判别分析是对多元菌检测分析的第一步, 也是最重要的一步, 直接法在多元菌判别分析应用方面发挥了一定作用。 Premasiri等^[7]制备了一种由金纳米粒子包被的二氧化硅SERS活性基底, 并获得了蜡样芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌、 炭疽芽孢杆菌、 苏云金芽孢杆菌、 大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌6种病原菌的SERS光谱。 结果显示, 这些病原菌的SERS谱图具有较优的信噪比和重现性, 且不同病原菌的特征峰位也显示出较大差异。 研究表明直接将不同病原菌置于SERS“热点”区域的检测策略在不同病原菌的判别分析上有一定应用效果, 但是, 由于病原菌细胞壁组成成分的相似性, 仍存在不同病原菌拉曼谱图分辨率低的问题, 尤其是在同源病原菌的鉴别分析上这个问题更明显。 因此, 为了进一步提高对病原菌拉曼谱图的分析精度, 很多研究者都引入了统计分析方法进行辅助分析。

统计分析技术是一种有力的数据分析工具, 它不仅可以方便筛查异常光谱, 也可以降低分析数据的维度, 从而利于提取更有效的信息用于多元菌的判别分析。 主成分分析(PCA)、 偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)、 线性判别分析(LDA)、 层次聚类分析(HCA)、 典型变量分析(CVA)等都是常用的统计分析方法。

Akanny等^[8]以球型金纳米粒子为SERS增强材料, 如图3(a)所示, 通过纳米粒子在细菌表面的聚集获得了枯草芽孢杆菌、 鼠李糖乳杆菌和大肠杆菌的SERS谱, 首先对三种菌的谱图进行了PCA分析, 如图3(b)所示, 区分效果十分可观, 前两个主成分可以代表绝大部分的光谱差异。 为进一步确定引起光谱之间差异的变量, 如图3(a)所示, 使用PLS-DA确定出对模型贡献的最大变量, 并成功区分了结构相似的三种病原菌。

图3

Fig.3

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	图3 (a)三种病原菌的SERS谱图; (b)三种病原菌SERS谱图的PCA得分图; (c)三种病原菌SERS谱图的PLS-DA三维得分图[8]Fig.3 (a) SERS spectra of three pathogens; (b) PCA scores plot of the SERS spectra for three types of pathogens; (c) PLS-DA three dimensional scores plot for the samples belonging to the three different pathogens[8]

Martinez等^[9]以纳米银棒阵列基板作为固态SERS检测基底, 结合PCA方法对大肠杆菌与沙门氏菌的拉曼谱图进行判别分析, 分类结果比较显著。 该课题组进一步针对实际样本中不同浓度的致病菌和非致病菌, 采用PCA和PLS-DA方法对不同浓度含量的细菌混合菌液进行分析, 结果表明这两种方法可以成功区分不同含量的病原菌。 Huang等^[10]制备了一种黑磷-纳米金滤纸复合基底用于区分三种食源性病原菌, 直接将含菌样品滴在滤纸表面, 即可在785 nm激发波长下获得高强度的拉曼谱。 并采用PCA与LDA方法对沙门氏菌、 单核细胞增李斯特菌和大肠杆菌三种病原菌进行快速判别分析, 鉴别准确率达98.68%, 整个过程仅仅需要几分钟。

除了在不同菌属水平上的鉴别分析, 直接法与统计分析技术的有机结合也可以实现不同血清型同源菌株精密分析。 Witkowska等^[11]以金-银纳米复合基板作为SRES基底, 结合PCA技术实现了不同血清型单增李斯特菌的区分, 证明了SERS技术在区分不同血清型菌株方面的应用潜力。 类似地, Berus等^[12]又通过物理气相沉积技术将金属银均匀溅射到硅晶片上制得固态SERS检测基底, 结合PCA分析技术可以用于5种不同链球菌属的快速鉴别分析, 分离度可达95%。

在多元菌的检测分析中, 除了判别分析, 定量分析也是重要方面。 但多元病原菌的拉曼光谱往往重叠严重, 研究中普遍采用“mapping”^[13]技术用于多元菌定量分析。 这种技术是指在自定义区域内自动收集数十条到数百条拉曼光谱, 然后根据指定峰位的强度值进行积分从而用于定量分析。 Zhou等^[14]首先通过静电吸附作用将Ag⁺聚集在病原菌周围, 然后通过原位还原法直接在病原菌表面包裹纳米银粒子生成检测“热点”[如图4(a)所示]。 这一设计使得病原菌的拉曼光谱信号急剧升高, 运用HCA技术可以实现三种大肠杆菌和一种葡萄球菌的快速区分。 更为重要的是, 通过“mapping”成像分析技术, 可以将此方法用于饮用水中大肠杆菌的定量检测[如图4(b)所示], 线性分析范围为2.5×10²~1×10⁸ CFU·mL^-1。

图4

Fig.4

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	图4 (a)细菌表面原位合成纳米颗粒示意图; (b)不同浓度大肠杆菌的SERS“mapping”成像图[14]Fig.4 (a) Schematic of the in situ synthesis of nanoparticles on the bacterial surface; (b) SERS “mapping”of different concentrations E. coli[14]

此外, Wang等^[15]使用树突状的银纳米基板作为SERS活性检测基底, 结合PCA与“mapping”成像技术可以用于沙门氏菌和大肠杆菌的同步检测, 检测限为10⁴ CFU·mL^-1。 Wang等^[16]制备了一种稳定性好, 重现性高的多功能SERS检测硅片。 该硅片首先通过氟化氢刻蚀技术使硅片表面产生大量氢键, 再将其置入Ag⁺溶液中, Ag⁺通过还原氢键从而原位生长于硅片上, 再通过Ag-S共价作用将4-MPBA修饰于硅片上从而制得SERS检测芯片。 该芯片集捕获、 检测和杀灭细菌功能于一体, 在以730 cm^-1为特征峰位的“mapping”成像中可以清楚看到拉曼信号强度随细菌浓度的变化关系。 该方法的线性分析范围为1×10²~1.0×10⁷ CFU·mL^-1, 并可用于血液样本中大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的分析检测, 显示出良好的应用前景。

基于SERS分析的直接检测法不仅在传感器领域获得多种尝试和应用, 近年来在分子器件领域也被广泛开发和用于实际样本检测。 通过与微阵列芯片、 微流控芯片等器件的联用, SERS直接检测法在临床样本的即时定性和定量分析方面显示出良好的应用效果, 有望用于POCT分析。

Knauer等^[17]将微流控系统与SERS检测联用, 用于水中多种病原菌的检测。 首先制备抗体固定化的聚乙二醇涂层芯片, 然后将此芯片组装到流通池中, 将待测含菌样品导入流通池中并静置30 min, 再匀速泵入纳米银溶液用于与病原菌结合, 可以在流动状态下捕捉到大肠杆菌的拉曼光谱信息并用于定量分析, 线性范围为4.3×10³~4.3×10⁵CFU·mL^-1。 该技术可同时添加针对多种病原菌的识别抗体, 做到对多种病原菌的同时检测。 Mungroo等^[18]开发了另外一种微流控检测平台, 并结合判别分析模型, 用于对大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌、 铜绿假单胞菌、 单增李斯特菌、 无害李斯特菌、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌35、 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌86这8种病原菌的快速分析。 此芯片首先通过紫外线光固化技术在晶片表面沉积一层80 μm的光刻胶制成母模, 然后在母模的基础上通过软光刻技术制成聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片, 将固化的 PDMS 复制品从母模上剥离, 冲压以形成入口和出口, 之后粘合到载玻片即制得微流体芯片。 待测菌液与纳米银溶胶分别由各自的入口泵入, 待纳米银和Triton X-100的混合液与病原菌作用后进行拉曼检测, 这种检测芯片可区分8种不同的食源性病原菌, 在食品行业中应用前景广阔。

核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选得到的寡链核苷酸序列, 能以高亲和力与靶标物质结合, 具备特异性好, 易化学合成、 易修饰、 稳定性强、 易储存等优势。 适配体可通过卷曲和折叠等作用形成空间构型与病原菌进行结合, 结合作用力包括范德华力、 氢键和静电作用力等。

Duan等^[19]制备了涂覆纳米金的聚二甲基硅氧烷(PDMA)薄膜作为SERS增强基底, 通过Au-S共价键将副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌两种待测细菌的适配体(Apt1与Apt2)固定于基底表面。 同时, 制备了与两种适配体单独结合的纳米金复合颗粒, 并将拉曼信号分子4-MBA和NBA分别与两种复合纳米颗粒混合培养, 得到两条独立的信号探针分子。 当目标菌株存在时, 将检测基底芯片、 信号探针分子和目标菌株混合培养, 通过三者形成的夹心结构可以用于两种菌种的同时测定, 检测限分别为18和27 CFU·mL^-1, 并且该方法可以用于海鲜样本中实际病原菌的分析检测。 类似地, Lei等^[20]以适配体为分子识别元件, 4-ATP和DTNB作为信号分子, 将荧光技术和SERS技术组合应用实现了兔血样品中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的鉴别与定量分析。 该检测思路是首先将不同颜色的荧光染料分别包裹于纳米金涂层的聚苯乙烯微球上, 然后在复合微球上分别修饰相应的拉曼信号分子和适配体链段, 从而制得兼具荧光和SERS“热点”活性的功能性微球。 当目标菌株存在时, 首先使用荧光成像快速提取目标菌种的视觉分布信息, 然后定域采集拉曼谱图实现两种病原菌的超灵敏检测。 这种方法在2 h内即可实现金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的可视化鉴别与高灵敏分析, 检测限分别为3和2 CFU·mL^-1。

Li等^[21]在金纳米棒的生长过程中创新性地引入不同的适配体和拉曼信号分子, 从而诱导金纳米棒生成不同突状体的八面体结构。 在具体的检测过程中首先使用特异性抗体修饰的磁性纳米粒子对两种目标菌种进行定向富集, 然后通过两种特殊构型的适配体材料分别与之形成夹心结构从而用于SERS活性检测。 此方法可以实现对肠出血性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的同时定量分析, 在10¹~10⁶ CFU·mL^-1范围内线性关系良好, 两种菌的检测限均低于10 CFU·mL^-1。

在基因水平上对病原菌的识别分析也是病原菌检测的一个重要方面。 Zhang等^[22]将测流分析(LFM)技术、 微阵列加工技术和SERS检测技术相结合, 实现了常见的11种呼吸道感染中病原体核酸序列的检测。 该检测过程可以分为样本采集过程和信号检测过程, 通过测流导向, 待测菌液核酸样本定向流动到结合区域, 在此区域, 目标病原体核酸分别与结合了NBA和MB信号分子的银核-金壳双金属纳米粒子表面的互补核酸链定向结合, 生成11种复合物。 当这些复合物到达硝酸纤维素膜微阵列区域时, 复合物被预先固定在微阵列上的核酸链捕获并形成夹心复合物, 至此完成样本采集工序。 在检测环节, 可以对获取的复合物样本进行点对点的拉曼光谱分析。 这种检测策略将多种病原体的核酸序列集成到一个LFM试纸条上, 所需的样本量、 测试试剂及检测时间都大大减少, 为个性化医疗检测应用提供了多样化的选择。

抗体是一类由天然免疫产生的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白, 对抗原具有高度的亲和力与专一性。 病原菌抗体可以精准地识别并特异性结合病原菌表面的抗原, 从而实现对多元病原菌的准确分析。

Bai等^[23]以抗体作为识别元件, 设计了三明治式SERS分析检测平台用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。 在该检测策略中, 首先将大肠杆菌的抗体与金黄色葡萄球菌的抗体结合于磁珠表面形成捕获探针, 再分别使两种病原菌抗体与标记的纳米金颗粒结合形成信号探针。 当病原菌存在时, 病原菌与两条探针分子分别形成三明治夹心结构并直接进行拉曼光谱高灵敏检测。 本方法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测范围分别为2×10¹~5×10⁴与6×10¹~2×10⁵ CFU·mL^-1, 检测限分别为10与25 CFU·mL^-1。 并且此方法还可以进一步扩展, 通过改变对应菌株的抗体, 即可实现对不同病原菌的通用检测。 此外, 基于抗体特异性识别的横向流动测定法(lateral flow assay, LMF)在多元病原菌的SERS分析方面应用也较多。 Wu^[24]基于横向流动测定法(lateral flow assay, LMF)系统构建了用于单核细胞增生李斯特氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的SERS检测平台。 首先将特异性识别两种目标菌种的抗体固定在硝酸纤维素膜上, 然后分别将两种抗体与偶联了不同拉曼信号分子的纳米金溶胶混合, 最后将混合液滴涂到硝酸纤维素膜上, 10 min后进行拉曼光谱检测。 结果显示两种菌均在10²~10⁷ CFU·mL^-1范围内显示出良好的线性响应, 检测限均为75 CFU·mL^-1, 该方法在牛奶样品中两种病原菌的分析检测方面也获得了很好的检测效果。 Liu等^[25]以抗体为识别元件, 结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA), 建立了基于SERS检测的LMF测试系统(RPA-LF-SERS), 用于单核细胞增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌的同时检测。 如图5所示, 该测试系统由样品区, 结合区, 测试区和吸收区所组成。 首先提取两种目标菌的DNA, 并通过RPA技术扩增分别用生物素和地高辛以及生物素和荧光染料(FITC)双标记的目标菌液DNA链段, 然后这些DNA链段与链霉亲和素和拉曼标记分子双修饰的Au@Ag复合纳米粒子结合。 当混合溶液横向流动到测试区域时, 测试线1上的FITC抗体和测试线2上的地高辛抗体会特异性捕获目标菌种标记抗原, 并形成肉眼可见的橙黄色条带, 通过检测变色条带上拉曼标记分子的特征响应即可实现目标菌种的定量分析, 对单核细胞增生李斯特菌和肠炎沙门氏菌的最低检测限分别为1.9×10和2.7×10 CFU·mL^-1, 这一检测系统已在实际食品样本的细菌测试分析上获得初步应用。

图5

Fig.5

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	图5 RPA-LF-SERS检测原理示意图[25]Fig.5 Schematic diagram of RPA-LF-SERS detection principle[25]

除适配体、 抗体等识别元件外, 抗生素和抗菌肽等生物分子也可作为识别元件应用于多元病原菌的分析检测。 而且在实际检测应用时往往是多种识别元件共同发挥作用, 来达到多元病原菌同时检测的目的。

Zhang等^[26]制备了万古霉素修饰的Fe₃O₄@Au磁性纳米粒子用于对目标菌种的识别和富集, 通过磁性分离后15 min内即可从复杂样本中得到目标菌种。 然后使用适配体和拉曼信号分子修饰的纳米Au粒子与上述目标菌种结合并用于拉曼测试。 结果显示此检测系统对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的捕获效率分别高达74.96%和88.89%, 检测限分别为50和20 CFU·mL^-1。 抗菌肽是某些细菌产生的一类具有抗菌作用的蛋白质, 作用范围比抗生素小, 仅对与产生菌有亲缘关系的细菌具有杀伤作用。 Yuan等^[27]将抗菌肽作为识别元件修饰于Fe₃O₄磁性纳米粒子上, 通过抗菌肽对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌三种细菌的识别作用从复杂样本中分离出目标菌种, 然后与4-MPBA修饰的金银复合纳米-石墨烯共聚物混合作用。 通过监测目标菌种拉曼光谱的细微差异, 从而实现不同种类细菌的鉴别及分析, 且三种菌的检测限均低至10 CFU·mL^-1。 由于抗菌肽的杀菌活性, 该检测系统集细菌的分离、 识别与灭活于一体, 在临床血液样本的病原菌检测分析方面获得良好的应用。