将1 g美国Sigma-Aldrich公司的腐殖酸溶于1 L的0.1 mol· L^-1NaOH溶液中得到1 g· L^-1的DOM储备液, 置于4 ℃冷藏柜中避光保存。 将一定量的Cu(NO₃)₂溶于100 mL的Milli-Q超纯水中获得0.02 mol· L^-1的Cu²⁺储备液, 置于4 ℃冷藏柜中避光保存。

太湖和洪泽湖表层水体DOC含量范围分别为2.2~8.7 mg· L^{-1 [15]}和12.6~16.9 mg· L^{-1 [11]}, 设置实验DOM浓度为10 mg· L^-1。 天然地表水的pH值通常在6~9之间, 设置不同pH为5、 6、 7、 8和10。 使用1 mol· L^-1的HCl和NaOH溶液调节DOM溶液的pH, 使用0.22 μ m聚醚砜树脂滤膜过滤后分别装入40 mL棕色玻璃管中, 分别滴加不同梯级的0.02 mol· L^-1 Cu²⁺储备液, 使不同pH条件下DOM溶液中Cu²⁺浓度分别为0、 5、 10、 15、 20、 30、 40、 50、 75、 100、 150、 200和250 μ mol· L^-1, 最后置于25 ℃间歇式恒温震荡仪中避光震荡反应24 h, 经0.22 μ m滤膜过滤后立即测定光谱。

使用日本Hitachi公司的F-7000荧光光度计测定Cu²⁺添加前后样品的荧光光谱, 光源为150 W连续输出氙弧灯。 同步荧光光谱测定为同步模式, 激发波长范围为275~540 nm, 设定发射波长与激发波长的恒定间隔为60 nm。 使用Milli-Q超纯水作为空白样品进行校准并归一同步荧光光谱的荧光强度。 选定特征峰345和468 nm分别代表类富里酸(F₃₄₅)和类腐殖酸(F₄₆₈)^[12]。 将Cu²⁺浓度作为外扰因素, 采用“ 2D shige” 软件建立同步和异步二维相关光谱^[16]。

三维荧光光谱测定激发波长范围为235~450 nm, 步长5 nm, 发射波长范围为250~600 nm, 步长1 nm。 使用Milli-Q超纯水作为空白样品用于消除水拉曼效应造成的荧光光谱拉曼峰。 使用MATLAB软件采用平行因子分析法对三维荧光光谱进行解析^[8], 并使用Ryan-Weber模型对解析出的不同组分荧光淬灭曲线进行非线性拟合^[17], 以评估DOM不同组分与重金属Cu²⁺的相互作用。

将Cu²⁺添加前后样品冷冻干燥后与光谱纯溴化钾以100:1的比例混合, 研磨压片后, 使用Nicolet 370傅里叶红外光谱仪在0.5 cm^-1分辨率下扫描, 得到1 800~700 cm^-1范围内的FTIR。 所得红外光谱结果均进行水汽校正。

使用日本岛津UV-3600紫外-可见光分光光度计测定样品的紫外-可见光吸收光谱。 设定光谱扫描范围为200~800 nm, 光程路径1 cm, 扫描间隔1 nm, 以Milli-Q超纯水为基线矫正和空白参照。 对紫外-可见光吸收光谱进行解析, 计算得到吸收系数A₂₅₄和吸收光谱斜率比值S_R分别表征DOM的相对丰度和分子量大小^{[11, 18, 19]}。

不同pH条件下DOM的性质差异如表1所示。 随着pH值的升高, DOM的相对丰度A₂₅₄逐渐增加, 并在碱性条件下趋于稳定。 由于DOM的浓度均为10 mg· L^-1, 表明pH的改变对DOM的芳香性有显著的影响。 不同pH条件下DOM的S_R值均在0.97± 0.1范围内, 表明pH变化并没有改变DOM分子量的大小。 由表1发现, pH 5时DOM的荧光强度最弱, 类腐殖酸F₄₆₈和类富里酸F₃₄₅荧光强度分别为11.05和10.99, 随后分别增加至92.85和27.43。 这一结果表明, pH的变化能够显著的影响DOM的荧光强度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同pH条件下DOM的性质变化 Table 1 Changes in DOM characteristics under different pH conditions pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 10 A254 58.73± 1.15 62.10± 0.92 63.87± 1.38 64.48± 0.46 64.94± 1.38 SR 0.96± 0.06 0.98± 0.05 0.97± 0.03 0.97± 0.02 0.96± 0.04 F345 10.99± 1.15 13.49± 0.84 14.17± 0.36 22.12± 1.57 27.43± 2.04 F468 11.05± 0.54 15.46± 1.20 16.48± 0.97 58.15± 2.56 92.85± 6.58

表1 不同pH条件下DOM的性质变化 Table 1 Changes in DOM characteristics under different pH conditions

为进一步了解pH对DOM荧光强度的影响, 以pH为扰动因子, 采用二维相关光谱对DOM同步荧光光谱进行分析, 结果如图1(a— d)所示。 同步二维相关光谱在对角线468 nm存在一个明显的正值峰, 表明DOM在相对应波长处的荧光强度受pH变化的影响最大。 如图1(b)所示, 异步二维相关光谱图峰值呈对角线分布, 在对角线下方存在负值峰。 根据Noda法则^[16], pH引起的荧光谱峰的变化次序为335~420 nm> 468 nm。 随着pH的增加, DOM在波长335~420 nm范围内的荧光性质比468 nm处更先发生改变。

图1

Fig.1

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	图1 DOM随pH变化同步和异步二维相关光谱图 (a): 荧光光谱-同步二维相关光谱; (b): 荧光光谱-异步二维相关光谱; (c): FTIR-同步二维相关光谱; (d): FTIR-异步二维相关光谱Fig.1 Synchronous and asynchronous 2D-COS maps of DOM along with pH changes (a): Synchronous 2D flourescence correlation map; (b): Asynchronous 2D fluorescence correlation map; (c): Synchronous 2D FTIR correlation map; (d): Asynchronous 2D FTIR correlation map

为了研究因pH改变导致的DOM结构的转变过程, 采用FTIR光谱开展二维相关光谱分析, 结果如图1(c)和(d)所示。 同步二维相关光谱对角线存在7个自相关峰。 异步二维相关光谱结果表明, pH引起的FTIR谱峰的变化次数为: 1 620> 1 400> 1 360> 1 450> 1 725> 830> 1 040 cm^-1。 有研究表明^{[12, 17, 20]}, 在1 725、 1 620、 1 450、 1 400、 1 360、 1 040和830 cm^-1附近出现的峰分别为羧基的C=O振动、 醛酮的C=O、 羧基上的不对称伸缩振动或C— OH的变形振动、 酚基的C— O或O— H振动、 脂肪族C— H振动、 为多糖C— O振动、 为芳香族C— H振动。 随着pH的改变, DOM官能团变化次序为: 醛酮C=O> 酚基> 脂肪族C— H> 羧基C— OH> 羧基C=O> 芳香族C— H> 多糖C— O。

由于腐殖酸分子中含有大量的羧基和酚羟基等酸性官能团, 在较低pH下腐殖酸分子构型呈卷曲状态, 大部分官能团受限于其内部, 随着溶液pH的增大溶液中的OH^-浓度不断增加, 酸性官能团中的H⁺不断发生解离导致HA大分子内部斥力增大, 分子构型由卷曲伸展为线性结构, 从而有更多的相关基团暴露出来, 使腐殖酸的荧光强度增强, 表明官能团发生了变化^{[7, 12]}。

随着Cu²⁺浓度从0 μ mol· L^-1增加至250 μ mol· L^-1, 不同pH条件下DOM不同波长的荧光强度均呈现明显的下降趋势, 如图2(a— e)所示, 表明在Cu²⁺的作用下DOM均发生了淬灭效应。 为了进一步掌握不同pH条件下Cu²⁺与DOM的结合点位和结合顺序, 以Cu²⁺浓度为扰动因子, 采用二维相关光谱解析同步荧光光谱, 结果如图2(a2, a3, b2, b3, c2, c3, d2, d3, e2, e3)所示。 不同pH条件下DOM同步荧光2D-COS图均在对角线出现2个主要的自相关峰, 分别位于468和345 nm, 且468 nm处自相关峰峰强均高于345 nm, 表明类腐殖酸与Cu²⁺的结合能力均强于类富里酸。 随着pH值增加, 468和345 nm处的自相关峰强度也逐渐增强, 尤其是碱性条件下(pH 8和10)自相关峰峰强显著高于酸性和中性条件(pH 5、 6和7), 表明pH的改变能够显著地影响DOM与Cu²⁺的结合能力。 异步二维光谱图[图1(b, d)]的峰值呈对角线分布, 在对角线右下方均存在正值峰。 根据Noda法则, 不同pH条件下DOM与重金属Cu²⁺的结合顺序依次为468 nm> 335~420 nm。 这一系列结果表明, DOM不同点位与Cu²⁺的结合顺序并不受pH变化的影响, 但是结合强度受pH变化的影响, DOM与Cu²⁺的结合强度随着pH升高呈现增强的趋势。 分析认为pH的升高使得更多的相关基团暴露, 增加了DOM与Cu²⁺的相互作用。

图2

Fig.2

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	图2 不同pH下DOM同步荧光光谱随Cu2+浓度变化情况及其二维相关光谱图 (a): pH 5; (b): pH 6; (c): pH 7; (d): pH 8; (e): pH 10Fig.2 Changes in the synchronous fluorescence spectra of DOM upon addition of Cu2+ under different pH conditions and its 2D-COS maps (a): pH 5; (b): pH 6; (c): pH 7; (d): pH 8; (e): pH 10

为了进一步了解pH对DOM与Cu²⁺相互作用的影响, 采用平行因子法对三维荧光光谱进行解析, 基于残差分析和分半验证结果, 共解析出3个荧光组分。 根据荧光组分的光谱特征, C1[E_x/E_m=260/510 nm]和C3[E_x/E_m=< 235/540 nm]为类腐殖酸物质, C2[E_x/E_m=250/415 nm]为类富里酸物质^{[21, 22]}。 采用Ryan-Weber模型对不同pH条件下DOM不同组分与Cu²⁺相互作用荧光淬灭曲线进行非线性拟合, 结果如表2所示。 由表2可以看出, 类腐殖酸组分C1与Cu²⁺的结合参数均高于类富里酸组分C2。 随着pH的增加, 组分C1和C2与Cu²⁺的结合参数均显著增加。 这一结果与同步荧光光谱分析结果相一致, 均表明pH的增加能够提升DOM与重金属Cu²⁺的结合能力但并不影响DOM点位与重金属Cu²⁺的结合顺序。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 基于Ryan-Weber模型确定的荧光组分与Cu2+相互作用结合参数(n=13) Table 2 Values of binding parameters for fluorescence components with Cu2+ determined by Ryan-Weber model (n=13) pH C1 C2 C3 lgKM R2 lgKM R2 lgKM 5 4.91 0.99 4.32 0.98 6 4.95 0.99 4.37 0.98 7 5.09 0.99 4.46 0.97 - 8 5.14 0.99 4.45 0.96 10 5.19 0.98 4.59 0.90 注: “ -” 荧光组分C3无法拟合

表2 基于Ryan-Weber模型确定的荧光组分与Cu2+相互作用结合参数(n=13) Table 2 Values of binding parameters for fluorescence components with Cu2+ determined by Ryan-Weber model (n=13)

选择pH 5和pH 10条件下DOM与重金属Cu²⁺结合后FTIR光谱进行进一步分析, 以了解不同pH条件下DOM与重金属Cu²⁺的相互作用机制, 结果如图3所示。 由图3(a)和(c)可以看出, pH 5和pH 10条件下DOM与Cu²⁺结合后的FTIR均在1 380和1 620 cm^-1波段存在正值自相关峰, 在1 380/1 620 cm^-1存在正值交叉峰。 pH 10条件下自相关和交叉峰的强度均高于pH 5条件下的峰强度。 这一结果表明, 相比于pH 5的条件, pH 10更利于DOM与重金属Cu²⁺的结合, 且主要结合官能团可能为醛酮C=O、 酚羟基C— O和脂肪族C— H。 根据Noda法则, pH 5条件下DOM不同官能团与重金属Cu²⁺的结合顺序依次为: 1 040> 1 380> 1 620> 830 cm^-1, 即多糖C— O> 酚基> 醛酮C=O> 芳香族C— H。 pH 10条件下DOM官能团的结合的顺序为1 040> 1 520> 1 380> 1 350> 1 620> 1 450> 830> 1 710 cm^-1, 即多糖C— O> 酰胺Ⅱ 带C— N> 酚基> 脂肪族C— H> 醛酮C=O> 羧基C— OH> 芳香族C— H> 羧基C=O。 pH 10条件下DOM官能团结合点位多于pH 5条件, 分析认为pH 10条件下更多的基团暴露在外所导致。 总之, pH的改变能够显著影响DOM官能团与Cu²⁺的结合强度、 结合点位及其结合顺序。

图3

Fig.3

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	图3 pH 5和pH 10条件下DOM与Cu2+结合后的红外光谱二维相关光谱图 (a): pH 5 同步二维相关光谱图; (b): pH 5 异步二维相关光谱图; (c): pH 10 同步二维相关光谱图; (d): pH 10 异步二维相关光谱图Fig.3 2D-COS maps from FTIR analysis of DOM with Cu2+ binding under pH 5 and pH 10 conditions (a): Synchronous 2D-COS map under pH 5; (b): Asynchronous 2D-COS map under pH 5; (c): Synchronous 2D-COS map under pH 10; (d): Asynchronous 2D-COS map under pH 10

为确定荧光和红外光谱对应基团的相互关联, 并进一步了解DOM与Cu的结合过程, 采用2D-COS开展了异谱二维相关分析, 分别如图4(a— d)所示。 在pH 5和pH 10条件下, 同步二维相关光谱图中出现了2个负值交叉相关峰, 位于红外区域的1 380和1 620 cm^-1和荧光区域的335~500 nm。 表明DOM中酚基和芳基是类腐殖酸和类富里酸组分的基元^[12]。 在异步二维相关光谱图中, pH 5条件下, 坐标(1 380cm^-1, 468 nm)和(1 620 cm^-1, 468 nm)处符号为正, 表明类腐殖酸组分的荧光变化滞后于酚基和芳基的振动变化。 pH 10条件下, 坐标(1 380 cm^-1, 468 nm)和(830 cm^-1, 468 nm)处符号为正, 表明类腐殖酸组分的荧光变化滞后于酚基和芳基的振动变化。 强度的变化次序与二维荧光和二维红外相关分析得到的变化次序一致。

图4

Fig.4

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图4 pH 5和pH 10条件下DOM与Cu2+结合后荧光红外异谱二维相关光谱图 (a): pH 5 同步异谱二维相关光谱图; (b): pH 5 异步异谱二维相关光谱图; (c): pH 10 同步异谱二维相关光谱图; (d): pH 10 异步异谱二维相关光谱图Fig.4 2D heterospectral correlation plots generated from the dynamic synchronous fluorescence and FTIR of DOM with Cu2+ under pH 5 and pH 10 conditions (a): Synchronous 2D heterospectral correlation map under pH 5; (b): Asynchronous 2D heterospectral correlation map under pH 5; (c): Synchronous 2D heterospectral correlation map under pH 10; (d): Asynchronous 2D heterospectral correlation map under pH 10