引用本文
张椰莉, 程建伟, 董晓婷, 边六交. 多光谱方法结合理论计算探究金属β-内酰胺酶SMB-1与亚胺培南之间的相互作用[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(7): 2287-2293.
ZHANG Ye-li, CHENG Jian-wei, DONG Xiao-ting, BIAN Liu-jiao. Structural Insight Into Interaction Between Imipenem and Metal β-Lactamase SMB-1 by Spectroscopic Analysis and Molecular Docking[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(7): 2287-2293.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)07-2287-07  
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多光谱方法结合理论计算探究金属β-内酰胺酶SMB-1与亚胺培南之间的相互作用
张椰莉1,2, 程建伟3, 董晓婷2, 边六交2,*
1.太原师范学院生物系, 山西 晋中 030619
2.西北大学生命科学学院, 陕西 西安 710069
3.太原师范学院地理科学学院, 山西 晋中 030619
*通讯作者 e-mail: bianliujiao@sohu.com

作者简介: 张椰莉,女, 1992年生,太原师范学院生物系讲师 e-mail: zhangyeli321@163.com

收稿日期: 2022-03-24 修回日期: 2022-09-02
基金: 国家自然科学基金项目(31971143),山西省基础研究计划项目(202103021223327)资助
摘要

金属β-内酰胺酶(MβLs)可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素, 这是导致细菌感染治疗中产生耐药性的主要机制。 迄今为止, 由于缺乏临床批准的抑制剂, 这已成为全球关注的问题。 最近来自粘质沙雷氏菌的SMB-1被发现是一种新型的B3亚类MβL, 它可以灭活几乎所有含β-内酰胺环的抗生素。 为了明确SMB-1与β-内酰胺类抗生素的特异性分子识别和作用机制, 采用内源性荧光光谱、 同步荧光光谱、 三维荧光光谱及分子对接方法对碳青霉烯类抗生素亚胺培南(IMIP)与金属β-内酰胺酶SMB-1之间的相互作用机制进行探究。 猝灭光谱结果表明IMIP可以使SMB-1内源性荧光猝灭, 且猝灭机制为动态和静态组合猝灭, 其中静态猝灭为主, 结合常数 Ka为16.11×103 L·mol-1(277 K), 表明两者之间具有很强的结合力; 根据Van't Hoff方程得出结合过程中的热力学参数Δ G<0, Δ H=-79.65 kJ·mol-1, Δ S=-238.69 J·mol-1, 说明两者的结合是由焓变和熵变共同驱动的, 且氢键和范德华力为主要作用力; 同步荧光结果中, 随着IMIP浓度的增加, SMB-1最大发射波长均发生蓝移4.4和2.9 nm, 表明Tyr和Trp残基参与IMIP与SMB-1的结合过程; 三维荧光光谱中IMIP加入后, SMB-1的Peak B和Peak C强度显著降低, 表明SMB-1与IMIP作用之后的微环境和构象发生了改变, 与同步荧光结果一致。 分子对接结果中IMIP的β-内酰胺环进入SMB-1的结合口袋, 而侧链因空间位阻效应位于活性口袋的外部, 表明SMB-1主要是识别IMIP的核心结构, 与其R2侧链的作用较弱; 与IMIP参与作用的氨基酸残基包括Ser175, Thr177, Gln157, His215和Glu217, 表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的SMB-1抑制剂的关键因素; 结合自由能也为负值, 表明两者的结合是一个自发放热的过程, 与荧光结果一致。 该研究提供了对SMB-1与IMIP的识别和结合的见解, 可能有助于设计β-内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。

关键词: 金属β-内酰胺酶SMB-1; 亚胺培南; 荧光光谱; 分子对接; 相互作用
中图分类号:TS201.2 文献标志码:A
Structural Insight Into Interaction Between Imipenem and Metal β-Lactamase SMB-1 by Spectroscopic Analysis and Molecular Docking
ZHANG Ye-li1,2, CHENG Jian-wei3, DONG Xiao-ting2, BIAN Liu-jiao2,*
1. Department of Biology, Taiyuan Normal University, Jinzhong 030619, China
2. College of Life Science, Northwest University, Xi'an 710069, China
3. Institute of Geographical Science, Taiyuan Normal University, Jinzhong 030619, China
*Corresponding author
Abstract

Metallo-β-lactamases (MβLs) could hydrolyze almost all β-lactam antibiotics, the primary mechanism resulting in drug resistance against bacterial infections. This has become a substantial concern due to the lack of clinically approved inhibitors. SMB-1 from Serratia marcescents is a novel B3 subclass MβL that inactivates almost all β-lactam-containing antibiotics. The interaction mechanism between carbapenem antibiotic imipenem (IMIP) and Metallo-β-lactamase SMB-1 was ascertained in this paper using endogenous fluorescence spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy, three-dimensional fluorescence spectroscopy and molecular docking methods. The quenching spectrum results demonstrated that IMIP quenched endogenous fluorescence of SMB-1, and the quenching mechanism was a combination of dynamic and static quenching, of which static quenching is the core one; the binding constant Ka was 16.11×103 L·mol-1 (277 K), indicating a strong binding force between them; the thermodynamic parameters in the binding process obtained from the Van't Hoff equation Δ G<0, Δ H=-79.65 kJ·mol-1, Δ S=-238.69 J·mol-1, illustrating that the binding was driven by both enthalpy and entropy changes and hydrogen bonding and van der Waals forces were the main forces; Moreover, the maximum emission wavelength of SMB-1 in synchronous fluorescence results was blue shifted by 4.4 and 2.9 nm with increasing IMIP concentration, revealing that Tyr and Trp residues were involved in both. The significant decrease of Peak B and Peak C intensity of SMB-1 with IMIP introduced in the three-dimensional fluorescence spectra indicated that the microenvironment and conformation of SMB-1 changed after the interaction with IMIP, which is consistent with the synchronous fluorescence results. Furthermore, the β-lactam ring of IMIP entered the binding pocket of SMB-1 in the molecular docking results, while the side chain was located outside the active pocket due to the spatial site block effect, inferring that SMB-1 mainly recognized the core structure of IMIP and interacted weakly with its R2 side chain; the amino acid residues involved in the interaction with IMIP including Ser175, Thr177, Gln157, His215 and Glu217, implying that these amino acid residues with the two zinc ions in the active site are key factors in the design of SMB-1 inhibitors with strong affinity; the binding free energy was also negative, suggesting that the binding of both was a spontaneous exothermic process, which is consistent with the fluorescence results. Therefore, the present study provides insights into the recognition and binding of SMB-1 to IMIP, which may help design new substrates for β-lactamases and develop new antibiotics with resistance to superbugs.

Keyword: SMB-1 from Serratia marcescents; Imipenem; Fluorescence spectra; Molecular docking; Interaction
引言

近年来, 致病性“超级细菌”中金属β-内酰胺酶(metallo-beta-lactamase, MβLs)的出现, 已引起了人们极大的关注。 它能够使绝大多数的β-内酰胺类抗生素失效, 包括碳青霉烯抗生素, 进而使细菌产生耐药性演变为“超级细菌”[1, 2]。 因此, 研究金属β-内酰胺酶与抗生素的作用机制是解决细菌耐药性的前提。 依据序列相似性和锌结合模式, 金属β-内酰胺酶分为三个子类B1, B2和B3[3], 其中, B2是单锌酶, 活性位点只需要1个锌离子参与, 而B1和B3是双锌酶, 活性位点需要2个锌离子维持[3, 4]。 虽然序列彼此之间同源性有差异, 但是它们几乎可以水解全部的β-内酰胺类抗生素, 且目前临床上没有显著的抑制剂被报道, 已逐渐威胁到全球人类的生命健康。

金属β-内酰胺酶SMB-1作为B3亚类的新成员, 据报道从肠杆菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescents)中鉴定出来, 其对头孢菌素和碳青霉烯类抗生素均具有高效的催化活性[5, 6, 7, 8]。 锌离子活性位点与其他B3成员一致, Zn1结合位点由His72、 His74、 His150和W701组成, Zn2结合位点Asp76、 His77, His215和W702组成, 其中锌配位的H2O/OH-作为亲核试剂, 促进催化水解反应的发生[8, 9]。 Mu等通过量子力学和分子动力学组合模拟了SMB-1与氨苄西林的水解过程得出β-内酰胺开环反应会生成保守的氮阴离子中间体, 在所得的氮阴离子和Zn2之间形成新的连接[10]。 Wachino等解析SMB-1与水解的碳青霉烯类抗生素的复合物, 得出水解机制[9], 但是未进行水解前的物理识别过程, 即结合过程中的分子识别和相互作用的研究。 尽管SMB-1的晶体结构已被解析, 但是与抗生素复合物的晶体结构还未获得。 因此, 通过了解SMB-1和底物抗生素之间的分子识别机制, 可能对进一步研发SMB-1抑制剂具有重要意义。 本研究选取亚胺培南为(imipenem, IMIP)碳青霉烯类抗生素的代表, 联合使用光谱学和分子对接方法, 探讨了IMIP与SMB-1之间的相互作用机制, 也为未来新型抗生素药物的开发提供一些参考和启发。

图1 SMB-1的活性口袋(a)和亚胺培南结构式(b)Fig.1 Active pocket of SMB-1 (a) and structural formula of imipenem (b)

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

金属β-内酰胺酶SMB-1(西北大学边六交教授实验室提供), 亚胺培南(美国Sigma公司), NaH2PO4、 Na2HPO4和ZnCl2均为分析纯, 实验用水为均去离子水。

Cary Eclipse荧光分光光度计(美国安捷伦公司), PHSJ-3F型pH值测定仪(上海雷磁有限公司), XS105DU分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司), TP 214型精细电子天平(美国Denve: 公司), IM-20型制冰机(河南天驰卓达有限公司), ELx800酶标仪(Bio-Tekt宝特)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

缓冲液: 配置20 mmol·L-1磷酸盐溶液(pH 7.4)和0.20 mmol·L-1 ZnCl2溶液, 室温保存。

SMB-1储备液: 用缓冲液配制浓度为2.0×10-6 mol·L-1的SMB-1储备液, 4 ℃保存备用。

亚胺培南(IMIP)储备液: 用缓冲液配制浓度为1.0×10-4 mol·L-1的IMIP储备液, -20 ℃分装保存备用。

1.2.2 SMB-1与IMIP相互作用的猝灭荧光光谱测定

将1.0 mL SMB-1储备液置于10 mm石英比色皿中提前预冷, 并添加不同浓度的IMIP溶液, 使SMB-1与IMIP的最终浓度之比分别为1∶0, 1∶1, 1∶2, 1∶4, 1∶6, 1∶8, 1∶10和1∶11。 在激发波长278 nm处测定不同温度277、 281和285 K下的猝灭荧光, 参数设置如下: 激发和发射狭缝宽度均为10 nm, 扫描速度1 200 nm·min-1, 扫描范围200~400 nm, 电压700 V。 以20 mmol·L-1 PBS缓冲液和不同浓度亚胺培南为空白对照, 每个样品重复测量三次。

1.2.3 SMB-1与IMIP相互作用的同步荧光光谱测定

将1.0 mL SMB-1溶液(1×10-6 mol·L-1)置于10 mm石英比色皿中提前预冷, 并添加不同浓度的IMIP溶液, 使SMB-1与IMIP的最终浓度之比分别为1∶0, 1∶20, 1∶40, 1∶60, 1∶80, 1∶100, 1∶150和1∶200, 加样总体积尽量小于10.0 μL。 分别在Δλ为15和60 nm下进行同步荧光测定, 扫描参数设置如上, 扫描范围260~320 nm。

1.2.4 SMB-1与IMIP相互作用的三维荧光光谱测定

分别测定SMB-1与SMB-1-IMIP复合物的三维荧光光谱, SMB-1与IMIP终浓度比为1∶10, 其中参数设置如下: 激发和发射波长扫描范围分别为220~300和280~400 nm, 记录波长间隔为2 nm, 其余参数设置同上。

1.2.5 SMB-1与IMIP之间的分子对接研究

SMB-1的晶体结构(3vpe)是从RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)获得的, IMIP的结构来自于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。 在分子对接之前, SMB-1中水分子和杂原子通过PyMOL软件进行处理, IMIP结构通过MOE软件实现能量最小化和质子化。 采用Autodock 4.2程序展开对接, 通过半柔性对接方法和Lamarckian遗传算法预测SMB-1与IMIP的相互作用信息。 基于合理的结合位点和最小的结合自由能选择最佳的结合构象, 并对其采用Chimera和Discovery studio软件进行可视化作图。

2 结果与讨论
2.1 猝灭荧光光谱测定

Wachino等报道了, 在303 K下, SMB-1与IMIP相互作用时的Km为133 μmol·L-1, kcat为518 s-1, kcat/Km(μM-1·s-1)为3.9×10-6, 表明在此温度下SMB-1对IMIP的水解效率较低[6]。 因此, 可通过降低温度来降低水解速率, 从而延长分子识别时间(物理反应)和水解时间(化学反应)。 基于此背景, 本研究在277 K和2 min内完成荧光光谱的测定, 且在实验过程中, IMIP过量, SMB-1与IMIP一直处于互作状态, 可认为实际测定的光谱数据来自于SMB-1与IMIP的复合物。 因此, 荧光光谱分析可用于分析IMIP与SMB-1之间的相互作用。

SMB-1分子中含有4个Trp、 5个Tyr和7个Phe, 这些氨基酸残基使得其产生很强的内源性荧光, 在278 nm处激发, 最大发射峰出现在340.4 nm, 而IMIP无荧光发射, 对实验不产生“内滤光效应”干扰。 在模拟人体生理条件下, 不同浓度IMIP对SMB-1荧光光谱影响结果见图2。 随着IMIP浓度不断增加, SMB-1荧光强度呈现明显减弱趋势, 但荧光发射峰位置和峰形没有明显变化, 说明在IMIP与SMB-1 相互作用过程中, 它们之间形成了非共价键而不是共价键。

图2 不同浓度下IMIP对SMB-1的猝灭光谱图
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=(0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11)×10-6 mol·L-1(从上至下), T=277 K, λ=278 nmFig.2 Quenching spectra of SMB-1 with the additions of IMIP at different concentrations
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=(0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 11)×10-6 mol·L-1(from top to bottom), T=277 K, λ=278 nm

2.2 相互作用机制分析

2.2.1 荧光猝灭机制

物质的荧光猝灭通常可以由动态猝灭、 静态或动静态猝灭引起[11, 12]。 对于IMIP诱导SMB-1的荧光猝灭可通过Stern-Volmer等式展开分析[13]

F0F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q](1)

式(1)中, F0和F分别表示不存在和存在IMIP的情况下SMB-1的荧光发射强度; kq为动态猝灭速率常数; τ 0为在没有猝灭剂的情况下荧光基团的平均寿命, 相对于生物大分子约10-8 s[13]; KSV为Stern-Volmer猝灭常数; [Q]为溶液中IMIP的浓度。 通过温度与激发态寿命之间的关系, 可以区分动态或静态猝灭。 对于动态猝灭, 较高的温度将带来更快的扩散和更多的随机碰撞猝灭, 因而荧光猝灭常数将随温度的升高而增加, 而在静态猝灭中则相反[13, 14]。 从式(1)中可看出, 无论是动态还是静态猝灭, F0/F与[Q]的关系是线性的。 然而, 对于动态和静态猝灭的组合, F0/F与[Q]的关系是非线性, 可用修正的Stern-Volmer式(2)来解释[15]。

F0F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])=1+(KD+KS)[Q]+KDKS[Q]2(2)

在此, KD和KS代表猝灭过程中的动态和静态猝灭常数。 对各种浓度IMIP配制的溶液, 分别测定277、 281和285 K下SMB-1的荧光发射光谱。 从图3可以看出, F0/F与[Q]的关系是非线性的, 表明SMB-1与IMIP的荧光猝灭机制可能是由动态和静态猝灭相结合引起的, 猝灭速率常数kq均远大于最大动态猝灭常数(2.0×1010 L·mol-1·s-1), 进一步证明了荧光猝灭过程主要是静态猝灭主导。

图3 不同温度下IMIP对SMB-1的Stern-Volmer曲线Fig.3 Stern-Volmer curves of SMB-1 with the additions of IMIP at different temperatures

表1 不同温度下IMIP对SMB-1的猝灭常数和速率常数测定 Table 1 Determination of the quenching constants and rate constants of SMB-1 by IMIP at different temperatures

2.2.2 结合常数

在猝灭过程中, 酶与配体(Ka)的结合常数可通过式(3)推导[16]。

FF0=　1-Φ(Kd+nP0+Q)-(Kd+nP0+Q)2-4nP0Q2nP0(3)

式(3)中, F0, F和[Q]与式(1)中的相同; Φ 为荧光比; Kd为等于1/Ka的解离常数, 其中Ka指结合常数; P0是指蛋白质浓度; n是结合位点的数量, 许多研究表明金属β-内酰胺酶与抗生素之间形成1∶1的复合物(n=1)[17]。 此外, 该方程还存在两个限制条件: 添加的配体浓度约等于游离配体浓度, 并且生成的复合物不产生荧光(Φ =1)[18]。 根据式(3)在三种不同的温度277、 281和285 K下, 对F/F0与Q进行了非线性拟合, 并分别获得了SMB-1与IMIP结合的特征参数Ka。 从表2中可以看出, 随着温度从277 K升高到284 K, 对于SMB-1与IMIP的结合, Ka值从16.11×103降低到6.63×103。 说明温度显著影响SMB-1与IMIP的结合。

图4 不同温度下IMIP与SMB-1相互作用的F/F0对Q的拟合曲线Fig.4 The fitting curves of F/F0 against Q for the interaction of IMIP with SMB-1 at different temperatures

表2 不同温度下IMIP对SMB-1的结合常数及热力学参数测定 Table 2 Determination of binding constants and thermodynamic parameters

2.2.3 热力学参数和结合力

在蛋白质与配体的结合过程中, 存在以下非共价相互作用: 疏水相互作用, 静电力, 氢键和范德华力。 根据Ross定律可知: (1)ΔH>0, ΔS>0, 主要的相互作用力是疏水相互作用; (2)ΔH<0, ΔS>0, 主要的相互作用力是静电相互作用; (3)ΔH<0, ΔS<0, 主要的相互作用力是氢键相互作用和范德华力[18], 可通过式(4)计算

lnKa=-ΔHR1T+ΔSR(4)

式(4)中, R为气体常数(8.314 J·K-1·mol-1), T为温度, Ka是相应温度T的结合常数。 因此, 可以从截距和斜率得出ΔH、 ΔS和lnKa对1/T的关系。 从式(5)可以进一步计算出自由能ΔG

ΔG=ΔH-TΔS(5)

如表2所示, 所有ΔG和ΔH均为负, 表明SMB-1与IMIP的结合是自发的且放热的。 ΔH为负, ΔS为负, 表明它们之间的结合是由焓变和熵变共同驱动的, 结合力主要为氢键相互作用和范德华力。

2.3 同步荧光分析

同步荧光可以提供发色团附近分子环境的相关信息, 通常用于探索蛋白质氨基酸残基微环境的变化[19, 20]。 当波长差Δλ为60和15 nm时, 所得光谱分别代表色氨酸和酪氨酸残基的光谱特征, 而且每个氨基酸残基的最大发射波长的位置受其微环境的极性影响。 最大发射波长向左移, 即发生蓝移, 表明分子微环境的疏水性增加; 而向右移为红移表明微环境的疏水性降低[21]。 图5为277 K下SMB-1与不同浓度的IMIP作用时的同步荧光光谱。 从图中可以看出, 随着IMIP浓度的增加, 荧光强度都在降低, 最大发射波长均发生蓝移4.4和2.9 nm, 表明SMB-1中色氨酸和酪氨酸残基的微环境受IMIP的影响, 均发生变化, 即SMB-1与IMIP发生诱导契合效应。 在SMB-1分子中, 分别有1个Tyr和1个Trp位于结合口袋附近, 增加疏水性利于IMIP的结合。

图5 不同浓度IMIP对SMB-1 Δλ=15 nm(a)和60 nm(b)同步荧光光谱结果
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=(0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20)×10-5 mol·L-1(从上至下), T=277 KFig.5 The synchronous fluorescence spectra of SMB-1 with the additions of IMIP for Δλ of 15 nm(a)and 60 nm(b)
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=(0, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20)×10-5 mol·L-1(from top to bottom), T=277 K

2.4 3D荧光光谱分析

3D荧光光谱常广泛应用于探索蛋白质的构象变化。 图6为277 K有无IMIP存在下SMB-1的3D荧光光谱[22, 23]。 其中, 峰A表示瑞利散射峰(λex=λem), 峰B表示Trp和Tyr残基的光谱信息, 峰C代表二阶散射峰, 主要显示多肽骨架的光谱信息。 如图6所示, 与未加IMIP[图6(a)]相比, 加入IMIP[图6(b)]后, SMB-1的峰B从278.0/334.0 nm移至278.0/338.0 nm, 荧光强度从4 047降低到2 955; 峰C从226.0/334.0 nm移至224.0/340.0 nm, 荧光强度由1 598降至1 193, 这意味着SMB-1的微环境和构象均发生了变化, 与同步荧光光谱的结果一致。

图6 SMB-1与IMIP作用前(a)后(b)三维荧光光谱图
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=10×10-6 mol·L-1, T=277 KFig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of SMB-1 with (a) and without (b) IMIP
cSMB-1=1×10-6 mol·L-1, cIMIP=10×10-6 mol·L-1, T=277 K

2.5 SMB-1与IMIP的分子对接分析

分子对接是预测结合位点和作用力的一种理论模拟技术, 可获得蛋白与配体相互作用的详细信息[24, 25, 26]。 通过分子对接直观的描述了SMB-1与IMIP相互作用机制。 图7为SMB-1与IMIP的分子对接最佳结合结果, 从图7(a)可知, IMIP分子核心进入了活性口袋, 侧链可能因空间位阻较大暴露于外侧, 说明SMB-1主要与IMIP的核心结构发生作用; 从图7(b)中可以得出, W701的质子化会导致Zn2配位键的丢失, 而C3羧酸盐的丢失基团下移成为Zn2的一个新的配体, IMIP分子中C3羟基氧参与Zn2的配位键, 另一个羧基氧分别与Ser175和Thr177形成氢键, C7羧基氧同时与Gln157残基和桥接水相互作用, 侧链S原子与Thr177形成氢键, 氨基氢分别与His215和Glu217互相作用, 这些非键作用力增加SMB-1-IMIP复合物的稳定性, 可见氢键为主要结合力, 均可以促进SMB-1对IMIP的识别, 且进一步表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的SMB-1抑制剂的关键因素。 从结合模式中计算出ΔG=-9.14 kJ·mol-1, 为负值, 说明它们之间的结合是一个自发的放热过程, 与前期荧光结果一致。 但是ΔG数值上存在差异, 可能是实验环境条件不同。 同时在结合口袋附近也有疏水氨基酸残基Trp与Leu参与作用, 使得其疏水性增加, 有利于与IMIP结合, 这也与前期同步荧光结果一致。

图7 SMB-1与IMIP结合的3D图(a)和二维图(b)Fig.7 The 3D (a) and two dimensional (b) structures of SMB-1 with IMIP

3 结论

通过内源性荧光光谱、 同步荧光光谱、 三维荧光光谱及分子对接方法探究碳青霉烯类抗生素亚胺培南(IMIP)与金属β-内酰胺酶SMB-1之间的作用机理。 猝灭光谱结果表明IMIP可以使SMB-1内源荧光猝灭, 且猝灭机制为动态和静态组合猝灭, 其中静态猝灭为主; 同步和三维荧光光谱表明中SMB-1与IMIP作用之后的微环境和构象发生了改变。 分子对接表明IMIP的β-内酰胺环进入SMB-1的结合口袋, 而侧链位于活性口袋的外部。 结合是由焓变和熵变共同驱动的, 与荧光结果一致。 本研究提供了对SMB-1与IMIP的识别和结合的见解, 这可能有助于设计β-内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。

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