普遍存在于大气中的气溶胶, 通常是指固体或液体颗粒悬浮在气体介质中所组成的气态分散系统。 生物气溶胶是一种特殊的气溶胶, 其含有微生物或来源于生物性物质。 生物气溶胶的颗粒类型有生物机体、 扩散单元以及它们的碎片和分泌物, 例如, 细菌、 真菌、 藻类、 花粉、 微生物碎片等^[10]。 生物气溶胶的空气动力学直径分布范围为几纳米到百微米, 此上限是由较大颗粒的快速沉降决定的。

生物气溶胶可以从生物体中以主动或被动的形式释放出来, 如真菌孢子, 可以通过渗透压或表面张力效应释放, 而菌体碎片主要是由风驱动的。 微生物栖息在大多数植物、 土壤和岩石表面^[1]。 植物在繁殖的过程中会释放生物气溶胶, 例如, 高等植物的花粉、 蕨类和苔藓的孢子; 人类本身及其进行的农业活动、 动物饲养等也会释放生物气溶胶。 生物气溶胶可作为云凝结核和冰核, 进而形成降水, 对区域尺度上的水文循环和气候产生影响。 医学研究领域也涉及到生物气溶胶, 生物颗粒会危害人类健康, 从传染性疾病到急性毒性反应, 长期暴露于生物气溶胶环境还可导致哮喘等呼吸系统疾病。

荧光光谱法广泛应用于物质成分检测。 荧光的机理为: 当某一波长的光照射物体时, 物体中处于基态的电子吸收光子瞬时向激发态进行电子跃迁; 无辐射弛豫发生在激发态的振动能级之间; 处在激发态的电子不稳定, 会跃迁回基态并发出光子, 产生荧光现象^[11]。 这种发射产生的光谱取决于每个分子的结构、 电子态之间的能级和振动特性。 因此, 对于不同的荧光团, 其激发波长和发射波长会存在一定的差异。 荧光强度、 量子效率Φ 以及荧光寿命是荧光光谱中重要的参数。

固有荧光, 也称自体荧光, 是由某些分析材料中天然存在的荧光分子或荧光团引起的。 大量的生物分子和化合物具有自体荧光特性。 某些氨基酸、 辅酶以及许多其他代谢物是常用于分析的生物荧光团。 生物样品通常为包含多种生物荧光团的混合物, 因此, 总的荧光发射是各自信号的叠加。 表1列举了部分用于探测生物气溶胶时高荧光性的生物荧光团, 给出其常用的激发和发射波长。 当采用特定波长的激光照射气溶胶颗粒, 在探测系统上收集到相应的荧光信号时便可将该颗粒视为生物气溶胶^[12]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 生物气溶胶中高荧光性的生物荧光团[11, 15] Table 1 High fluorescence performance biofluorophore in bioaerosols[11, 15] 荧光团 激发波长/nm 发射波长/nm 色氨酸 280~295 340~353 酪氨酸 275 300~304 NADH(NADPH) 290~295, 340~366 440~470 核黄素 380, 450~488 520~560 维生素B6化合物 315~345 350~425 蝶啶化合物 331~361 373~458 几丁质 335 413 黄酮类 365 440~610 类胡萝卜素 400~500 520~560

表1 生物气溶胶中高荧光性的生物荧光团[11, 15] Table 1 High fluorescence performance biofluorophore in bioaerosols[11, 15]

荧光法主要用于识别气溶胶的生物特性。 获取气溶胶的物理特征, 例如, 气溶胶的形态与粒径尺寸, 可以提高生物气溶胶实时检测系统的分辨能力。

当光照射一个物体时, 入射波电场引起其内部电荷发生振荡运动。 这些电荷的加速导致它们向各个方向辐射或散射电磁能量, 也被称为散射光。 由于散射光向各个方向辐射, 具有特定的角度分布, 称为散射角。 基于Mie理论^[13], 散射光强度与散射角、 粒径及其折射率存在一定的关系。 实验中激光照射气溶胶颗粒流, 产生的散射信号强度由待测颗粒物的尺寸和形状决定。 根据不同实测的散射信号, 就能得到气溶胶颗粒的物理特征。

在生物气溶胶实时检测系统中, 利用颗粒飞行时间测量气溶胶空气动力学粒径的方案原型来自于TSI的空气动力学粒径谱仪^[14]。 激光器输出光束经一系列的光学元件后, 在气溶胶采样腔室喷嘴下方分析区域产生两个分离平行的细光束。 当气溶胶颗粒经过喷口处的细喷嘴时会产生一个突然的加速度。 不同粒径的气溶胶惯性不同, 颗粒较小的气溶胶速度大、 颗粒较大的气溶胶速度小。 根据气溶胶颗粒经过两个细光束的飞行时间, 可以得出其速度。 实验前使用标准粒子测得气溶胶颗粒速度与粒径之间的关系函数, 通过待测气溶胶颗粒的实际速度, 进行转换就可以得到待测气溶胶的空气动力学粒径。

1995年, 美国陆军研究实验室^[16]利用两个光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)分别收集488 nm激光光束照射气溶胶颗粒后产生的荧光信号和弹性散射信号。 核黄素为此激发波长下的主要荧光团。 此系统可以从单个颗粒尺度对生物气溶胶(枯草芽孢杆菌孢子、 炭疽杆菌孢子、 马勃孢子)与非生物气溶胶(高岭土、 赤铁矿)进行探测和区分。 但在实验中发现系统无法区分枯草芽孢杆菌孢子与马勃孢子。 以该实验为基础, 该团队与耶鲁大学合作陆续提出荧光激发光源的条件触发、 确定颗粒位置触发两种方式。

2.1.1 条件触发

1996年, 耶鲁大学^[17]使用488 nm激光照射位于采样装置喷嘴尖端下方4 mm处的气溶胶颗粒流, 两个PMT分别收集荧光信号与散射信号。 当两个PMT信号满足一定的逻辑(或门、 与门、 与非门), 将其作为触发信号, 触发266 nm脉冲紫外光束照射位于采样装置喷嘴尖端下方5 mm处的气溶胶颗粒流, 通过光谱仪与增强电荷耦合器件(intensified CCD, ICCD)记录荧光光谱。 这种触发形式的提出可以有选择性地获取目标颗粒的荧光光谱而忽略其他粒子。 该系统测得了266 nm激发波长时生物化合物中荧光成分以及几种细菌颗粒的荧光光谱。 此时, 细菌颗粒的荧光主要来源于色氨酸和酪氨酸。 以聚苯乙烯微球为实验材料, 该团队测试了以散射光、 红球荧光、 绿球荧光三种触发形式的荧光光谱。 系统的光学原理图与测试结果如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 条件触发的生物气溶胶实时检测系统[17] (a): 光学原理图; (b): 测试结果Fig.1 The real-time detection system of bioaerosols of conditional triggering[17] (a): Optical schematic; (b): Test result

2.1.2 确定颗粒位置触发

1999年, 耶鲁大学^[18]采用一个大数值孔径的反射镜, 其焦点处为气溶胶颗粒流的分析区域。 该团队以交叉垂直的方式放置670和635 nm两个激光器, 两束激光同时照射分析区域, 由PMT收集颗粒的散射信号。 当两个散射信号同时位于预设电压水平之间, 以此作为触发信号, 触发紫外激光器和ICCD探测器。 这种触发形式可以准确探测分析点处的气溶胶颗粒并且反射镜的存在改善了荧光信号的收集效率, 提高了信噪比。 系统的光学原理图及测试结果如图2所示。 实验还发现: 随着266 nm激光脉冲能量增强, 枯草芽孢杆菌的荧光光谱质量逐渐变差; 在351 nm激发波长下, 核黄素的荧光光谱在420 nm处表现出低脉冲能量时未出现谱峰而高脉冲能量时出现谱峰, 并且谱峰与脉冲能量呈非线性关系。

图2

Fig.2

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	图2 确定颗粒位置触发的生物气溶胶实时检测系统[18] (a): 光学原理图; (b): 测试结果Fig.2 The real-time detection system of bioaerosols of triggering by determining the particle position[18] (a): Optical schematic; (b): Test result

在生物气溶胶实时检测系统中, 荧光激发光源采用条件触发方式不仅可以获得目标气溶胶颗粒光谱, 还能够为数据处理和存储能力减少负担。 上述两种触发方式将光谱采集系统的曝光时间限制在短时间内, 提高了信噪比。

生物气溶胶实时检测系统的激发光源可以选用激光器、 线性LED阵列以及脉冲氙灯。 当以激光器作为激发光源时, 国内外学者探索了单波长激发荧光、 双波长激发荧光以及多光子激发荧光。

2.2.1 激光器

(1) 单波长激发荧光

使用单激光器激发荧光的生物气溶胶实时检测系统是较为常见的。 1999年, 美国海军研究实验室^[19]使用780 nm激光二极管照射气溶胶颗粒, 散射信号由光电二极管(photo-diode, PD)探测。 超过相应阈值的散射信号会触发266 nm激光器, PMT收集其激发的荧光信号。 在实验室测试该系统, 得到的双参数(粒径、 荧光)能够区分三种细菌。 2014年, 韩国国防发展署^[20]采用405 nm激光二极管照射气溶胶颗粒产生散射光与荧光。 两个PMT分别用于采集NADH和核黄素的荧光信号, 雪崩光电二极管收集散射信号。 在实验室使用该系统测试不同种类的气溶胶, 如孢子、 细菌、 毒素和环境颗粒等。 基于核黄素和NADH的荧光光谱建立了良好的气溶胶可区分特征。 2016年, 波兰华沙董布罗夫斯基军队技术学院^[21]利用375 nm连续激光照射气溶胶颗粒, 两个PMT收集后向和前向散射信号, 32通道的PMT收集415.4~643.5 nm范围的荧光信号。 系统内置了计算机与固态硬盘用于数据实时采集和分析。 实验测试了花粉、 面粉、 核黄素等气溶胶单颗粒荧光光谱。 随后, 该团队提出使用人工神经网络实时分析由该系统采集的单颗粒荧光指纹^[22], 由48种不同的气溶胶(花粉、 细菌、 真菌和非生物性物质等)组成数据库, 用22个神经网络训练并生成决策树。 算法的应用可以为高效分析生物气溶胶提供帮助。 2019年, 马克斯· 普朗克化学研究所^[23]利用655 nm激光照射气溶胶颗粒, 散射信号用于表征0.5~20 μ m气溶胶空气动力学直径并触发355 nm激光照射生物气溶胶, 荧光光谱由光谱仪和ICCD记录。 370~610 nm荧光光谱被分离在512个通道。 系统能够区分高荧光性的花粉颗粒, 对于其他低荧光性的颗粒, 只有累积一定数目才可得到的相应的荧光光谱。

(2) 双波长激发荧光

2004年, 美国海军研究实验室^[24]使用266和355 nm两束激光以400 ns时间间隔照射生物气溶胶颗粒流, 300~400、 400~500和500~600 nm的荧光信号分别由三个PMT收集, 其中收集300~400 nm荧光信号的PMT仅在266 nm激光器工作时采集信号。 810 nm激光照射气溶胶颗粒流产生的散射信号由光电二极管收集。 由此每个气溶胶颗粒都会得到5个荧光发射强度以及1个弹性散射强度。 双波长激发荧光推动了生物气溶胶在种类识别上的进展。 实验测试了16种生物气溶胶的模拟物与干扰物, 将荧光信号归一化于颗粒的弹性散射强度, 相似光谱特征的样本会聚集在一起。 该系统在测试中发现真菌孢子的荧光明显不同于其他生物气溶胶样本类型, 并且细菌孢子的辨别能力得到了提升。 2015年, 瑞典国防研究局^[25]采用404 nm连续激光聚焦气溶胶颗粒流, 两个PMT分别收集散射和荧光信号。 荧光信号触发263 nm激光器, 相应的250~800 nm荧光光谱被光谱仪和32通道PMT记录。 该团队测得了九种物质(细菌孢子、 病毒模拟物等)的荧光光谱, 计算这些物质的散射和荧光信号与气溶胶空气动力尺寸的函数关系并应用于分类算法, 结果得到: 系统识别细菌孢子和干扰物质的能力较高、 病毒和花粉的假阳率较高。

(3) 多光子激发荧光

2011年, 美国海军研究实验室^[26]使用40 MHz波长524 nm的锁模激光器实现了双光子激发萎缩芽孢杆菌、 耶尔森氏菌荧光; 同年, 日内瓦大学^[27]采用790 nm飞秒激光器完成了几种花粉颗粒的多光子激发荧光。 多光子激发荧光为生物气溶胶的检测提供了泵浦探测、 相干控制等方案。

2.2.2 LED

2003年, 耶鲁大学^[28]使用线性蓝色LED光源照射气溶胶颗粒流, 光谱仪和ICCD用于采集荧光光谱。 以LED为激发光源存在局限性, 即发射光谱中存在长波长尾。 该团队在LED阵列前放置一个500 nm短通滤光片、 光谱仪前放置一个500 nm长通滤光片解决了这个问题。 线性LED作为光源既可满足激发荧光所需的能量, 又因其紧凑小型的特点减小了系统的整体体积。 实验测得了高信噪比的核黄素荧光光谱。 2020年, 韩国国防发展署^[29]利用280 nm LED照射气溶胶, 用两个PMT分别收集荧光与散射信号。 该手持式生物气溶胶实时检测系统可以测量非生物颗粒的散射信号、 生物颗粒或含有荧光物质颗粒的荧光信号和散射信号。 以非荧光聚苯乙烯微球为实验材料, 实验得到其散射PMT的峰值电压与粒径尺寸关系直方图, 并用海藻糖、 聚苯乙烯微球等测试系统的性能, 随着颗粒尺寸增大, 系统区分生物颗粒和非生物颗粒的能力提高。

2.2.3 脉冲氙灯

2004年, 赫特福德大学^[30]采用~260~290 nm(氙灯1)和~340~380 nm(氙灯2)两个波段范围的氙灯光源以300 ms的间隔交替照射气溶胶颗粒流, 两个PMT分别用于探测~320~600 nm(PMT1)和~410~600 nm(PMT2)带宽的荧光信号。 当氙灯1输出脉冲时, PMT1和PMT2同时收集荧光信号, 而当氙灯2输出脉冲时, PMT1收集散射信号、 PMT2收集荧光信号。 这种使用脉冲氙灯作为激发光源的系统, 不仅成本较低, 而且解决了LED光源寿命短的问题。 大型腔室里释放不同类型的气溶胶用于测试系统的性能。 系统的实物图、 光学原理图与测试结果如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 脉冲氙灯为激发光源的生物气溶胶实时检测系统[30] (a): 实物图; (b): 光学原理图; (c): 测试结果Fig.3 The real-time detection system of bioaerosols using LED as excitation light source[30] (a): Picture of real product; (b): Optical schematic; (c): Test result

多数的生物气溶胶实时检测系统利用光电二极管、 PMT、 光谱仪与CCD或ICCD系统采集散射与荧光信号。 国内外学者为了从光谱中获得更多的信息, 还使用了其他高性能的探测器。

2000年, 赫特福德大学^[31]采用266 nm连续激光照射气溶胶颗粒流, 多像素高增益混合光电二极管探测器收集散射信号、 PMT收集荧光信号。 空间散射信号提供了颗粒的形状与尺寸信息。 实验发现通过散射信号无法区分石膏和枯草芽孢杆菌黑色变种孢子, 但外加固有荧光信号时便可以进行区分。 2004年, 英国国防科学技术实验室^[32]进一步改进系统, 使用连续激光照射气溶胶颗粒流, 散射信号用于分析气溶胶的形状与尺寸并触发266 nm激光器, 荧光信号由PMT收集。 系统的实物图、 光学原理图和散射信号测试结果如图4所示。 多参数测量为分类不同类型的气溶胶颗粒提供了一种有效的方法, 能适当的避免生物气溶胶探测中的假阳性问题。

图4

Fig.4

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	图4 应用混合光电二极管探测散射光的生物气溶胶实时检测系统[32] (a): 实物图; (b): 光学原理图; (c): 测试结果(散射)Fig.4 The real-time detection system of bioaerosols using hybrid photodiode to detect scattering light[32] ] (a): Picture of real product; (b): Optical schematic; (c): Test result(scattering)

2001年, 新墨西哥州立大学^[33]在荧光探测系统中用32-阳极光电倍增管探测器替换ICCD相机。 32-阳极PMT具有单光子探测灵敏度, 能够记录较宽的荧光光谱并且帧率达到1.4× 10³ Hz, 更适用于实时探测。 32-阳极PMT搭配了定制的数据采集和处理系统以及系统控制软件。 当测试环境同时为雾化较低浓度(占比约为2%)的枯草芽孢杆菌与较高浓度的NADH气溶胶颗粒时, 32-阳极PMT探测器在0.1 s内测得100个荧光光谱(97个为NADH、 3个为枯草芽孢杆菌)而ICCD仅探测到了3个荧光光谱(全部为NADH)。 测试结果如图5所示。

图5

Fig.5

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	图5 应用32-阳极PMT(a)与ICCD(b)探测荧光的测试结果[33]Fig.5 Test result of the real-time detection system of bioaerosols using 32-anode photomultiplier tube (a) or ICCD (b) to detect fluorescence[33]

除上面介绍的几种生物气溶胶实时检测系统外, 表2总结了国内外学者在相关方面进行的研究开发。 表格展示了生物气溶胶实时检测系统的光源与信号采集系统, 包括荧光激发光源、 荧光信号采集系统、 散射光源、 散射信号采集系统; 介绍了系统的荧光光谱采集范围、 荧光激发光源的触发方式; 列举了系统探测生物气溶胶时针对的荧光团以及测试时选用的实验材料。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 其他生物气溶胶实时检测系统 Table 2 Other real-time detection system of bioaerosols 文献 年份 研究机构 荧光激发光源 荧光采集系统 荧光光谱 采集范围 散射光源 散射信号 采集系统 触发方式 针对荧光团 测试用材料 [34] 2003 耶鲁大学 266 nm 光谱仪+ ICCD 200~650 nm 635 nm+670 nm - 确定颗粒位置触发 色氨酸、 NADH等 色氨酸、 柴油排放物等 [35] 2008 耶鲁大学 263 nm+ 351 nm 光谱仪+ 32-阳极 PMT 280~600 nm 650 nm+ 680 nm - 确定颗粒位置触发 色氨酸、 NADH等 大肠杆菌、 放置久的色氨酸等 [36] 2013 日内瓦大学 250~290 nm 氙灯 光谱仪+ 32-阳极PMT 300~600 nm 655 nm+ 780 nm PMT× 2 确定颗粒位置触发 色氨酸 花粉、 桑葚等 [37] 2016 日内瓦大学 263 nm+ 527 nm 光谱仪+ 32-阳极PMT 300~500 nm 690 nm× 2 PMT× 2 条件触发 色氨酸、 核黄素等 色氨酸、 细菌、 柴油等 [38] 2017 日内瓦大学 337 nm 光谱仪+ 32-阳极PMT 360~650 nm 655 nm+ 780 nm PMT 确定颗粒位置触发 NADH 大气颗粒物中的多环芳烃 [39] 2005 布朗大学 290 nm/340 nm LED阵列 PMT 32-阳极PMT 400~550 nm 200~520 nm - 635 nm LD PMT PMT 无条件触发 色氨酸、 NADH等 色氨酸、 NADH等 [40] 2006 安徽光机所 349 nm PMT 400~600 nm 650 nm 雪崩二极管 条件触发 NADH DOP乙醇溶剂 [41] 2013 日本海洋 地球科学 技术厅 266 nm 光谱仪+ 32-阳极PMT 300~600 nm 635 nm PMT 条件触发 色氨酸、 NADH等 色氨酸、 酪氨酸、 核黄素、 NADH等 [42] 2014 芬兰坦佩雷 理工大学 405 nm LD PMT > 442 nm - PMT 无 色氨酸、 核黄素等 细菌、 真菌等 [43] 2016 曼彻斯特 大学 280 nm氙灯 PMT 310~650 nm 635 nm+ 637 nm CMOS 线性 探测器阵列× 2 条件触发 色氨酸、 NADH等 细菌、 真菌孢子、 花粉等 [44] 2018 上海光机所 405 nm LD PMT 420~650 nm - PMT 无 NADH 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌等 [45] 2019 韩国三洋 化学产业 405 nm PMT× 2 430~550 nm+ 500~600 nm - 雪崩光电二极管 无 NADH、 核黄素等 核黄素、 NADH、 色氨酸、 酪氨酸等 [46] 2005 赫特福德 大学 280 nm+ 370 nm氙灯 PMT× 2 320~600 nm(PMT1)+ 420~600 nm(PMT2) - PMT2 条件触发 色氨酸、 NADH等 大肠杆菌、 BG孢子等 [47] 2011 美国海军 研究实验室 266 nm+ 355 nm PMT× 3 300~400 nm(PMT1)+ 400~500(PMT2)+ 500~600(PMT3) 785 nm+ 荧光光源 PMT× 2 条件触发 色氨酸、 NADH等 枯草芽孢杆菌、 真菌等 [48] 2019 马克斯· 普朗克 化学研究所 285 nm+ 370 nm 氙灯 多阳极PMT 302~721 nm 785 nm PMT 条件触发 色氨酸、 NADH等 色氨酸、 酪氨酸、 NADH、 核黄素等 注: 光散射部分中“ -” 表示直接使用荧光系统 Note: In the light scattering part “ -” indicates the direct use of the fluorescent system

表2 其他生物气溶胶实时检测系统 Table 2 Other real-time detection system of bioaerosols

耶鲁大学和日内瓦大学常选用确定颗粒位置触发方式触发荧光激发光源, 耶鲁大学研制了单波长激发荧光^[34]和双波长激发荧光^[35]的生物气溶胶实时检测系统, 双波长激发荧光系统的散射信号与荧光光谱仅使用一套光谱仪和32-阳极PMT采集; 日内瓦大学分别采用脉冲氙灯^[36]、 263 nm紫外激光器和527 nm绿光激光器^[37]、 337 nm紫外激光器^[38]作为荧光激发光源, 其中263和527 nm激光器为激发光源的生物气溶胶实时检测系统根据泵浦探测光谱方案区分了生物气溶胶与非生物气溶胶。 布朗大学^[39]、 安徽光机所^[40]等^{[41, 42, 43, 44, 45]}研制了单波长激发荧光的生物气溶胶实时检测系统, 荧光信号由PMT或32-阳极PMT采集。 赫特福德大学^[46]、 美国海军研究实验室^[47]、 马克斯· 普朗克化学研究所^[48]开发了双波长激发荧光的生物气溶胶实时检测系统, 系统多数采用氙灯作为荧光激发光源。

从表2和第二节提到的系统中可以看出, 多数生物气溶胶实时检测系统采用散射信号触发荧光激发光源。 随着科学技术的发展, 各科研团队逐渐采用脉冲氙灯、 激光二极管作为荧光激发光源。 这些研究为后续开发生物气溶胶实时检测系统提供了思路。