引用本文
胡丽, 殷高方, 赵南京, 傅强. 基于多相荧光动力学曲线特征的水质生物毒性综合表征参数构建[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(7): 2319-2324.
HU Li, YIN Gao-fang, ZHAO Nan-jing, FU Qiang. Construction of Synthetic Characterization Parameters of Biotoxicity of Water Quality Based on Characteristics of Multiphase Fluorescence Kinetic Curve[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(7): 2319-2324.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)07-2319-06  
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基于多相荧光动力学曲线特征的水质生物毒性综合表征参数构建
胡丽1,2, 殷高方2,*, 赵南京2, 傅强1
1.合肥师范学院物理与材料工程学院, 安徽 合肥 230061
2.中国科学院安徽光学精密机械研究所, 中国科学院环境光学与技术重点实验室, 安徽 合肥 230031
*通讯作者 e-mail: gfyin@aiofm.ac.cn

作者简介: 胡 丽,女, 1981年生,合肥师范学院物理与材料工程学院副教授 e-mail: 442716134@qq.com

收稿日期: 2022-05-17 修回日期: 2022-07-20
基金: 国家重点研发计划项目(2021YFC3200100),安徽省科技重大专项(202203a07020002),安徽省杰出青年科学基金项目(1908085J23),国家自然科学基金项目(61875207),安徽省教育厅重点项目(KJ2021A0915),中国科学院环境光学与技术重点实验室开放基金项目(2005OP173065-2021-08),光电探测科学与技术安徽高校联合重点实验室项目(2020GDTC04), 2022年高校优秀青年骨干教师国内访学研修项目(皖教工委函〔2022〕371号),高校优秀拔尖人才培育项目(gxgnfx2021140)资助
摘要

基于藻类光合抑制效应的水质生物毒性检测方法, 具有响应快速、 测量简捷等优点。 然而现有十多种光合荧光参数都源于PSⅡ光合反应中心, 对典型的PSⅠ光合作用抑制剂, 均表现出响应灵敏度差或无响应。 利用毒性胁迫会引起藻类荧光动力学曲线发生变形、 且变化程度与毒性强度成正比的特性, 直接以多相叶绿素荧光动力学曲线形态为分析对象, 在准确定位特征位点的基础上, 构建基于曲线分段抑制的综合表征参数CPI, 并与常用的光合荧光参数 Fv/Fm以及性能指标PIabs进行毒性响应时间、 响应灵敏度和稳定性的对比分析。 结果表明, 综合参数CPI对于PSⅡ抑制剂阿特拉津, 15 min即在全样本表现出显著性抑制, 最低检测限和RSD分别为2.25 μg·L-1和8.76%, 对比PIabs、 Fv/Fm分别降低了51.8%、 51.3%和68.0%、 17.7%。 对于典型PSⅠ抑制剂百草枯, 综合参数CPI在15 min表现出显著性抑制, 对应的检测限和RSD分别为0.16 mg·L-1和14.25%, 而参数 Fv/Fm无响应, CPI具有时间响应优势; 在8 h长时抑制下, CPI对应的最低检测限和RSD分别为0.09 mg·L-1和3.30%, 对比PIabs、 Fv/Fm分别降低了71.9%、 62.5%和75.6%、 30.0%。 上述结论表明了综合参数CPI作为响应指标可用于检测PSⅠ及PSⅡ抑制剂的生物毒性, 且表现出良好的响应灵敏度和稳定性, 解决了藻类光合抑制法对PSⅠ抑制剂响应灵敏度低的问题, 且对于统一不同种类毒性物质的毒性响应指标提供了关键参数。

关键词: 生物光学; 生物毒性; 光合抑制效应; 综合参数; 毒性响应
中图分类号:X832 文献标志码:A
Construction of Synthetic Characterization Parameters of Biotoxicity of Water Quality Based on Characteristics of Multiphase Fluorescence Kinetic Curve
HU Li1,2, YIN Gao-fang2,*, ZHAO Nan-jing2, FU Qiang1
1. School of Physics and Materials Engineering, Hefei Normal University, Hefei 230061, China
2. Key Laboratory of Environmental Optics and Technology, Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China
*Corresponding author
Abstract

There are advantages of quick response and simple measurement in the water biological toxicity detection method based on the photosynthetic inhibition effect of algae. However, more than ten photosynthetic fluorescence parameters are derived from the PSⅡphotosynthetic reaction center, showing poor sensitivity or no response to typical PSⅠphotosynthetic inhibitors. In this paper, based on the characteristic that toxic stress will cause deformation of algae fluorescence kinetics curve, and the change degree is proportional to the toxicity intensity, the morphology of the multiphase chlorophyll fluorescence kinetics curve is directly taken as the analysis object. Based on the accurate location of the characteristic sites, a comprehensive characterization parameter CPI based on the segmentation inhibition of the curve is constructed. The toxicity response time, response sensitivity and stability were compared with the commonly used photosynthetic fluorescence parameters Fv/Fm and the comprehensive fluorescence parameter PIabs. The results showed that for paraquat, a typical PSⅠinhibitor, the comprehensive parameter CPI showed significant inhibition at 15 min (1 mg·L-1 and above), while Fv/Fm had no response. Compared with PIabs and Fv/Fm, the minimum detection limit and relative standard deviation decreased by 70.3% and 24.1% and 75.6% and 30.0%, respectively, under 8h stable inhibition. Atrazine, a PSⅡinhibitor, showed significant inhibition in the whole concentration range of samples within 15 min, and the minimum detection limit and relative standard deviation decreased by 52.4% and 51.6% and 75.6% and 30.0%, compared with PIabs and Fv/Fm. These conclusions indicate that the comprehensive parameter PICTE, as a response index, can be used to detect the biotoxicity of PSⅠand PSⅡinhibitors, and it shows good response sensitivity and stability. The results of this study provide an important parameter for highly sensitive and high-precision detection of biotoxicity in water based on algae photosynthetic inhibition.

Keyword: Biotechnology; Biotoxicity; Photosynthetic inhibition effect; Synthetic parameter; Toxicity response
引言

藻类作为生态系统初级单细胞生物, 对毒物敏感、 世代周期短、 易于培养、 可直接观察细胞水平上的中毒症状, 是理想的生物毒性受试生物[1]。 区别于生长抑制方法采用细胞密度、 细胞产量和生长速率为反应终点, 光合荧光参数能够实时反映活体细胞光合作用状态, 是更为快速敏感的藻类生物毒性测试反应终点[2]。 叶绿素荧光动力学过程根据其变化趋势和发生时间分为快相荧光和慢相荧光两个阶段, 目前快相荧光机理研究已形成较为完整的体系[3, 4], 现有十多种光合荧光参数都源于快相荧光, 这些参数能够反映捕光色素吸收、 PSⅡ反应中心、 QA、 QB、 PQ等电子受体氧化还原状态, 但无法分析PSⅠ及其后面的光合能流过程[5]。 慢相荧光已被证明与PSⅠ反应中心状态、 非光化学猝灭, ATP合成, 卡尔文循环等过程密切相关[6], 但由于慢相荧光形成机理至今尚不明晰、 缺乏相关理论模型及表征参数, 至今其所蕴含的光合作用信息仍无法有效使用[7]。 因此, 以现有光合荧光参数为表征的藻类光合抑制法对百草枯、 敌草快等典型的PSⅠ光合作用抑制剂, 均表现出响应灵敏度差或无响应。

鉴于此, 本文另辟蹊径, 利用毒性胁迫会引起藻类荧光动力学曲线发生变形、 且变化程度与毒性强度成正比这一特点, 直接以多相叶绿素荧光动力学曲线形态为分析对象, 构建一种基于曲线分段抑制的水体生物毒性综合表征参数CPI(comprehensive parameter index), 并将CPI与常用的光合荧光参数Fv/Fm以及Strasser[8]构建的性能指标PIabs, 在毒性响应时间、 响应灵敏度和稳定性三个方面进行对比分析, 检验综合参数CPI作为响应指标在检测PSⅠ及PSⅡ抑制剂生物毒性中的有效性和稳定性。

1 基于曲线分段抑制的综合参数构建

多相叶绿素荧光动力学曲线包含O、 J、 I、 P、 S、 M、 T七个相点, 如图1(a)所示。 毒性物质作用不同特征位点, 导致被作用的特征位点处电子传递链被打断、 电子受体被阻塞, 正常光合作用过程被阻断, 对应的荧光动力学曲线特征相点的位置及相点之间的荧光曲线线型发生变化, 如图1(b)所示。 基于此, 本文从以下两个方面构建藻类光合作用状态的综合表征参数CPI: (1)准确跟踪毒性物质胁迫下的多相叶绿素荧光动力学曲线O、 J、 I、 P、 S、 M、 T相位特征时间, 这是构建基于曲线分段抑制综合表征参数的前提[9]。 (2)在准确定位多相叶绿素荧光动力学曲线各相位的基础上, 最大程度提取、 整合各相之间曲线形变信息, 这是构建综合表征参数的关键。

图1 (a)藻类叶绿素荧光诱导动力学曲线示意图(仿Stirbet[10])、 (b)阿特拉津和百草枯胁迫下的荧光动力学曲线Fig.1 (a) Schematic diagram of chlorophyll fluorescence induction kinetics curve of algae, (b) Fluorescence kinetics curves under Atrazine and Paraquat stress

1.1 多相叶绿素荧光动力学曲线相位跟踪

通过曲线起点、 终点和最大值分别确定O、 T和P相位; J、 I、 S、 M是曲线上的瞬态相位[9], 当光合作用位点的供体侧氧化与受体侧还原速率平衡时, 曲线上升或下降趋势变缓, 出现相位点, 即曲线拐点, 因此通过分析曲线上的局部曲率最大值, 便能够快速定位各相位点出现的时间。 曲线曲率具体计算过程如下: 首先, 曲线采用(1)式所示的N阶多项式进行拟合, 随着多项式阶数N的增加, 拟合误差减小并趋于平稳时的N值选为最终的阶数期望值。

F=∑n=0NanTn(1)

式(1)中, F为荧光强度、 横坐标T是时间t的对数、 an是多项式系数、 n是多项式次数、 N为拟合多项式的阶数。

然后, 利用式(2)和式(3)求得拟合曲线的一阶导数和二阶导数, 再通过式(4)计算出曲线上各点的曲率, 最后对曲率取对数让曲率变化更加明显, 从而实现J、 I、 S、 M相位准确定位。

F'=∑n=1NannTn-1(2)

F″=∑n=2Nann(n-1)Tn-1(3)

k=|F″|(1+F'2)3/2(4)

1.2 综合表征参数CPI构建

毒性物质作用藻类某些特征位点或光合作用过程时, 最终都会引起与位点或过程相关的荧光上升或者下降, 进而导致O-J、 J-I、 I-P、 P-S、 S-M、 M-T曲线下方包围面积发生变化, 且相面积变化程度直接反映了毒性物质对藻类的抑制程度。 鉴于此, 通过对比空白样本, 得到O-J、 J-I、 I-P、 P-S、 S-M、 M-T相面积的抑制率, 并对所有相面积抑制率数据项加和, 获得基于曲线分段抑制的综合表征参数CPI, 该参数理论上可全面反映毒性物质对藻类所有光合作用位点或过程的抑制程度。

图2 藻类光合抑制效应的综合表征参数构建示意图Fig.2 Schematic diagram of synthetic characterization parameters of photosynthetic inhibition effect for algae

(1)曲线分段相面积

为了消除实验条件(如受试藻浓度、 荧光探测灵敏度)对荧光绝对强度的影响, 进而影响曲线分段相面积计算, 首先采用最大值归一化方法对荧光曲线进行归一化处理; 其次, 由于曲线各相间时长存在量级上的差异, 为了平衡各相间曲线线型表征光合抑制效应的贡献率, 将时间取对数; 最后通过式(5)计算曲线分段相面积, 式中F(T)是归一化后的荧光强度, T为对数时间, A、 B是曲线起止相位, 例如OJ相面积SOJ是O相位到J相位曲线段下方与坐标轴围成的面积。

SAB=∫TATBF(T)dT(5)

(2)曲线分段抑制率及综合参数CPI

曲线分段抑制率利用式(6)计算, YAB为曲线在AB相之间的抑制率, SAB-0为空白样本AB相之间的曲线包围面积; SAB为实验样本AB相之间的曲线包围面积。

YAB=SAB-0-SABSAB-0×100%(6)

为了防止数据项加和过程中抑制率的正负抵消一部分曲线形变信息, 先对各分段抑制率取绝对值再进行数据项加和。 同时, 为解决曲线分段面积大小不同带来的权重差异, 利用曲线上部分包围面积抑制率和下部分包围面积抑制率的均值, 构建综合表征参数CPI。

CPI=∑[ABS(Y'AB)+ABS(Y″AB)]/2(7)

式(7)中, CPI是综合表征参数, Y'AB表示AB相之间上部分包围面积抑制率, Y″AB表示AB相之间下部分包围面积抑制率, 其中AB相包含OJ、 JI、 IP、 PS、 SM、 MT段。

2 实验测量与结果
2.1 实验测量

实验以常见淡水藻蛋白核小球藻为受试生物, 选取两种典型的作用位点抑制剂: 阿特拉津(Atrazine, 抑制位点在PSⅡ中心的QA处[10])、 百草枯(Paraquat, 抑制位点在PSⅠ反应中心FA/FB处[10])。 多相叶绿素荧光动力学曲线通过可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪(AGHJ-TPLIF-I, 中科院安徽光机所研制)测量[11](该技术采用光电直流检测方式, M点和T点噪音干扰较大, 本文仅分析OJIPS点, 并加入F300特征点)。 蛋白核小球藻选种及扩大培养方法同参考文献[12], 毒性物质用去离子水配制, 并根据实验需要进一步稀释成不同浓度工作液, 阿特拉津浓度梯度为0.25、 0.5、 2.5、 5、 10、 25、 50、 100和200 μg·L-1, 百草枯浓度梯度为0.25、 0.5、 2.5、 5、 10、 25、 50、 100和200 mg·L-1, 每个样品设置3个平行样。

2.2 实验结果

(1)时间响应灵敏度

对两种毒性物质分别进行15 min、 80 min、 4 h、 8 h和24 h胁迫实验, 根据上文相位跟踪分析方法, 得到蛋白核小球藻在阿特拉津和百草枯抑制下的相位位置。 结果表明, 两种毒性物质对应的相位O、 F300、 J、 I、 S位置基本相同, 分别位于31 μs、 301 μs、 2.02 ms、 30.3 ms、 1.46 s, 其中P点位置随浓度变化差异较大, 与已有文献结论一致[13]。 在准确定位特征位点的基础上, 利用单因素方差分析(one-ANOVA)方法计算不同抑制时间下实验组与空白组之间的显著性差异, 获得参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs时间响应特性。 结果如表1所示, 在阿特拉津抑制15 min后, 参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs在全浓度范围内均表现出显著性差异(p<0.01), 因此, 选择15 min作为阿特拉津抑制实验的时间节点。 百草枯抑制15 min后, CPI、 PIabs在1 mg·L-1及以上浓度上表现出显著性差异(p<0.05), 但Fv/Fm在全浓度范围内均未表现出显著性差异(这与已有研究结果一致, Fv/Fm对PSⅠ抑制剂响应灵敏度差或无响应); 抑制8 h后, CPI、 Fv/Fm、 PIabs在全浓度范围表现出显著性差异(p<0.01)。 因此, 满足百草枯中高浓度样液快速测量需求, 可以选择15 min作为时间节点, 采用综合参数CPI、 性能指标PIabs作为响应指标; 对于中低浓度样液, 可以选择8 h作为时间节点。 综上, 参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs均可以作为阿特拉津和百草枯的毒性响应参数, 但CPI、 PIabs在PSⅠ抑制剂百草枯的毒性检测中, 具有时间响应优势。

图3 可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪结构示意图Fig.3 Schematic diagram of chlorophyll fluorescence analyzer induced by variable light pulse

表1 CPI、 Fv/Fm、 PIabs实验组与空白组之间的差异性分析结果 Table 1 Difference analysis results of the experimental groups and blank groups among CPI, Fv/Fm and PIabs

(2)浓度响应灵敏度

分析参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs在阿特拉津15 min抑制、 百草枯8 h长时抑制和15 min短时抑制的剂量-效应关系, 符合生物毒性实验反“S”形, 以阻滞增长模型(Logistic)为基础进行非线性拟合[14], R2均大于0.925(如图4—图6所示)。 在此基础上, 建立低浓度毒性物质的线性剂量-效应关系(如图4—图6所示), 根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对最低检测限的定义, 利用式(8)计算以参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs为响应指标的毒性物质最低检测限, 且以最低检测限表示不同参数对毒性效应的响应灵敏度。

LOD=(3*Sb)/M(8)

式(8)中, Sb为空白样品多次测量的标准偏差(本研究中空白样品重复测量20次); M为线性剂量效应曲线的斜率。 以参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs为响应指标的阿特拉津、 百草枯最低检测限如表2所示。 结果表明, 对于典型PSⅠ和PSⅡ抑制剂, 以综合参数CPI为响应指标所获得的检测限最低。 其中, 阿特拉津15 min抑制, CPI与常用参数Fv/Fm和性能指标PIabs相比, 检测限分别降低了51.8%、 51.3%; 对于百草枯15 min抑制, CPI的检测限比PIabs降低了89.3%, 参数Fv/Fm无响应; 对于百草枯8h抑制, CPI对比Fv/Fm和PIabs, 检测限分别降低了71.9%、 62.5%。 因此, 以综合参数CPI为毒性响应指标, 更有利于提高藻类光合抑制法水体生物毒性的检测灵敏度。

图4 阿特拉津15 min抑制下(a)CPI、 (b)Fv/Fm、 (c)PIabs对应的剂量-效应关系
CPI, Fv/Fm, PIabs对应空白样的RSD分别为0.66%, 0.28%, 2.60%Fig.4 Dose-effect relationships of (a) CPI, (b) Fv/Fm, (c) PIabs for atrazine with 15 minutes inhibition

图5 百草枯8h抑制下(a)CPI、 (b)Fv/Fm、 (c)PIabs对应的剂量-效应关系
CPI, Fv/Fm, PIabs对应的空白样RSD分别为0.82%, 0.52%, 1.44%Fig.5 Dose-effect relationships of (a) CPI, (b) Fv/Fm, (c) PIabs for paraquat with 8 hours inhibition

图6 百草枯15 min抑制下(a)CPI、 (b) PIabs对应的剂量-效应关系
CPI, PIabs对应的空白样RSD分别为0.66%, 2.6%Fig.6 Dose-effect relationships of (a) CPI, (b) PIabs for paraquat with 15 minutes inhibition

表2 CPI、 Fv/Fm、 PIabs为响应指标的毒性物质最低检测限 Table 2 The lowest detection limits of toxic substances for with CPI, Fv/Fm and PIabs used as the response indexes

(3)响应稳定性

为了对比参数CPI、 Fv/Fm、 PIabs作为响应指标的稳定性, 计算平行样相对标准偏差RSD, 用以表示毒性检测的稳定性。 结果如表3所示, 阿特拉津15 min毒性胁迫下, CPI的RSD平均值是8.76%, 相对PIabs和Fv/Fm, 分别降低了68.0%、 17.7%。 百草枯15 min短时抑制下, 对于1 mg·L-1及以上浓度样本, CPI的RSD平均值是14.25%, 相对PIabs降低了63.3%; 百草枯8 h长时胁迫下, CPI的RSD平均值是3.30%, 相对于PIabs和Fv/Fm, 分别降低了75.6%、 30.0%。 上述结果表明, 稳定性最好的参数是CPI, 其次是Fv/Fm, 稳定性相对较差的是PIabs。 这与参数的构建方式密切相关, CPI采用多个数据项加和的方式, 而PIabs采用三个数据项连乘的方式, 连乘将放大单个数据波动对整个环节的影响, 数据稳定性降低; 参数Fv/Fm由初始荧光和最大荧光决定, 受单点荧光强度影响较大, 相比综合参数CPI, 更容易受测量环境干扰。

表3 CPI、 Fv/Fm、 PIabs对两种毒性物质的RSD Table 3 RSD of two toxic substances with CPI, Fv/Fm and PIabs used as the response indexes
3 结论

直接以多相叶绿素荧光动力学曲线形态为分析对象, 在准确定位特征相位的基础上, 构建基于曲线分段抑制的综合表征参数CPI, 并与常用的光合荧光参数Fv/Fm以及性能指标PIabs进行毒性响应时间、 响应灵敏度和稳定性的对比分析。 结果表明, 对于PSⅡ抑制剂阿特拉津, 综合参数CPI表现优异, 15 min即在全样本表现出显著性抑制, 相对于PIabs、 Fv/Fm, 最低检测限和RSD分别降低了51.8%、 51.3%和68.0%、 17.7%。 同时, 对于典型PSⅠ抑制剂百草枯, 综合参数CPI在15 min即表现出显著性抑制, 而参数Fv/Fm无响应, CPI具有时间响应优势; 在8 h长时抑制下, CPI相对于PIabs、 Fv/Fm, 最低检测限和RSD分别降低了71.9%、 62.5%和75.6%、 30.0%, 表现出良好的响应灵敏度和稳定性。 上述结论验证了综合参数CPI作为PSⅠ及PSⅡ抑制剂生物毒性响应指标的有效性和稳定性, 解决了藻类光合抑制法对PSⅠ抑制剂响应灵敏度差的问题。 接下去将开展更多毒性物质的实验验证工作, 以期在优化藻类光合抑制法综合表征参数的同时, 统一不同种类毒性物质的毒性响应指标。

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