引用本文
张鹏, 杨一帆, 王辉, 涂宗财, 沙小梅, 胡月明. 食品体系中糖基化蛋白质结构的表征和检测方法综述[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(9): 2667-2673.
ZHANG Peng, YANG Yi-fan, WANG Hui, TU Zong-cai, SHA Xiao-mei, HU Yue-ming. A Review of Structural Characterization and Detection Methods of Glycated Proteins in Food Systems[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(9): 2667-2673.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)09-2667-07  
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食品体系中糖基化蛋白质结构的表征和检测方法综述
张鹏1,3, 杨一帆1, 王辉1, 涂宗财1,2, 沙小梅2, 胡月明1,*
1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室, 江西 南昌 330047
2.江西师范大学国家淡水鱼加工技术研发专业中心和江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心, 江西 南昌 330022
3.江西福美泰生物技术有限公司, 江西 九江 332100
*通讯作者 e-mail: huyueming@ncu.edu.cn

作者简介: 张 鹏, 1977年生, 江西福美泰生物技术有限公司硕士研究生 e-mail: lemon@foodchem.cn

收稿日期: 2022-05-07 修回日期: 2022-07-26 接受日期: 2022-07-26
基金: 国家自然科学基金项目(32101946), 江西省自然科学基金项目(20212BAB215037)资助
摘要

蛋白质和糖是食品的重要组分。 在食品加工、 贮运过程中, 蛋白质分子中的氨基与还原糖的羰基很容易以共价键的形式相结合发生糖基化反应。 美拉德式糖基化反应包括早期、 中期和末期三个阶段。 糖基化反应使得蛋白质分子主链或侧链发生修饰, 改变蛋白质结构、 静电荷和疏水性等, 影响蛋白质主链和侧链基团的化学活性, 进而改变蛋白质的理化功能性质, 如改善乳化性、 起泡性、 凝胶性等功能性质, 提高抗氧化性等营养特性, 降低致敏性, 增强抑菌性和贮藏特性等, 在食品加工、 贮运过程中非常普遍且有着重要意义。 糖基化反应过程中引起的蛋白质结构变化是其营养、 功能特性改变的重要原因。 近年来, 化学测定(自由氨基含量、 表面疏水性测定等)、 光谱(紫外、 荧光、 傅里叶变换红外光谱等)、 色谱(圆二、 分子排阻色谱等)、 质谱[基质辅助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、 液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS2)等]等多种技术手段被探索用于分析蛋白质糖基化反应过程中的结构变化规律, 在糖基化反应机制研究及糖基化反应程度、 产物营养功能性质调控等方面起了重要作用。 尤其是轨道离子阱质谱(LC-Orbitrap-MS2)、 傅里叶变换离子回旋共振质谱(LC-FTICR-MS2)、 氢氘交换-傅里叶变换离子回旋共振质谱(HDX-FTICR-MS2)等技术的出现和成熟应用让糖基化位点研究更加深入, 可以对各位点的糖分子连接数和糖基化取代程度进行定量分析, 使得揭示蛋白质糖基化反应机制变为可能。 对基于蛋白质糖基化反应程度、 一级、 二级、 三级结构和官能团结构的表征和检测方法进行综述, 旨在为蛋白质糖基化反应的深入研究和在食品加工中的应用提供参考。

关键词: 食品; 蛋白质; 糖基化; 结构; 表征; 检测方法
中图分类号:TS201.21 文献标志码:R
A Review of Structural Characterization and Detection Methods of Glycated Proteins in Food Systems
ZHANG Peng1,3, YANG Yi-fan1, WANG Hui1, TU Zong-cai1,2, SHA Xiao-mei2, HU Yue-ming1,*
1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China
2. National R&D Center for Freshwater Fish Processing and Engineering Research Center for Freshwater Fish High-Value Utilization of Jiangxi Province, Jingxi Normal University, Nanchang 330022, China
3. Foodmate Limited Company, Jiujiang 332100, China
*Corresponding author
Abstract

Proteins and sugars are important components of food. During food processing, storage and transportation, the amino group of protein molecules is easily combined with the carbonyl group of reducing sugar through covalent bonds, and the glycation reaction occurs. Maillard reaction-based glycation includes three stages: the early stage, the middle stage and the advanced stage. The glycation reaction modifies the main or side chains of proteins, changes the structure, static charge and hydrophobicity of proteins, and affects the chemical activities of the main and side chain groups of proteins, thus changing the physicochemical properties of proteins, including improving the emulsifying, foaming, gel and other functional properties, enhancing the antioxidant and other nutritional properties, while reducing the sensitization and enhancing the antibacterial and storage properties. It is very common and important in food processing, storage and transportation. The changes in protein structure during the reaction are the important causes of the alteration of nutritional and functional properties. In recent years, chemical analysis (free amino content and surface hydrophobicity determination, etc.), spectrometry (ultraviolet spectroscopy, fluorescence spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, etc.), chromatography (circular dichroism, size-exclusion high-performance liquid chromatography, etc.), mass spectrometry (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (LC-MS2), etc.) and other techniques have been explored to analyze the structural changing rules of protein during glycation reaction, playing the important roles in the mechanism study of glycation reaction as well as regulation of glycation degree and nutritional and functional properties of glycation products. In particular, the emergence and mature application of orbital ion trap mass spectrometry (LC-Orbitrap-MS2), Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FTICR-MS2), hydrogen-deuterium exchange Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (HDX-FTICR-MS2), and other technologies have made the research on glycation sites more in-depth. These technologies make it possible to reveal the mechanism of protein glycation reaction by quantifying the number of bonded sugar molecules and the degree of glycation substitution at each reaction site. This study reviewed characterization and detection methods for the protein glycation degree, primary, secondary and tertiary protein structures and functional group structure. This study aims to provide a reference for the deep research of protein glycation reaction and its application in food processing.

Keyword: Food; Protein; Glycation; Structure; Characterization; Detection methods
引言

蛋白质是人体的必需营养素之一, 可为人体提供大量氨基酸, 是生长发育和新陈代谢的必不可缺物质。 作为人类食品的重要组分, 蛋白质除了提供营养价值外, 其乳化、 起泡、 凝胶等功能特性在食品加工过程中也发挥着重要作用, 是各类美味食品的重要支撑。 然而, 一些食品蛋白质在营养、 功能特性等方面存在不足, 如抗氧化能力弱、 乳化性不强、 致敏性高、 凝胶性差等, 限制了其作为基料在食品加工中的应用[1, 2, 3]。

多种加工手段用于改善蛋白质的营养、 功能特性, 如物理法、 化学法、 生物酶法和基因工程法等。 其中, 化学法最为常用, 包括酸碱化、 酰化、 磷酸化、 去酰胺和糖基化处理等[4, 5, 6]。 糖基化处理由于其操作简单、 改性效果明显、 安全性高等优点得到越来越广泛的应用。 大量研究表明, 糖基化反应可以改善食品蛋白质的乳化、 起泡、 凝胶等功能性质, 提高抗氧化性、 消化性等营养特性, 同时降低致敏性, 增强抑菌性和贮藏特性等[4, 7, 8, 9]。

糖基化反应是指蛋白质分子中的氨基与还原糖(葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖等)的羰基以共价键的形式相结合的化学反应。 美拉德式糖基化反应包括早期、 中期和末期三个阶段[7]。 糖基化反应使得蛋白质主链或者侧链发生修饰, 改变蛋白质结构、 静电荷和疏水性等, 影响蛋白质主链和侧链基团的化学活性, 进而改变蛋白质的理化功能性质[10, 11]。 目前, 大量学者就糖基化反应对各类食品蛋白质理化功能性质的影响进行了广泛研究。 为进一步揭示糖基化反应诱导蛋白质精细分子结构的变化规律及调控蛋白质营养、 功能特性的机制, 需要综合运用多种不同维度的表征和检测方法进行精准分析。 本文对糖基化食品蛋白质结构的表征和分析方法进行综述, 以期为糖基化反应及调控蛋白质营养、 功能特性的机制的深入研究提供参考。

1 糖基化反应对蛋白质结构的影响

蛋白质是由多种不同氨基酸组成的生物大分子, 其结构复杂, 易受多种因素影响。 研究表明其空间结构可以分为四个连续不同的结构水平。 其中一级结构是由不同的氨基酸按照序列编码组成的线性多肽链。 二级结构是多肽链中的主链通过氢键作用弯曲折叠形成的局部空间构象, 主要形式为α -螺旋、 β -折叠、 β -转角和无规卷曲结构单元。 此外, 还有超二级结构单元, 即以上几种二级结构单元相互组合在一起[12]。 三级结构则是在二级结构的基础上进一步弯曲折叠形成的不同三维空间结构, 如球状、 纤维状和膜状, 其主要是由氨基酸侧链在疏水相互作用、 范德华力、 氢键和静电相互作用下连接形成[13]。 三级结构可以使蛋白质形成一些结构微区, 如疏水区域和酶活性中心区域等。 四级结构为多个具有三级结构的多肽链结合在一起形成的蛋白质结构, 其通过次级键进行连接, 展现复杂的空间构象[14]。 非酶糖基化反应过程中因受到多种因素的影响, 蛋白质的各水平结构会发生不同的变化, 同时导致其理化、 功能性质的改变。

当条件满足时, 氨基酸侧链的氨基会与还原糖上的羰基进行缩合反应, 引入糖分子, 使蛋白质的结构构成、 分子量和一级结构发生改变。 Liu等[15]在Co-60伽马射线(0~25 kGy, 0~50 h)下进行固态卵清蛋白-葡萄糖混合体系的糖基化反应, 研究发现蛋白质中自由氨基含量显著降低, 单体蛋白分子量增大, 表明卵清蛋白发生了糖基化反应, 其物质分子构成发生了改变。

糖基化反应过程中, 尤其是在热处理下, 蛋白质吸收大量热量, 蛋白质分子之间、 蛋白质与糖分子之间发生碰撞, 蛋白质发生聚合、 结构伸展等, 进而导致其空间结构(二级、 三级、 四级结构)发生改变。 Hu等[16]使用干热处理(60 ℃, 24 h)进行卵清蛋白-葡萄糖的糖基化反应, 研究发现卵清蛋白的α -螺旋和不规则卷曲含量显著增大, β -转角和β -折叠含量显著降低, 更多的色氨酸和赖氨酸等被暴露出来, 蛋白质的表面疏水性增强, 同时发生聚集反应, 表明糖基化反应会显著改变卵清蛋白的二级、 三级和四级结构。 然而, 当向反应体系中加入尿素(1~6 mol· L-1)时, 蛋白质表面覆盖一层尿素膜, 其二级、 三级和四级结构的变化被一定程度的抑制。 Wang等[17, 18]发现糖基化反应(55 ℃, 1 h)可以使β -乳球蛋白发生结构伸展和分子间聚集反应, 蛋白质的致敏性降低。 而当反应前进行超声波预处理时, 蛋白质的糖基化反应程度、 结构伸展和聚集程度被显著提高, 蛋白质的致敏性降低更为明显。 Xu等[19]对肌原纤维蛋白-葡聚糖混合溶液进行温和糖基化反应(37 ℃, 8 h), 研究发现糖基化修饰后肌原纤维蛋白的α -螺旋结构含量显著降低, 构象结构和微观结构发生改变, 从而导致其流变特性和溶解性发生改变, 其中, 所用葡聚糖分子量越低, 蛋白质结构变化越明显。

众多研究结果都表明蛋白质在发生糖基化反应后, 其结构会根据反应条件的不同发生复杂的变化。 因此, 需要通过多维技术手段来检测分析其结构变化规律, 以进一步了解完整的糖基化反应历程, 揭示反应机理。

2 糖基化蛋白质的结构表征
2.1 糖基化程度及一级结构检测分析

2.1.1 自由氨基含量测定

蛋白质中自由氨基含量是判断整体糖基化程度的一个重要指标, 相较于对照蛋白, 其含量下降的越多, 表明越多的自由氨基被糖分子占据。 最常用的自由氨基检测方法是邻苯二甲醛(OPA)法。 该法简便、 高效, 广泛应用于各种加工处理后蛋白质的自由氨基含量变化研究。 其原理是OPA中的醛基在碱性(pH 9.5)环境和强还原剂(巯基乙醇等)存在下与蛋白质中的氨基进行反应, 生成黄色化合物, 通过用分光光度计测定其吸光度值来计算自由氨基含量的变化[20]。 由于易受蛋白质聚集引起溶解度降低、 美拉德反应产生褐变等影响, 可能导致测量结果不准确, 可适当根据样品状况进行方法改进或设置对照组消除干扰。

Xu等[21]研究超声预处理对牛血清蛋白、 β -乳球蛋白和β -酪蛋白糖基化反应的影响, 采用OPA法检测发现超声波预处理可以使蛋白质的自由氨基含量增大, 然后再糖基化处理可以使自由氨基含量降低到更小值, 促进了蛋白质的糖基化反应。 Liao等[22]对卵清蛋白进行预热处理(20~60 ℃, 1 h)后再糖基化反应, 通过OPA法检测发现蛋白质预热后自由氨基含量增大, 表明预热处理可以使蛋白质结构发生伸展, 更多的自由氨基暴露出来, 而糖基化反应后自由氨基含量的降低程度更大, 表明更多的核糖共价结合到卵清蛋白的自由氨基上。 Hu等[16]向卵清蛋白样品中加入尿素发现其自由氨基含量降低, 然后再加入葡萄糖热处理, 其糖基化反应被抑制。 研究结果表明尿素通过与卵清蛋白的自由氨基竞争性结合从而抑制其与葡萄糖的糖基化反应。

2.1.2 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

由于SDS-PAGE可以将样品中的蛋白质组分根据分子量大小一一分开, 其广泛应用于分析各种加工处理下蛋白质的分子量变化情况[23]。 其机理是蛋白质和十二烷基硫酸钠(SDS)复合后其净电荷量的差异可以忽略不计, 此时蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移距离与蛋白质的分子量大小呈负相关。 糖基化反应后, 多个糖分子连接到蛋白质上, 使蛋白质的分子量增大。 此外, 糖基化反应中末期常常会引起蛋白质聚集, 其二倍体、 三倍体和多倍体聚合物也会清晰地呈现在电泳胶上。 因此, 通过SDS-PAGE可以直接观察蛋白质的糖基化反应情况。 SDS-PAGE的缺点是不能对糖基化反应程度进行定量。 此外, 一些大分子蛋白质与小分子糖结合或者糖基化程度较低时, 由于糖基化蛋白分子量增加有限, 通过电泳胶不能够清晰地判断糖基化反应情况, 需结合其他光谱、 质谱等精细化鉴定手段判断是否有糖基化反应发生及反应的程度[16]。

Hu等[24]对比微波和烘箱热处理对卵清蛋白-葡萄糖糖基化反应的影响, 通过SDS-PAGE分析发现单体蛋白的电泳条带随着处理时间的延长逐渐上移, 且微波处理下上移更为明显, 此外, 有大分子量蛋白条带(> 100 KDa)出现, 且微波处理下更为浓厚和稠密。 表明随着处理时间的延长, 蛋白质的糖基化反应程度逐渐加深, 且发生了蛋白质聚集反应, 而微波促进了蛋白质的糖基化反应。 Liu等[25]研究乳清蛋白分别与葡萄糖、 乳糖和麦芽糊精糖基化反应(pH 2.0, 90 ℃, 2~24 h)对乳液稳定性的影响, 通过SDS-PAGE分析发现其中α -乳白蛋白条带变淡, β -乳球蛋白的分子量从16.0 KDa增加到接近20 kDa, 最终形成的乳液其表面疏水性和贮藏稳定性显著增强。

2.1.3 质谱分析

近年来, 基质辅助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、 液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS2)等被用于探索用于蛋白质一级结构分析、 糖基化肽段鉴别、 糖基化位点定位和各位点修饰程度(DSP)定量, 为研究人员揭示蛋白质糖基化反应及其结构变化提供了强力支撑。 其中较常用的是液相色谱-质谱联用(LC-MS2)技术。 首先, 根据样品保留时间的不同, 液相色谱将消化后的多肽片段分离开来, 而后样品通过进样系统依次进入质谱分析系统进行一级、 二级质谱采集, 最后通过质谱图分析和数据库比对对各糖基化位点进行鉴定和分析[26]。 常用的串联质谱肽段碎裂模式包括碰撞诱导解离(CID)、 高能诱导解离(HCD)和电子转移解离(ETD)等[27]。 近年来轨道离子阱质谱(LC-Orbitrap-MS2)、 傅里叶变换离子回旋共振质谱(LC-FTICR-MS2)、 氢氘交换-傅里叶变换离子回旋共振质谱(HDX-FTICR-MS2)等技术的出现和成熟应用糖基化位点研究更加深入, 可以对各位点的糖分子连接数和糖基化取代程度进行定量分析, 使揭示蛋白质糖基化反应机制变得可能[28]。然而, 现阶段糖基化蛋白质质谱分析仍存在重复性不高等问题, 需进一步改进分析工具和方法。 近年来出现的ETD和HCD联用的质谱碎裂技术EThcD, 可以有效提高糖蛋白质组的鉴定通量、 覆盖深度和位点定位准确度[29, 30], 相信该技术在蛋白质糖基化反应机制的研究中也将获得更为广泛的应用。

Yang等[31]研究卵清蛋白与不同种类单糖(核糖、 半乳糖、 木糖、 葡萄糖、 果糖)的糖基化反应(37 ℃, 75%湿度, 8 d)机理, 通过LC-HRMS分析得到其糖基化位点数分别为15, 17, 15, 11和12, 主要发生在赖氨酸和精氨酸上, 其中醛糖的糖基化程度最高, Lys207为最活跃位点, 其平均DSP值最高。 Liu等[32]研究糖基化、 磷酸化和乙酰化反应对α -乳白蛋白致敏性的影响, 通过LC-HRMS分析得到其糖基化位点为K13、 K16、 K94、 K98、 K108, 磷酸化位点为Y18、 S22、 Y103、 S112, 乙酰化位点为K13、 T33、 S34、 T38、 S47、 K62、 S69、 S70、 K108、 K114。 研究表明, 通过对这些位点的修饰, 屏蔽了蛋白质部分致敏性线性表位, 从而使α -乳白蛋白的致敏性显著降低。 Liao等[22]研究预热处理结合糖基化反应对卵清蛋白IgG/IgE结合能力的影响, 通过LC-HRMS分析发现预热处理(20~60 ℃, 1 h)可以使卵清蛋白的结构伸展、 糖基化位点微环境改变, 从而导致新的糖基化位点(K229和 K323)出现, DSP值升高, 使一些糖基化位点(K227)由原来的仅结合1个核糖分子变为可以结合2个核糖分子, 最终导致蛋白质IgG/IgE结合能力下降程度更高。

2.2 二级结构检测分析

2.2.1 圆二色谱

圆二色谱法是最为广泛蛋白质二级结构分析方法, 其原理是蛋白质具有圆二色性, 即对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光有着不同的吸收系数, 二者之间会形成差值。 以吸收波长为横坐标, 以吸收系数差值为纵坐标即可形成圆二色谱图。 同时, 蛋白质的二级结构单元α -螺旋、 β -折叠、 β -转角和无规卷曲在远紫外区域有结构特征峰, 利用远紫外圆二色谱图可对其二级结构组成进行检测, 计算出二级结构含量的变化[33]。 圆二色谱法分析蛋白质二级结构的缺点是只能够对蛋白溶液进行检测, 对不溶解或溶解性差的蛋白无法准确检测。

Hu等[34]研究卵清蛋白-菊粉的糖基化反应(60 ℃, 79%湿度, 2~10 d)及对石榴籽油乳液的理化稳定性和氧化稳定性的影响。 圆二色谱分析得到糖基化反应使卵清蛋白的β -折叠含量显著增大, α -螺旋、 β -转角和无规卷曲含量降低, 其诱因是糖基化反应引起蛋白质分子间氢键结合产生大量β -折叠结构。 最终研究结果表明糖基化卵清蛋白作为乳化剂可以显著改善石榴籽油乳液的物理稳定性和贮藏稳定性。 Shao等[35]研究超声预处理(60~150 W· cm-2, 15 min)对β -乳球蛋白-半乳糖糖基化反应(55 ℃, 65%湿度, 4 h)及蛋白质致敏性的影响。 圆二色谱分析得到糖基化反应使β -乳球蛋白的α -螺旋和β -折叠含量显著增大, β -转角和无规卷曲含量降低。 二级结构的改变破坏了蛋白质的部分过敏性构象表位, 使致敏性降低, 而超声预处理使α -螺旋含量进一步增大, 无规卷曲含量进一步降低, 导致致敏性进一步降低。

大量研究结果表明, 糖基化反应倾向于使蛋白质的二级结构从不规则(β -转角和无规卷曲)向着规则(α -螺旋和β -折叠)转变, 尤其是显著增加β -折叠结构。

2.2.2 红外光谱

红外光谱法蛋白质二级结构检测中有着广泛的应用, 其原理是根据蛋白质二级结构单元中化学键的伸缩振动和弯曲振动分析测定。 其中酰胺Ⅰ 带(1 700~1 600 cm-1)可以反映α -螺旋、 β -折叠、 β -转角和无规卷曲结构单元的变化, 吸收峰范围分别为1 660~1 650、 1 640~1 610、 1 700~1 660和1 650~1 640 cm-1[36]。 通过PeakFit软件进行二阶导数图谱导出、 去卷积、 数学拟合等可以分析计算蛋白质二级结构的变化[37]。 红外光谱法既可以对蛋白溶液进行检测, 又可以将固体蛋白粉末进行分析。

Wang等[38]研究蛋清蛋白-异麦芽寡糖糖基化产物热凝胶的分子力和凝胶特性。 通过傅里叶红外光谱对蛋白质二级结构进行分析, 研究结果表明糖基化反应后蛋白质的分子内/分子间β -折叠结构含量增多, 而310-螺旋结构含量减少, 最终导致凝胶中氢键和疏水相互作用等非共价键增多, 二硫键减少, 凝胶断裂强度和持水性增强。 任孟珂等[36]研究大豆分离蛋白-葡聚糖(2:1)糖基化反应(60 ℃, 1~7 d)对蛋白质结构和功能性质的影响, 傅里叶红外光谱检测发现糖基化反应后大豆分离蛋白的β -折叠和无规则结构含量升高, α -螺旋和β -转角含量降低, 结合其他分析表明糖链的引入使蛋白质肽链展开, 部分内部基团暴露出来, 蛋白质的空间构象发生改变, 逐渐由有序转变为无序, 蛋白质分子发生伸展, 柔韧性增强, 构象稳定性下降, 进而改善了大豆分离蛋白的功能特性。 反应3 d后, 大豆分离蛋白的乳化性和乳化稳定性分别提高了117.53%和134.20%, 反应4 d后, 溶解度提高了72.72%。

2.3 三级结构检测分析

2.3.1 紫外吸收光谱

紫外光谱对蛋白质结构分析主要源于蛋白质中的发色基团。 组成蛋白质的芳香族氨基酸色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)含有共轭双键, 能够吸收紫外光, 其峰在280 nm附近, 通过检测分析反应前后蛋白质紫外吸收峰的位置和强度变化可以推测糖基化反应对蛋白质三级结构的影响[39]。

Zhao等[40]研究蛋白质预热处理(98 ℃, 3~60 min)对牛血清蛋白、 β -乳球蛋白、 β -酪蛋白糖基化(90 ℃)反应的调控影响。 紫外吸收光谱检测表明预热处理可以同时诱导蛋白质的结构伸展和聚集反应, 结合其他检测发现当预热时间较短时(10 min), 蛋白质结构伸展导致更多位点暴露, 对糖基化反应具有促进作用。 然而, 当预热时间较长时(40~60 min), 由于大量的聚集反应掩蔽了一些糖基化位点, 从而抑制了蛋白质的糖基化反应。 Yang等[41]研究超声预处理(200~600 W, 30 min)结合干热糖基化对β -乳球蛋白IgG和IgE结合能力的影响, 紫外吸收光谱检测发现蛋白质糖基化反应后最大紫外吸收峰值显著升高, 表明改变了蛋白的三级结构, 引发了蛋白结构的伸展, 超声预处理既可以促进糖基化反应, 还可以一定程度地破坏部分蛋白质过敏性构象表位。

2.3.2 内源荧光光谱

内源荧光光谱是依据蛋白质中色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的光学性质进行检测分析。 这些芳香族氨基酸残基在一定波长的激发光激发下会产生荧光, 即为内源荧光, 峰值在347 nm附近。 内源荧光与氨基酸所处环境及其极性有密切联系, 依据内源荧光光谱的峰位置和强度变化可以判断蛋白质分子三级结构的变化[42, 43]。

Wang等[26]研究真空冷冻干燥(-50 ℃, 50 mTorr, 6~48 h)诱导卵清蛋白-核糖(1:1)的糖基化反应, 内源荧光光谱分析表明随着真空冷冻干燥时间延长, 蛋白质构象结构的伸展程度逐渐增大, 更多的色氨酸、 酪氨酸暴露于溶剂环境并引发荧光猝灭。 Zhang等[44]研究异槲皮素(12.20~36.59 μ mol· L-1)对卵清蛋白-果糖(1:1)糖基化反应(55 ℃, 16 h)的影响, 采用内源荧光光谱法测定蛋白质的构象变化, 研究结果表明异槲皮素可以抑制糖基化反应、 蛋白质构象结构伸展以及糖基化反应末期产物(AGEs)的生成, 在12.20~24.39 μ mol· L-1范围内, 其抑制效果随着异槲皮素浓度的升高而增强。

2.3.3 表面疏水性测定

蛋白质表面疏水性测定通常采用ANS荧光探针法, 其机理是ANS荧光探针中带负电荷的磺酸基可与蛋白质带正电荷的氨基酸(赖氨酸等)结合, 荧光强度随着溶剂极性的变化而改变。 通过测量荧光强度可计算和表征蛋白质的表面疏水性(H0)和极性的变化, 从而推测糖基化反应对蛋白质结构的影响[45]。 蛋白质的表面疏水性与其溶解性、 乳化性、 起泡性等功能性质存在密切的联系。

Xi等[46]研究不同pH(2~10)条件下, 乳清分离蛋白与不同还原糖(葡萄糖、 乳糖、 葡聚糖)的糖基化反应(70 ℃, 3 h)对蛋白质结构和乳化性质的影响。 ANS荧光探针法检测发现在pH 2~4范围内进行糖基化反应, 其产物的疏水性显著大于在pH 6~10范围内。 除pH值外, 其表面疏水性还与参与反应的糖种类和糖基化反应程度密切相关。 Wang等[47]研究乳清蛋白-桑葚多糖(1:1)的糖基化反应(60 ℃, 79%湿度, 48, 72 h)对蛋白质功能性质和抗氧化活性的影响, 表面疏水性检测表明糖基化反应可以显著降低乳清蛋白的疏水性能, 而乳化性和乳化稳定性分别提高为处理前的1.40和1.52倍, 抗氧化能力也显著增强。 此外, 其包埋鱼油形成的乳液具有更小的液滴直径、 更佳的贮藏稳定性和氧化稳定性。

2.4 官能团结构检测分析

傅里叶变换红外光谱除了可以检测蛋白质的二级结构外, 还可以分析糖基化蛋白质中化学键的振动和生成情况, 从而推断蛋白质官能团结构和糖基化反应各阶段产物的变化规律[48]。 其检测机理来源于蛋白质的红外光谱中有许多特征吸收峰, 蛋白质官能团的变化会引起相应特征吸收峰的变化。 一些特征峰如下: 1 650 cm-1由C=O伸缩振动引起; 1 550 cm-1由C— N伸缩振动引起; 1 400~1 200 cm-1由N— H弯曲振动产生; 宽峰3 500~3 200 cm-1表示羟基中O— H的伸缩振动或酰胺中N— H的伸缩振动[49]; 2 962 cm-1表示C— H的伸缩振动; 2 926 cm-1表示饱和— CH2— 的不对称振动; 1 560~1 534 cm-1表示C— N的伸缩振动和— NH的弯曲振动; 1 180~953 cm-1表示C— C和C— O的伸缩振动以及C— H的弯曲振动[50, 51, 52]。

任孟珂等[36]研究大豆分离蛋白-葡聚糖的干热糖基化反应(50~60 ℃, 1~7 d)对蛋白质功能性质和结构的影响, 傅里叶变换红外光谱检测发现与未处理大豆分离蛋白相比, 糖基化蛋白在3 700~3 200 cm-1范围内吸收峰变宽, 表明大豆分离蛋白与葡聚糖共价结合之后, 共轭物的羟基数量增多, 引起更多C— OH的伸缩振动。 糖基化蛋白在1 260~1 000和1 500~1 350 cm-1范围内吸收峰的强度增大, 表明糖基化反应增强了产物中C— N、 C— H和C=O的伸缩振动, 有更多的键生成。

有报道采用傅里叶变换红外光谱和圆二色谱研究人血清蛋白-葡萄糖(1:1)体系的糖基化反应(50 ℃, 20~380 min)进程和产物结构变化。 当反应60 min时, 3 300~3 100 cm-1范围内吸收峰增强, 峰宽变大, 表明O— H伸缩振动和游离N— H伸缩振动增强, 这与葡萄糖和游离氨基酸胺基反应形成席夫碱有关。 当反应时间在100~140 min范围, 585 cm-1处的不饱和键振动峰蓝移至613 cm-1, 表明糖基化反应生成了新的不饱和键, 其来源于Amadori产物(不饱和烯醇式糖胺), 即美拉德反应初期产物; 当到达140 min时, 3 300~3 100 cm-1峰强度和和峰宽都达到最大, 即糖基化反应完全, 进入美拉德反应中期, 此时N— H基团增多, 席夫碱形成糖胺。 在随后的反应中峰强度相应减弱, 表明进入美拉德反应中后期; 酰胺Ⅰ 区1 660 cm-1处峰随着糖基化反应时间的延长先增大后减小再增大, 表明周围的基团聚合数量先增多后减少再增多。 随着热处理时间的延长, 初期阶段氨基与羟基发生脱水缩合, 经分子重排生成果糖胺, 其酰胺吸收峰增强, 当反应到140 min时, 峰值最大, 糖基化程度最大, 糖胺含量最多。 当反应到220 min时, 吸收峰值减小, 到达美拉德反应中期, 糖胺烯醇化生成醛酮类物质。 当反应到260 min时, 酰胺吸收带峰强度又开始增大, 进入美拉德反应末期, 蛋白质氨基酸与羰基化合物发生脱羧和脱氨反应。

2.5 其他结构检测分析技术

其他检测技术可以作为补充手段对蛋白质的结构变化进行研究。 如采用分子排阻色谱(SEC)对反应前后蛋白质的体积分布进行研究; 采用环境扫描电镜(SEM)、 激光共聚焦显微镜(CLSM)和荧光显微镜对糖基化反应前后蛋白质的微观结构变化进行观察; 采用差示扫描量热法(DSC)对糖基化蛋白质热稳定性和结构稳定性变化进行检测, 间接分析蛋白质结构的变化。

3 总结与展望

蛋白质的结构复杂多样, 在糖基化反应过程中受到内外诸多因素的影响, 其结构会发生不同的变化。 研究人员应充分了解相关技术手段的原理, 根据蛋白质样品特性和研究目的选择不同的检测分析方法, 从多结构层次进行全面分析, 准确掌握反应过程中蛋白质分子结构的转变过程, 探索基于糖基化反应的蛋白质改性机理。 此外, 一些新的技术手段仍需要探索研究蛋白质的特定分子结构, 如同分异构体等的变化。

随着人们对健康饮食的重视以及对糖基化反应研究的深入, 调控蛋白质糖基化反应进程、 抑制有害AGEs的生成已成为国内外重点攻关的关键科学问题和技术问题。 添加化学抑制剂、 选择特定的加工方法等近年来被用于降低糖基化反应位点数和各位点糖基化反应程度, 从而抑制糖基化反应和AGEs的生成, 其作用机理是位点竞争和抑制蛋白质结构伸展等[16, 44]。 这些技术方法在市场化推广应用方面仍然存在一定的局限性, 如影响食品风味、 成本高等, 新的经济实用的技术方法和手段仍需探索。 此外, 糖基化反应过程中蛋白质精细分子结构的转变与AGEs生成的联系需要深入研究。

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