华法林与人血清蛋白的动力学模拟通过Gromacs实现, 对人血清蛋白与华法林分子的配体使用GROMOS96 43A1联合原子力场进行能量最小化, 压力与温度平衡, 稳定后在300 K温度下进行1 ns的动力学模拟, 从整个动力学过程中提取得到华法林与血清蛋白结合后的结构。

所有计算均通过Gaussian 09软件, 采用密度泛函理论(DFT)和含时密度泛函理论(TD-DFT)进行。 华法林的三种状态均在B3LYP/def2-TZVP级别下计算, 添加了D3色散矫正^[9], 采用基于密度的溶剂模型(SMD)为三种结构添加了水溶剂环境后优化各状态水溶液下的基态结构(S₀)。 TD-DFT计算得到各状态稳定结构下激发态的激发能和振子强度模拟紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)。 优化激发态S₁结构并计算得到S₁→S₀的荧光发射能和振子强度模拟各状态的荧光光谱。 通过Multiwfn^[10]计算各结构的静电势来分析静电相互作用, 计算分子前线轨道来研究分子周围电子云的分布。 对各激发态进行电子-空穴分析^[11], 模拟研究不同结构激发过程前后电子和空穴分布的变化分析其电荷转移的能力。

华法林(I)为开链异构体, 是华法林几十种异构体中最稳定的同分异构体, 也是与人血清蛋白结合时的异构体, 华法林(I)-anion是华法林(I)去质子化, 脱去一个氢原子后的结构, 当华法林(I)在水溶液以及碱性溶液环境下, 其结构就会转化为华法林(I)-anion。 华法林(I)-HSA为华法林(I)与人血清蛋白结合后的结构。

华法林药物在水溶液中未去质子化前, 结构为华法林(I); 在水溶液中去质子化形成过渡态, 与人血清蛋白结合前, 结构为华法林(I)-anion, 当其与人血清蛋白结合后, 华法林分子结构变为华法林(I)-HSA。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 华法林水溶液下不同状态优化结构 图中原子: 青色为碳, 红色为氧, 白色为氢Fig.2 The optimized structures of warfarin solution in different states Atoms in the figure: cyan is carbon, red is oxygen, and white is hydrogen

分析华法林分子的静电相互作用有助于解释华法林与蛋白质的结合方式, 分析华法林电子密度的分布可以预测其光激发过程。 通过静电势(electrostatic potential, ESP)分析^[12], 可以直观地揭示分子结构上各位置的电荷分布和静电相互作用。

图3给出了华法林三种状态的静电势分布, 红色区域为正电分布, 蓝色区域为负电分布。 由于去质子化的华法林为阴离子体系, 无法直接计算静电势, 在去质子处取代一个钠离子形成的华法林(I)-Na与华法林(I)-anion电荷分布类似。 从图3可以看出, 华法林在与血清蛋白结合前的静电势分布都比较符合化学直觉, 苯环与六元环上氢原子附近等值面上的静电势为正值, 大小相似。 氧原子附近等值面上的静电势为负值, 香豆素一个环上有三个氧原子, 电子分布更加集中在这个环上。 当处于去质子化的过渡态时, 正电集中在去质子处, 其对位处的氧原子的静电势负值和范围增大。 当华法林I与血清蛋白结合后, 其静电势分布发生明显变化, 香豆素环部分整体平面呈正电分布, 华法林另一侧静电势显负电。 对比结合前后华法林表面静电势的变化, 华法林是通过静电相互作用与血清蛋白进行结合的。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 三种华法林结构的ESP图Fig.3 ESP diagrams of three warfarin structures

计算三种状态的华法林得到的紫外-可见吸收光谱如图4所示, 三种分子的吸收光谱均存在两个吸收峰, 出现双吸收峰的主要原因是由于数个激发态跃迁产生紫外-可见吸收导致。 280~310 nm范围内的吸收峰为华法林的主要吸收峰, 华法林(I)的吸收波长为291 nm, 华法林(I)-HSA吸收波长最大, 为307 nm且吸收峰强度最高, 华法林(I)-anion相比于华法林(I), 波长红移12 nm, 强度降低。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 华法林不同状态的紫外-可见吸收光谱Fig.4 UV-Vis absorption spectra of warfarin in different states

未去质子化状态或酸性条件下, 华法林还未与血清蛋白开始结合, 吸收强度较高。 在溶液中去质子化而脱去一个H原子后, 吸收峰波长红移, 吸收强度降低。 当华法林与人血清蛋白结合后, 吸收波长红移, 显示出吸收增强的现象, 结合后结构发生变化, 华法林整体的刚性平面增强导致吸收波长红移, 吸收增强。

为探究华法林不同状态紫外-可见吸收光谱产生变化的原因, 对主吸收峰的激发态进行了电子-空穴分析。 三种状态的主吸收峰均是由S₁的激发过程产生, 从图5中可以明显看出, 华法林(I)的电子与空穴为主要分布在香豆素环上的π→π^*局域激发。 去质子化后空穴更集中地分布在香豆素环右侧, 电子分布在左侧, 激发过程有一部分电子发生了转移, 空穴整体已有向苯环转移的趋势。 与血清蛋白结合后, 整体结构发生扭曲, 空穴从香豆素环上激发后完全转移到了苯环, 激发过程也从π→π^*局域激发变成了电荷转移激发。 通过电子空穴分析得到华法林不同状态下激发过程的电荷转移情况, 根据图5可以看出紫外-可见吸收光谱发生变化的原因主要是由于结构变化导致华法林激发过程的变化。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 华法林主峰激发态的电子-空穴分析图 绿色为电子分布, 蓝色为空穴分布Fig.5 Electron-hole analysis diagram of the excited state of the main absorption peak of warfarin The green colour shows the distribution of holes, and the blue colour shows the distribution of electrons

通过波函数分析华法林激发态S₁→基态S₀退激过程的分子前线轨道, 其发射过程为分子的最低未占据分子轨道→最高占据分子轨道(LUMO→HOMO)轨道的跃迁产生。

图6中三种状态华法林的LUMO轨道均分布在香豆素环附近, 轨道跃迁类型为π^*→π跃迁, 华法林(I)的HOMO/LUMO轨道都均匀分布在了香豆素环附近; 华法林与血清蛋白结合的整个过程中, 荧光发射过程的轨道跃迁与吸收过程类似, 华法林(I)-anion在退激过程中电子云主要集中于去质子的六元环处; 与血清蛋白结合后, HOMO轨道上的电子云除了分布在香豆素环上外, 还有一部分移动到了苯环上。 电子云分布的变化影响荧光发射过程, 通过TD-DFT理论计算S₁→S₀过程的激发能与振子强度, 模拟华法林不同状态的荧光光谱。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 华法林荧光发射过程的分子前线轨道图Fig.6 Warfarin frontier molecular orbitals invalred in the fluorescence emission

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 华法林不同状态的荧光光谱Fig.7 Fluorescence spectra of warfarin in different states

由表1可知, 华法林(I)荧光峰波长为360 nm, 去质子化后红移至372 nm, 振子强度由0.63降至0.41。 构型变化导致发射能降低, 波长红移, 振子强度降低, 计算结果与Sakpal团队的模拟相吻合, 去质子化华法林的计算荧光光谱与华法林水溶液的荧光光谱实验结果同样吻合^[13]。 当华法林与血清蛋白结合后, 相较于华法林(I)-anion产生荧光增益, 荧光峰波长基本无变化而荧光强度增强。 分析华法林发射过程的电荷转移来解释不同状态华法林荧光光谱变化的原因。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同状态华法林的计算光谱数据 Table 1 Calculated spectral parameters of various forms of warfarin structure wavelength/nm oscillator strength (f) Warfarin(I) 360/360[13] 0.63 (I)-anion 372 0.41 (I)-HSA 374 0.61

表1 不同状态华法林的计算光谱数据 Table 1 Calculated spectral parameters of various forms of warfarin

激发态电荷转移的定量描述定义了几种指数^[11]: Sr指数代表分子激发过程中电子与空穴的重叠程度(上限为1); D指数表示电子与空穴分布质心之间的距离; t指数用于衡量电子与空穴的分离程度, t指数大于0表示电子与空穴较为分离, 小于0表示没有显著分离, 通过考虑三种指数来定量描述激发过程的电荷转移。 从图中分子前线轨道分布和表中数据可以看出, 华法林(I)总体表现为标准的局域激发, 华法林(I)-anion从表中数据判断存在电荷转移, 但通过轨道图可以看出只是部分电子云集中于一个环上产生的电子与空穴的分离, 电荷并未转移出香豆素环外。 与血清蛋白结合后, 电子和空穴产生分离, 从轨道图中也可看出部分电子云转移到了香豆素环外的苯环上。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同状态华法林的电荷转移参数 Table 2 Charge transfer parameters of warfarin in different states structure Sr D t (I) 0.74 1.5 -0.54 (I)-anion 0.65 2.45 0.78 (I)-HSA 0.73 1.95 -0.14

表2 不同状态华法林的电荷转移参数 Table 2 Charge transfer parameters of warfarin in different states

以上的计算解释了华法林在不同状态下的发射过程, 可以理解为LUMO→HOMO的轨道跃迁, 分子轨道和电荷转移分析为这些荧光光谱的差异提供了进一步的理论支持。