显微高光谱成像系统采集的是样本的原始高光谱图像, 由于采样过程中存在光照强度、 CCD电噪声等不可忽视的因素, 原始图像数据存在一定的差异和不稳定性。 因此, 在数据处理前必须对原始图像进行校正。

显微高光谱成像系统的校正方法包括Lambert-Beer定律校正法、 空间维度与光谱维度联合校正法和相对透射率校正法。 这三种校正方法的原理相同, 即根据样本对光谱的吸收和反射率进行校正。 空间维度与光谱维度联合校正法虽然在空间维度得到延伸, 但对光谱特性没有明显的增强。 目前常用的校正手段为Lambert-Beer定律校正法, 它是利用样品对单一光的吸收强度与其浓度和厚度之间的关系展开校正, 如式1所示。 该法通过提取样品吸光程度的方法来提取高光谱特性曲线, 能够消除系统噪声以及样品制备等因素的影响。

A(n, m; λ)=logB(n, m; λ)-I(n, m; λ)D(n, m; λ)-I(n, m; λ)(1)

式(1)中, D(n, m; λ )为样品在第λ 波段中n行m列的像素灰度值, B(n, m; λ )为空白样品的像素灰度值, I(n, m; λ )为暗电流噪声。

显微高光谱成像系统所采集的数据中不仅包括被测样品的光谱信息, 还包含了背景信息以及噪声的干扰。 光谱数据预处理就是要尽可能消除这部分信息的影响, 从而强化被测样品的光谱信息。 常用的光谱数据预处理方法有平滑法、 导数法、 散射校正法以及数据增强法等。 平滑法是一种通过多次获取光谱数据求其平均值以减小随机误差的方法, 主要包括移动平滑法(moving average smoothing, MAS)和卷积平滑法(Savitzky-Golay, SG)。 导数法可消除由基线漂移或平缓背景引起的干扰, 包括一阶导数法和二阶导数法。 散射校正法主要包括多元散射校正法(multivariate scattering correction, MSC)和标准正态变量变换法(standard normal variable, SNV), 其中多元散射校正法可消除漫反射光谱中由于样品的镜面反射及不均匀形成的噪声; 标准正态变量变换可消除由表面散射及光程变换对漫反射的影响。 数据增强法主要包括均值中心化(mean centralization, MC)和数据标准化/归一化(standardization/normalization)等^{[16, 17]}。 其中数据标准化/归一化是将数据按照比例缩放、 平移, 使数据落入一个小的特定区间中, 其作用是消除数据量纲的影响, 使数据指标之间具有可比性。

图像数据处理有图像预处理、 图像分割、 形态学处理、 特征提取以及光谱混解等环节。 图像预处理与光谱数据预处理具有相同的目标, 即减弱甚至消除背景点对被测样品的信息干扰, 移除坏点以及去除边缘效应的影响, 常用的有灰度直方图均衡化和主成分分析法等。 灰度直方图均衡化是通过增加像素灰度的动态范围, 达到增强图像对比度的效果主成分分析法(principal component analysis, PCA)是近年来高光谱图像数据预处理的常用降维方式, 在保证主要信息不丢失的前提下, 针对图像数据进行降维压缩, 为后续环节的数据处理节省大量的时间^[18]。 图像分割就是提取感兴趣区域(region of Interest, ROI)和划分图像中某些特征区域的过程, 是从图像处理到图像分析的关键步骤。 图像分割常用方法有基于阈值的分割法和基于小波变换的分割法。 形态学处理是一种量度和提取图像中对应形状的手段^[19], 常用的方法有腐蚀、 膨胀以及开— 闭运算等。 特征提取主要包括纹理、 颜色以及形态特征的提取, 主要方法有灰度共生矩阵(gray level co-occurrence matrix, GLCM)、 灰度直方图以及傅里叶变换等^[20]。 光谱解混就是把高光谱图像中的混合像元分离开, 得到各纯净像元的丰度, 常用方法有线性光谱解混(linear spectral unmixing, LSU)和完全约束最小二乘法光谱混解(fully constrained least squares, FCLS)。

尽管经过预处理后, 消除了背景噪声的干扰, 但高光谱图像中仍包含部分无用信息。 在高维数据分类中, 由于数据冗余性强, 存在着一种Hughes现象: 即分类精度会随着波段数的增加呈现出先升后降。 显微高光谱图像由于自身检测样本量较少, Hughes现象更加突出。 因此, 提取特征波长并消除无用波长信息, 是后期图像处理与分析工作顺利进展的前提。 显微高光谱图像的特征波长提取常用方法^[21]有无信息变量消除算法(UVE)、 竞争性自适应重加权算法(CARS)、 连续投影算法(SPA)以及耦合不同变量筛选方法。

显微高光谱的数据冗余现象较为严重, 对于模型的要求也更为苛刻, 在定性分析中要求分类器保持准确度的同时尽可能缩短响应时间。 线性判别(linear discriminant analysis, LDA)、 偏最小二乘判别(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)以及支持向量机(support vector machines, SVM)是较为传统的分类方法。 近年来, 卷积神经网络(convolutional neural networks, CNN)成为研究的热点, 并在该基础上增加了逐块卷积神经网络(PTOP-CNN)和深卷积神经网络(Deep-CNN)。 模型建立后一般采用内部交叉验证或外部验证用以评估模型的准确性和稳定性。

生物疾病的内在最初表现在于生物组织病变并不断向外扩散, 侵染正常组织。 传统的病理检测识别法需要医护人员切除样本, 采用化学仪器或者生物免疫学等手段进行分析, 并结合相关医学专家多方会诊最终得到诊断结果。 该法精度较高, 但价格昂贵并且等待时间较长, 不利于病理组织的快速检测。

随着HSI技术在图像以及化学检测上的快速应用, 利用光学图像与光谱信息自动完成识别检测工作成为医学检测的研究热点。 日本东京大学的Akbari教授^[22]带领团队先后研究动静脉的光谱差异, 为找到缺血组织提供了新的思路; 该团队利用显微高光谱成像系统研究前列腺癌和胃癌组织, 确定癌变组织的特征光谱, 并识别出恶性癌变边缘, 证明了显微高光谱成像技术较于传统的医学诊断具有一定的优势。 国内显微高光谱成像系统的搭建以及相关技术的研究起步较晚。 肖功海、 李庆利等学者自主搭建成像系统, 在显微高光谱成像系统的研究与应用以及人体表皮组织分类和大鼠视网膜图像分析等方面取得较好的效果。 近十年来, 随着显微高光谱成像系统的持续优化以及相关技术的不断发展, 在病理组织检测、 识别和分类领域已有了探索性的研究, 如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 显微高光谱成像技术在病理组织检测的研究 Table 2 Studies on microscopic hyperspectral imaging in pathological tissue detection 目标对象 光谱范围/nm 处理方式 检测效果 参考文献 胃组织癌变 1 226~1 370 SVM、 差分指数 捕获时间1.5 s [23] 血管动静脉 400~1 700 SVM、 导数法 快速检测缺血组织 [24] 肝癌组织 400~1 000 SVM、 KNN、 K-means聚类 辅助检测肝癌组织边缘 [25] 扁桃体恶性瘤 400~1 000 CART 快速检测毒瘤区域 [26] 胃粘膜 600~800 目标识别算法 分类精度为92.6% [27] 大脑组织 400~1 000 - 检测出血红蛋白变化 [28] 注: KNN为最近邻分类算法, CART为分类与回归树算法 Note: KNN represents K-nearest neighbor algorithm and CART represents the claasification and regression tree

表2 显微高光谱成像技术在病理组织检测的研究 Table 2 Studies on microscopic hyperspectral imaging in pathological tissue detection

在病理组织检测与识别上, 同一种生物不同组织的光谱信息是不同的, 病变组织与正常组织之间不仅光谱信息不同, 采集到的图像也有所差异。 光谱信息的差异是研究生物不同组织化学成分和物理特性的基础, 空间结构信息的不同可更加直观地表现出不同的病理结构。 显微高光谱在医学病理组织上的研究目前处于初探阶段, 无论是样本制作, 还是数据处理以及建模分析算法上都需要不断改进和完善。

细胞作为生物体基础的结构单位, 也是生命活动最基本的功能单元, 传统的检测手段有计算机辅助诊断法和离心分离法。 计算机辅助诊断法是比较可靠有效的医学图像分析方法, 是“ 人机合作” 的典型代表。 计算机辅助诊断的前提是细胞分割, 对于细胞图像常见的“ 细胞粘连” 等现象, 常见的处理方案是运用形态学算法分割粘连细胞。 离心分离法主要针对细胞内部化学成分进行定量分析, 该法耗时较长, 采样精度的差异会导致结果出现较大偏差。

显微高光谱的应用打破了细胞检测方式中的单一性问题, 空间维与光谱特征的结合为近年来研究的热点, 事实证明, 相较于单一的光谱检测或者图像分割识别方式, 这种结合式的检测方法在准确率和灵敏度上都取得很大的提升。 显微高光谱成像技术在血细胞检测、 癌变细胞与正常细胞分类等方面应用较多, 具体如表3所示。

表3

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表3(Table 3)

表3 显微高光谱成像技术在细胞识别检测中的研究 Table 3 Study on microscopic hyperspectral imaging technology in cell recognition and detection 目标对象 光谱范围/nm 处理方式 检测效果 参考文献 神经细胞 545~800 SAM、 FNN 区分运动与感觉神经细胞 [29] 白细胞 550~1 000 FCM 白细胞识别检测 [30] 表皮细胞 500~1 000 K-均值 表皮组织细胞分割 [31] 肝癌细胞 400~1 000 解混合运算 区分癌变细胞与正常细胞 [32] 血细胞 400~1 000 SVM、 CNN 分类精度为90% [33] 淋巴细胞 400~1 000 SVM、 BP 识别精度为92.9% [34] 注: FNN为前馈神经网络, FCM为模糊C均值, KELM为核极限学习机 Note: FNN represents the feed forword neural network and FCM represents fuzzy C-means, KELM represents Kernel extreme learning machine

表3 显微高光谱成像技术在细胞识别检测中的研究 Table 3 Study on microscopic hyperspectral imaging technology in cell recognition and detection

在细胞的检测与识别中, 细胞分割的手段也逐渐增多, 基于空谱特性的分水岭分割就是其中之一, 它是将光谱解混, 端元提取、 目标丰度分布以及基于标记的分水岭算法相结合^[35]进行细胞分割, 取得了较好的效果。 目前, 显微高光谱成像系统在细胞分割以及细胞识别分类中的应用还较少, 细胞受年龄和环境影响致使其特征波长可能会有所不同, 另外存在样本量少而导致的模型可靠性不高的问题, 因此还需大量的实验数据来建立准确度更高的稳定模型。 由目前的研究现状可以看出, 显微高光谱成像技术在细胞识别检测中具有较大的实用价值, 光谱与图像技术的融合在一定程度上弥补了仅用单一检测手段的缺陷。

近年来, 显微高光谱成像系统已逐渐应用于生物学的各个领域。 藻类对生态系统有着重要的作用, 但藻潮已成为不可忽视的环境问题, 解决该问题的关键在于对藻类进行正确的分类。 目前藻类分类的手段有形态分类法、 生物化学分类法以及光谱法等, 这些方法存在过程繁琐、 灵敏度低, 准确度不高等问题。 Wei搭建了一套显微高光谱成像系统以获得藻类光谱立方体, 并运用小波变换实现藻类的分类。 木材是必不可少的生活资源, 也是可再生的重要原料。 有些木材的纹理极为相似, 仅用肉眼无法辨别。 利用显微高光谱“ 图谱合一” 的特点, 将光谱与图像纹理信息相结合, 通过提升不同特征之间互补的利用率从而提高分类的精度, 达到有限样本条件下木材树种分类的目的。 张红涛等人将显微CT技术应用于小麦籽粒内部粮虫的变化规律探究, 证实了从显微角度分析农业宏观问题的可行性, 也可为显微高光谱成像技术在农林业等方面的研究提供一定的理论支持。