引用本文
吴姗, 张明哲, 虞惠贞, 陈哲, 尹文秀, 张荃, 沈旭芳, 孙超, 裘慧, 帅江冰, 张晓峰. 基于近红外光谱的象牙鉴定[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(8): 2397-2406.
WU Shan, ZHANG Ming-zhe, YU Hui-zhen, CHEN Zhe, YIN Wen-xiu, ZHANG Quan, SHEN Xu-fang, SUN Chao, QIU Hui, SHUAI Jiang-bing, ZHANG Xiao-feng. Ivory Identification Based on Near Infrared Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(8): 2397-2406.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)08-2397-10  
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基于近红外光谱的象牙鉴定
吴姗, 张明哲, 虞惠贞, 陈哲, 尹文秀, 张荃, 沈旭芳, 孙超, 裘慧, 帅江冰, 张晓峰*
杭州海关技术中心, 浙江 杭州 310016
*通讯作者 e-mail: breezeyh@hotmail.com

作者简介: 吴 姗, 女, 1976年生, 杭州海关技术中心研究员 e-mail: 444638703@qq.com

收稿日期: 2022-04-16 修回日期: 2022-07-28 接受日期: 2022-07-28
基金: 海关总署科研项目(2020HK157, 2022HK124), 浙江省重点研发计划项目(2018C02041), 国家重点研发计划课题(2017YFF0210304)资助
摘要

中国已经全面禁止了象牙交易, 但象牙的走私并未因此而终止。 对象牙及其制品的鉴定是打击走私一个重要环节。 传统的形态学鉴定法, 是基于横截面上施氏结构的有无, 但有的象牙本身缺少特征纹路, 有的则经过雕刻加工后纹路消失, 这类样品往往无法鉴定。 从分子生物学角度鉴定象牙具有更高准确性, 象牙DNA含量极低, 象牙中提取DNA的难度较大。 已有学者采用光谱技术鉴定和区分象牙等材质, 并表明采用拉曼光谱和近红外光谱的短波区域可以区分象牙及其类似物(其他动物牙齿)。 采用近红外光谱的长波波段1 000~1 800 nm, 通过建模的方式建立了象牙的鉴别方法。 以非洲象( Loxodonta spp.)象牙、 亚洲象( Elephas maximus)象牙、 猛犸象( Mammuthus spp.)象牙为校正样品集, 其他非象牙材质制品, 包括抹香鲸( Physeter macrocephalus)牙、 河马( Hippopotamus amphibius)牙, 象牙果( Phytelephas macrocarpa), 模仿成象牙的塑料制品等为验证样品集, 采集了230件样品共383条近红外光谱信息。 比较了象牙样品颜色和厚度等对光谱鉴定结果的影响, 建议扫描具有该物质典型颜色部位, 同时取样品厚度大于1 mm的部位进行扫描, 否则易造成误判。 基于象牙光谱4个较敏感波段, 1 160~1 200、 1 430~1 500、 1 680~1 710和1 720~1 750 nm, 以及SIMCA(soft independent modeling by class analogy)定性分析方法, 建立象牙的鉴别模型。 建模过程中, 在平衡假阳性率和假阴性率后, 推导出本模型的最佳主因子值为2和 F值为0.21。 采用所建立的模型鉴定样品, 对象牙的识别准确率达到100%, 对角制品、 塑料仿制品以及象牙果仿制品等伪品的识别率也达100%, 但对质地较相近的其他动物的牙齿, 如野猪牙、 抹香鲸牙等, 则易错鉴为象牙, 需要结合其他方法做进一步的鉴定。 光谱模型鉴定方法具有无损、 简便等特点, 同时通过模型鉴别光谱图形较人为观察更加客观和高效, 因此较适合作为监管部门现场执法用的快速查验初筛方法。

关键词: 近红外光谱; 模型建立; 象牙鉴定
中图分类号:O433.4 文献标志码:A
Ivory Identification Based on Near Infrared Spectroscopy
WU Shan, ZHANG Ming-zhe, YU Hui-zhen, CHEN Zhe, YIN Wen-xiu, ZHANG Quan, SHEN Xu-fang, SUN Chao, QIU Hui, SHUAI Jiang-bing, ZHANG Xiao-feng*
Technical Center of Hangzhou Customs, Hangzhou 310016, China
*Corresponding author
Abstract

The trade of elephant ivory (from now on referred to as ivory) and its products has been completely banned in China, but the smuggling has not stopped. The identification of ivory is an important part of the fight against smuggling. The ivory objects can be identified visually if characteristic features, such as the Schreger pattern, on the cross-sections can be observed. However, if it does not have the features or disappears after carving, the sample is difficult to identify by morphology. When the morphological method is not adequate, molecular biology-based method is an alternative. However, since the extremely low DNA content, extracting DNA from ivory is not easy. Some scholars have distinguished ivory and the analogues (teeth of other animals) by using the Raman spectrum and the short wave region(780~1 100 nm)of the near-infrared (NIR) spectrum. In this study, an identification method of ivory was established by establishing a NIR spectroscopy identification model, based on the spectrum region from 1 000 to 1 800 nm. Taking African elephant ( Loxodonta spp.) ivory, Asian elephant ( Elephas maximus) ivory and mammoth ( Mammuthus spp.) ivory as the calibration set and other non-ivory products, including sperm whale ( Physeter macrocephalus) teeth, hippopotamus ( Hippopotamus amphibius) teeth, taguanut ( phyelephas macrocarpa), ivory plastic imitation, etc. as the verification set, a total of 383 NIR spectra of 230 samples were collected. By comparing the spectral data of ivory products with different colors and thicknesses, it was found that the color and thickness of the ivory will affect the analysis results. Scanning the parts with typical color of the substance and the parts with the thickness greater than 1 mm is recommended. Based on the spectra in the regions of 1 160~1 200, 1 430~1 500, 1 680~1 710 and 1 720~1 750 nm, and the SIMCA (soft independent modeling by class analogy) qualitative analysis method, a calibration model for predicting ivory or non-ivory by NIR spectroscopy was developed. After balancing the false positive rate and false negative rate, it was deduced that the best principal factor of this model was 2 and the F value was 0.21. When applying the model, the recognition accuracy of ivory was 100%; all the animal horn, plastic and ivory fruit products could be accurately identified as non-ivory with 100% accuracy. However, the teeth of other animals with similar ivory textures, such as boar teeth and sperm whale teeth, tended to be mistaken for ivory by the model; consequently, further testing by other methods was required for these substances. The spectral model method is simple, nondestructive, and more objective and efficient than manual interpretation of spectrograms. Therefore, it is suitable to be used as a preliminary screening method for on-site law enforcement by regulators.

Keyword: Near infrared spectroscopy; Modeling; Ivory identification

象牙(Ivory), 狭义为雄性的亚洲象(Elephas maximus)、 非洲象(包括非洲深林象(Loxodonta cyclotis)和非洲草原象(Loxodonta africana))、 猛犸象(Mammuthus spp.)的獠牙, 广义包括河马(Hippopotamus amphibius)、 野猪(Sus scrofa)、 海象(Odobenus rosmarus)、 抹香鲸(Physeter macrocephalus)等动物的獠牙或牙齿。 人们为了获取象牙, 大量猎杀大象, 导致种群受到威胁。 据统计[1], 2007年至2015年, 大约有10万头非洲象因象牙贸易消失了。 大象已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)的物种, 其贸易严格受到限制。 自2018年1月1日起, 中国全面禁止了象牙交易。 但非法交易却未因此而停止, 近几年象牙走私的大案也时有发生, 如中国海关官网上显示: 2018年3月, 厦门海关查获一起旅客违规携带象牙入境案, 在行李箱拉杆、 红酒包装盒等部位查获447件共计1.51 kg象牙制品。 因此, 为了打击象牙走私, 有必要建立一套快速有效的象牙真伪鉴别方法。

象牙及其制品的鉴定, 一般都以形态学特征为主要鉴定依据。 1800年Bernhard Gottlob Schrege发现象牙的横截面上有微管所呈现的线条状影像, 称之为“ 施氏线(Schrege line)” , 施氏线向不同方向辐射所形成的夹角, 叫“ 施氏角(Schrege angles)” , 此结构称为施氏结构(Schrege pattern), 是识别象牙的主要依据[2]。 更多研究[3]发现象牙外缘施氏角的平均值小于100° , 可以认定为猛犸象牙, 外缘施氏角的平均值大于115° , 则可认为是现代象牙。 但施氏结构并不一定存在整个象牙的横截面上, 往往只存在于完整象牙截面的外周, 特别是到了牙心部位, 施氏结构往往完全消失; 而用来判断猛犸象牙和现代象牙的施氏角, 也仅指完整象牙横截面的外缘施氏角。 若不具有完整的象牙横截面结构, 仅从上述特征, 较难判断是否为象牙, 更难判断是否是现代象象牙。

随着分子生物学的技术被应用于野生动物保护领域, 该技术也被用于象的相关研究。 Wasser等[4]对28个地区非洲草原象和非洲森林象的16个微卫星位点进行了研究, 估计了整个非洲象分布区的地区特有的等位基因频率, 并以此对非洲象进行溯源。 Wasser等[5]又对查获的象牙进行微卫星分析, 并将分析结果与过去几年收集的大象组织及数据库中的DNA序列进行了比对。 除了采用微卫星片段分析外, Comstock等[6]和Wasser等[7]还采用了动物线粒体中的12S rRNA(12S ribosomal RNA)基因 、 Cyt b(Cytochrome b)基因和COI(Cytochrome oxidase subunit I)基因进行鉴定。 Lee等[8]通过槽式PCR的方法对严重降解的象牙DNA样本进行扩增, 该方法对鉴定象牙的成功率为84.3%, 鉴定结果显示453份象牙中, 97.9%为非洲象。 Suwanchatree等[9]也利用了短序列扩增的槽式PCR方法, 鉴定了DNA严重降解的象牙制品。 Wozney等[10]设计了荧光PCR鉴定猛犸象、 非洲象和亚洲象的特异性引物探针, 建立了荧光PCR的鉴定方法。 但象牙中提取DNA的确是个艰难的工程, 因此分子鉴定方法虽然精确度高, 也相对容易操作, 但这都要基于能够获得足够量的DNA的基础上, 因此该方法必须攻克从象牙中抽提DNA的难题。 而象牙, 且不论是地下埋藏了上万年猛犸象牙, 即便是现代象象牙其钙化、 石化的程度也已经非常高, DNA含量极低, 因此提取DNA存在很高的难度。

作为一种有机珠宝, 我国有根据象牙物理特性的鉴定方法, 如《珠宝玉石鉴定GB/T 16553— 2017》[11]中通过测定其摩氏硬度、 密度、 折射率等的方法, 但以上物理指标, 并非象牙特有, 因此很少仅根据以上指标对象牙进行真伪判定。 许多研究也表明, 用光谱法鉴别象牙具有一定的可行性。 如有学者根据紫外荧光反应的颜色成功区分了象牙和人工合成材料或其他相似物。 但随着伪造手段的发展, 在合成材料中添加某些无机物、 酪蛋白、 骨粉等可伪造出荧光效果, 因此该方法较适合初筛。 吴晓等[12]比较了红外光谱和荧光光谱法鉴定现代象象牙和猛犸象象牙的方法, 认为: 猛犸象牙内部由于受石化作用小其红外光谱与象牙没有本质区别; 荧光光谱在280 nm波长光的激发下, 象牙的发射光谱峰值在307 nm处, 猛犸象牙的发射光谱峰值在315 nm处, 且象牙的荧光强度高于猛犸象牙。 有研究通过红外光谱检测发现, 与水分子有关的3 319、 1 642和1 557 cm-1吸收峰在象牙中较明显, 猛犸象牙中较微弱, 而X射线粉晶衍射结果表明猛犸象牙的衍射峰比象牙的分裂更为明显, 更尖锐。 许彦等[13]的研究也表明, X射线粉晶衍射图谱上象牙和猛犸象牙与准羟基磷灰石的图谱基本一致, 但猛犸象牙衍射峰比象牙的峰更加尖锐、 强烈。 国外也有采用光谱学进行象牙鉴定的报告。 Edwards等[14]采用傅里叶变换拉曼光谱(Fourier-transform Raman spectroscopy)检测了6种哺乳动物的牙齿后, 发现可以采用特征光谱, 将象牙从抹香鲸牙、 海象牙、 疣猪(Phacochoerus spp.)牙、 独角鲸(Monodon monoceros)牙、 河马牙和野猪(Sus scrofa)牙等6种动物牙齿中区分出来。 Edwards等[15]采用近红外激发的拉曼光谱, 比较了不同年代的猛犸象象牙标本和现代亚洲和非洲象象牙的光谱差异, 通过有机胶原蛋白对应谱带的差异, 显示了不同象牙蛋白质结构生物退化的差异。 Shimoyama等[16]采用傅里叶变换拉曼光谱仪, 但同时通过主成分分析法(principal component analysis, PCA), 成功区分和鉴定了包括两个亚种的非洲象象牙、 猛犸象象牙、 河马牙和抹香鲸牙在内的5种动物牙齿。 Shimoyama等[17]又采用近红外光谱(波长为780~2 526 nm或波数为3 959~12 820 cm-1光谱区)的短波(780~1 100 nm)区域, 区分了两个亚种的非洲象象牙、 猛犸象象牙、 河马牙和抹香鲸牙。

本研究旨在进一步采用近红外光谱的长波区域(1 100~2 526 nm, 3 959~9 090 cm-1), 开展象牙无损鉴定方法的研究, 探讨建立无损鉴别现代象牙、 猛犸象牙及象牙的类似物(其他动物的牙齿、 骨骼等)和象牙人工仿品(塑料制品等)等的方法, 以期作为目前较常用的基于施氏结构的形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法的补充。

1 实验部分
1.1 材料

实验材料包括收集的非洲象牙、 亚洲象牙、 猛犸象牙的原牙及制品, 以及各种象牙的类似物: 野猪牙、 抹香鲸牙、 独角鲸牙等, 还包括各种仿象牙的塑料制品和象牙果制品等(详见表1和表2)。

表1 建立模型所使用的样品及鉴定结果 Table 1 Samples for establishing the model and identification results
表2 疑似象牙制品的鉴定结果 Table 2 Identification results of suspected ivory products
1.2 光谱扫描

采用光谱扫描范围1 000~1 800 nm(5 555~10 000 cm-1), 分辨率11 nm, 扫描次数30的近红外光谱仪EXPEC 1350(杭州谱育科技发展有限公司, 中国)进行基础光谱采集。 采用近红外漫反射的方式扫描并采集光谱, 每份样品扫描2次, 求平均值作为样品近红外光谱的原始光谱。 依次对每个样品采用相同的方法进行扫描并得到平均值。 对采集得到的异常光谱样本进行识别和删除, 如光谱特征和同性质物质差异显著的光谱和吸光度超过1.5的光谱等直接删除。

根据已知样品的性质, 将检测得到的象牙光谱, 包括现代象象牙(包括非洲象象牙和亚洲象象牙)的光谱、 猛犸象象牙的光谱划分为校正集, 将非象牙的光谱划分为验证集。

1.3 光谱预处理

采用仪器自带的软件(RIMP Client)对上述校正集和验证集光谱进行预处理, 包括标准正态变量变换(standard normal variate transformation, SNV), 去趋势校正(detrend, DT), Savitzky-Golay平滑, Savitzky-Golay导数和均值中心化等。 通过预处理达到对噪声、 背景的吸收, 同时降低和消除光散射等干扰信息。

1.4 象牙预测模型建立

对预处理后的漫反射光谱提取特征波段, 即将图谱[见图1(a)]中起峰的4个波段设置为象牙鉴别的特征谱段, 分别为1 160~1 200、 1 430~1 500、 1 680~1 710、 1 720~1 750 nm。 应用筛选出来的特征波长, 采用SIMCA(soft independent modeling by class analogy)定性分析方法建立鉴别模型, 推导得出最佳主因子值和F值。

图1 光谱图和模型统计图表
(a)— (b): 2个米黄色象牙和2个呈暗灰黑色象牙的原始光谱图(a)和导数光谱(b); (c)— (d): 2个蓝黑色猛犸象牙外皮和2个米黄色猛犸象牙的原始光谱图(c)和导数光谱图(d); (e)— (f): 不同厚度的象牙制品的原始光谱图(e)和导数光谱图(f); (g)— (h): SIMCA建模过程中定性分析校正集光谱(包括现代象牙和猛犸象牙)时发现的异常光谱Fig.1 Spectrogram and model statistic
(a)— (b): Original (a) and derivative (b) spectra of 2 beige ivories and 2 dark gray-black ivories; (c)— (d): Original (c) and derivative (d) spectra of 2 blue-black mammoth ivories and 2 beige mammoth ivories; (e)— (f): Original (e) and derivative (f) spectra of ivory products of different thickness; (g)— (h): Abnormal spectra found during qualitative analysis of calibration set spectra (including elephant ivory and mammoth ivory) during SIMCA modeling

1.5 象牙的形态学和分子生物学鉴定方法

形态学鉴定和分子生物学鉴定的方法参考海关总署文件《象牙及象牙制品鉴定方法(试行)》署科发〔2019〕75号, 并结合实际情况, 稍加改变。

1.5.1 形态学方法

(1)针刺试验: 象牙及象牙制品, 热针用力无法扎进, 仅留针尖扎痕, 不会出现凹陷针眼、 无白烟和浓烈气味。 人工仿品, 热针扎入后可能产生明显的凹陷针眼, 同时伴有白烟及刺鼻气味。

(2)横截面: 象牙及其制品的横截面上具有独有的施氏结构(在象牙横截面可见自中心向外缘辐射、 规则排列的沿顺时针和逆时针方向延伸的弧线或近斜线构成的网状或尖角状纹理); 纵剖面: 象牙及象牙制品的纵剖面有较规则排列的、 断续的近直线型纹理, 或起伏的波纹、 山峰状纹理。

1.5.2 分子生物学方法

(1)样品处理和DNA提取: 取象牙样品碎屑约200 mg, 用1 mL 0.5 mol· L-1 EDTA溶液(pH 8.0), 37 ℃孵育72 h, 12 000 g离心2 min, 得到的沉淀用QIAamp(美国)51304抽提试剂盒提取DNA。

(2)巢式PCR检测方法: 采用巢式PCR法进行检测。 第一轮扩增引物为: Cytb F: TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGG; Cytb R1: GGACACCTCCTAGT TTGTTTGGT, 扩增产物为472 bp; 第二轮扩增引物为: Cytb F: TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGG; Cytb R2: TACAGATCGTAGAATGGCGTAAG, 扩增产物为450 bp。 PCR反应体系(25 μ L)如下: 2× PCR Master Mix, 12.5 μ L, 上下游浓度为5 μ mol· L-1的引物各1 μ L, 样品DNA 5 μ L, 补水至反应体系达到25 μ L。 第二轮PCR扩增所用的DNA模板为第一轮PCR的产物用灭菌去离子水进行10倍稀释, 稀释后的扩增产物2 μ L为DNA模板, 进行巢式第二轮扩增。 两轮PCR反应程序相同: 第一步95 ℃, 10 min, 一个循环; 第二步95 ℃, 30 s, 55 ℃, 30 s, 72 ℃, 60 s, 35个循环; 第三步72 ℃, 7 min, 一个循环。

(3)序列分析: 对扩增的产物进行测序, 测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。 测序得到的序列和NCBI上的参考序列(非洲象靶标基因Cytochrome b, KY616979.1, 472 bp; 亚洲象靶标基因Cytochrome b, DQ316068.1, 472 bp; 猛犸象靶标基因Cytochrome b, MG334284.1, 472 bp)进行比对, 同源性大于98.5%时, 即认为是该物种。

1.6 结果判定

近红外光谱鉴定结果的判定: 判定为“ 象牙” , 即一个样品测量有多个光谱, 只要有一次光谱的结果显示为象牙, 即判断该样品为象牙; 否则判定为“ 非象牙” 。

形态学鉴定结果判定: 判定为“ 象牙” , 即有明显的施氏结构, 热针戳无孔痕, 无烟; “ 非象牙” , 即无施氏结构, 热针戳有孔痕, 冒白烟; “ 无法鉴定” , 即无施氏结构, 热针戳无孔痕, 无烟。

分子生物学鉴定结果判定: 判定为“ 象牙” , 即分子检测的结果为非洲象, 亚洲象, 或者猛犸象; “ 非象牙” , 即鉴定结果为除象以外的其他物种; “ 无法鉴定” , 即未能鉴定到物种。

光谱鉴定准确率=鉴定准确的样品数/样品总数× 100%。 鉴定结果以形态学结合分子生物学的结果(综合判定结果)为准, 即这两个方法中有一个方法鉴定为“ 象牙” 即为“ 象牙” ; 有一个方法鉴定为“ 非象牙” , 即为“ 非象牙” ; 两种方法都为“ 无法鉴定” , 则为“ 无法鉴定” ; 两种方法有矛盾时, 即一种方法的结果为“ 象牙” , 另一种方法的结果为“ 非象牙” 时, 需要再验证, 但一般不会出现此类矛盾的结果。

2 结果与讨论
2.1 样品颜色和厚度对检测结果影响

收集了153件象牙制品(表1), 包括99个现代象牙但无法区分亚洲象牙或非洲象牙的制品, 26件非洲象牙制品, 18件亚洲象牙制品, 10件猛犸象牙制品。 多数象牙呈典型的象牙白色或米色或米黄等颜色, 5件象牙制品由于年代久远或者保存不当, 样品表面呈暗色, 如黑灰色等; 8件为带深蓝色牙皮的猛犸象牙制品。 多数象牙制品为画轴轴头、 手镯、 印章、 佛珠、 平安扣等, 具有一定的厚度, 有些象牙制品呈薄片形, 如3件象牙扇, 2件象牙刀片, 5件象牙钢琴琴键薄片等。 由于同一样品不同部位存在颜色和形状的差异, 因此往往对同一样品的不同部位同时采集多个光谱信息, 实际得到的光谱样本数大于样品个数。

将颜色深浅不同的象牙样本, 进行光谱比对分析。 图1(a)是2个米黄色象牙轴头[典型样品图如图2(a)]和2个呈暗灰黑色象牙轴头[典型样品图如图2(b)]的原始光谱图, 从波形判断这4个光谱差异不大, 但暗色样品的吸光度明显高于白色样品。 图1(b)是图1(a)的原始光谱在窗口数3(参与求导的数据点数为3)的情况下经过1次拟合1次求导后的导数光谱图, 图1(b)中4个光谱图的差异不大。 说明图2(b)类型的灰黑色对光谱图的影响不大。 图1(c)是2个蓝黑色猛犸象牙外皮[典型样品图如图2(c)]和2个米黄色猛犸象牙[典型样品图如图2(d)]的原始光谱图, 图形上蓝黑色样品和米黄色样品在1 000~1 400 nm区域的吸收峰存在一定的差异, 经过光谱处理后, 图谱仍然存在一定的差异[图1(d)]。

图2 象牙典型样品及扫描方式
(a): 典型的米黄色象牙画轴轴头; (b): 典型的灰黑色象牙画轴轴头; (c): 典型的蓝黑色的猛犸象牙外皮; (d): 典型的米黄色猛犸象牙; (e): 象牙刀片; (f): 薄片型样品放在桌面上扫描; (g): 薄片型样品持在手上扫描Fig.2 Typical ivory sample and scanning method
(a): A typical beige ivory painted-scroll head; (b): A typical gray-black ivory painted-scroll head; (c): A typical blue-black mammoth ivory; (d): A typical beige mammoth ivory; (e): Ivory blade; (f): Slice sample scanned on the desktop; (g): Slice sample scanned in hand

将厚薄不同的象牙样本, 进行光谱比对分析。 图1(e)是厚度为0.69 mm的象牙扇扇骨片、 2.86 mm的象牙刀片[图2(e)]和长径21.6 mm、 短径17.4 mm的象牙佛珠的原始光谱, 图1(f)是其导数光谱(求导条件同上)。 图1(e)和(f)都显示, 不同样品的厚度对光谱图形影响不大, 且扫描方式, 即样品放在桌面上扫描[图2(f)]亦或是样品持在手上扫描[图2(g)], 扫描得到的光谱差异也不大。

对上述光谱进行建模分析。 图1(g)和(h)是用SIMCA建立模型的过程中定性分析校正集光谱(包括现代象牙和猛犸象牙)时发现的异常光谱。 208个校正集光谱中, 在F值为默认值2.5, 推荐的主因子值为3的条件下, 发现了23个异常光谱, 其中9个为猛犸象牙黑色部位采集到的光谱样本, 10个为象牙扇扇骨片的光谱样本。

样品颜色对扫描结果存在一定的影响, 如同一物质, 颜色深和浅的部位吸光度会有差异, 即便目测光谱图形无差异, 软件通过计算分析后较容易划分为异常样本, 也说明了和其他样本光谱还是存在一定的差异。 同样, 样品的厚度若太薄(如上述10个判断为异常样本的扇骨片, 厚度都小于1 mm)也容易引起误判。 检测样本时, 若样本不同部位的颜色不同, 厚度不同时, 应扫描具有该物质典型颜色部位, 同时取有一定厚度的部位进行扫描, 以免造成误判。

2.2 模型建立

用于校正集的153件样品和208个光谱样本, 以及用于验证集的20类不同属性的76件样品和171个光谱样本, 详见表1。 将采集的光谱按照1.3、 1.4节方法, 建立初步的模型。 模型建立过程中涉及到主因子-F值聚类判别, 在对样本进行建模时, 推荐的主因子值为3, 此时包含了样品96.7%的信息量。 初始默认的F阈值为2.5左右, 如图3(a)显示, 此时的校正样本中只有几个样本被列为异常, 其余都是正常的校正样本; 但同时验证样本中也显示[图3(b)], 大多数样本为正常样本, 这意味着这些大多数非象牙材质的样本也会被鉴定为象牙。 调整F值至0.69左右, 此时被列入异常的校正样本数明显增多[图3(c)], 但同时还是有相当数量的验证样本被列入正常样本[图3(d)]。 继续调整F值至0.21左右[图3(e, f)], 统计显示此时校正样本中正常样本数为84(84/208× 100%=40.8%), 异常样本数124, 验证样本中正常样本数降低至46(46/171× 100%=26.9%), 异常样本数升至125。 虽然此时已经超过半数的校正样本被列入异常样本(即124个象牙样本被判定为非象牙), 但仍然有46个验证样本被认为是正常样本(即46个非象牙的样本被判定为象牙)。 进一步确认, 被误判为象牙的样品主要是动物牙齿, 包括野猪牙[图3(g)]、 河马牙[图3(h)]、 抹香鲸牙等。

图3 象牙近红外光谱鉴定建模分析图
(a): 校正样本F值为2.52; (b): 验证样本F值为2.52; (c): 校正样本F值为0.69; (d): 验证样本F值为0.69; (e): 校正样本F值为0.21; (f): 验证样本F值为0.21; (g): 验证样本F值为0.21时, 野猪牙显示为异常样本; (h): 验证样本F值为0.21时, 河马牙显示为异常样本Fig.3 Modeling and analysis diagram of ivory identification by near infrared spectroscopy
(a): Calibration samples with F value in 2.52; (b): Validation samples with F value in 2.52; (c): Calibration samples with F value in 0.69; (d): Validation samples with F value in 0.69; (e): Calibration samples with F value in 0.21; (f): Validation samples with F value in 0.21; (g): The wild boar tooth shown as an abnormal sample, when F value in 0.21; (h): The hippo tooth shown as an abnormal sample, when F value in 0.21

在F值保持0.21的情况下, 调整了主因子值。 研究发现, 将主因子从3调整至1或者2时, 校正集中的正常样本比例提高, 而同时验证集中的正常样本比例也大幅提高, 如主因子降至2时, 校正集中的正常样本比例从40.8%提至44.7%(93/208× 100%=44.7%), 验证集中的正常样本比例从26.9%升至55.0%(94/171× 100%=55.0%); 而将主因子从3调整至4或者5时, 校正集中的正常样本比例大幅下降, 而同时验证集中的正常样本数也下降, 如升至4时, 校正集中的正常样本比例从40.8%降至15.0%(31/208× 100%), 验证集中的正常样本比例从26.9%降至18.7%(32/171× 100%)。 因此在F值保持不变的情况下, 将主因子从3降低至1或者2, 有利于降低假阴性, 但假阳性增幅更高; 若将主因子从3升高至4或者5, 则假阴性比例会大幅上升, 假阳性比例则会有所下降。

无论是调整F值还是调整主因子值, 目的在于让校正集中尽可能多的样本归类于正常样本, 从而降低检测结果的假阴性; 同时让验证集中尽可能少的样本归类于正常样本, 降低检测结果的假阳性。 调整F值和主因子值, 使假阳性率和假阴性率都保持在比较低的水平, 同时根据检测目的, 如检测目的是为了打击濒危动植物的走私而进行的初步筛选, 则一般来说比较假阴性, 更加可以容忍假阳性。 因此, 最终将F值设置为0.21, 将主因子设置为2, 保存设置, 并完成模型的建立。

用近红外光谱自带软件, 采用SIMCA定性分析方法建立鉴别(定性)模型的过程中, 完成校正集与验证集选择, 及特征谱段的选择, 同时对上述光谱进行校正等光谱处理后, 一般软件便可自行进行分析建模, 人为可设置的因子不多, 但在涉及主成分值即主因子值和F值时, 可以根据检测的目的和需要进行相应设置和调整。 本研究中软件推荐的主因子值为3, 此时包含了样品96.7%的信息量, 初始默认的F阈值约为2.5, 但根据本研究的目的和需要, 即在尽可能降低假阳性假阴性的情况下, 相对更加能够包容假阳性的存在, 因此最终将F值设置为0.21, 将主因子设置为2。 主因子由3调整至2时, 模型的维度降低, 所包含的信息量由96.7%, 降低至94.5%, 但根据比较的结果, 信息量并非越多越好, 信息量降低至94.5%时, 判定的结果更加符合研究的需求, 因此可认为去掉的信息对模型的判定是冗余信息。

2.3 象牙鉴定模型的验证

2.3.1 识别的正确率

采用2.2建立的模型, 验证表1中样品鉴定的准确率。 采用建立的模型检测表1中样品的光谱, 得到的鉴定结果显示(表1), 所有经形态学和/或分子生物学鉴定为象牙的样本, 本模型的鉴定结果也都为象牙, 未有假阴性, 因此对象牙的识别正确率达到100%。 但在鉴定其他动物牙齿样本时, 易将其他动物牙误判为象牙, 特别是对野猪牙、 河马牙、 抹香鲸牙、 独角鲸牙的鉴别准确率仅为0; 对狗牙的误判率为50%。 但对角制品、 塑料仿制品以及象牙果制品等则能够完全鉴别, 准确率为100%。

2.3.2 对未知样本的预测

采用2.2中建立的模型, 对海关截获的20件疑似象牙制品进行鉴定(表2)。 近红外检测得到的结果: 20个样品中14个样品与综合判断一致, 其中5个为象牙, 9个为非象牙; 6个与综合判定不符合的样品, 近红外光谱都判定为象牙, 综合判定的结果都是无法鉴定。 由于近红外光谱检测有假阳性的存在, 同时形态学和分子生物学都无法确定, 因此最终的判定仍为无法鉴定。

本模型鉴定象牙的结果显示, 假阴性的结果几乎不存在, 但假阳性却不可避免, 特别是在鉴定与象牙材质接近的其他动物牙齿时, 如野猪牙、 河马牙、 抹香鲸牙、 独角鲸牙等, 几乎全部都鉴定为象牙。 对一些象牙的仿制品, 如塑料、 象牙果等仿制品, 则由于存在和象牙材质完全不同的光谱信息, 则基本不存在错检。

虽然国内有学者[13, 14]通过光谱比对, 区分了现代象象牙和猛犸象象牙, 但未能通过建立模型的方式, 让光谱鉴定的方法得到更多的应用。 本研究首次采用近红外光谱的光谱区域建立了象牙的鉴定模型, 虽然本模型无法区别现代象象牙和猛犸象象牙, 在鉴别类似动物牙齿时也会发生假阳性的错判, 但鉴定模型的建立使该方法可以在相同或类似的仪器设备上应用, 具有普及推广的可行性, 因此本方法作为一种现场执法快速初筛的方法具有一定的可行性。

3 结论

采用近红外光谱的长波区域(1 100~2 526 nm), 建立了象牙的鉴别模型。 模型建立过程中得到的结论如下:

(1)采集光谱时, 扫描具有该物质典型颜色部位, 同时取样品厚度大于1 mm的部位进行扫描, 否则易造成误判。

(2)建模的特征谱段为: 1 160~1 200、 1 430~1 500、 1 680~1 710和1 720~1 750 nm。

(3)建模过程中, 在平衡假阳性率和假阴性率后, 推导出本模型的最佳主因子值为2和F值为0.21。

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