows

2.3.3 种子淀粉分布分析

图8所示为整粒种子相关系数> 0.8的像素点占整体比的折线图。 同样在(d)— (f)窗口, 可以得到和胚乳中淀粉分布相似结论, 即随着种子老化进程的加剧, Ratio_{r> 0.8}逐渐减小, 与拟合曲线变化趋势线一致, 与种子活力下降成正比关系。

图8

Fig.8

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	图8 种子Ratior> 0.8折线图 (a), (b), (c), (d), (e), (f)为窗口Fig.8 Line chart of seed Ratior> 0.8 (a), (b), (c), (d), (e), (f) is windows

综合2.3.1— 2.3.3节胚乳、 种胚以及整粒种子淀粉分布Ratio_{r> 0.8}可得: 表征淀粉变化的特征波段位于(d)— (f)窗口即29.83~67.36 cm^-1范围内, 与纯淀粉标样光谱特征吸收峰波段位置基本一致(50~60 cm^-1之间); 在该特征谱区窗口内, 胚乳和整粒种子的Ratio_{r> 0.8}振荡下降, 且拟合趋势线线斜率< 0, 表明淀粉含量随着活力下降在不断降低, 这与文献[16]中结论一致: 即玉米种子随着老化时间的延长直链淀粉含量增加, 支链淀粉含量下降, 总淀粉含量呈下降的趋势。