香兰素(C₈H₈O₃, CAS: 121-33-5)为阿拉丁生化科技股份有限公司, Lot#A2128215; 基质材料为淀粉(C₁₂H₂₂O₁₁, CAS: 9005-84-9): Macklin/麦克林, Lot#C10650260; 奶粉为市售普通品牌奶粉。

荷兰帕纳科锐影衍射系统, 美国赛默飞公司/Nicolet iS50红外光谱仪, 美国赛默飞公司/DXR2拉曼光谱仪, 蔡司公司Merlin型场发射扫描电子显微镜。

称取香兰素1.01, 1.70, 2.00, 3.01和5.00 mg(精准至0.001 mg), 在室温下分别混合至5 g淀粉中, 充分混合均匀, 标记为样品a、 b、 c、 d、 e; 淀粉基质和奶粉基质分别标记为f和g。

1.3.1 X射线衍射表征

Cu Kα 辐射, 管压40 kV, 管流40 mA, 光阑系统: Anti-scatter slit=1, Divergence slit=1/2, 采用θ -2θ 连续扫描方式, Step size: 0.006 5° , 扫描角度: 10° ~30° , 扫描时间18 min。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱分析

波数为4 000~400 cm^-1, 分辨率为4 cm^-1, 扫描次数为32 次, 扫描之前先采集空白背景, 消除外界环境的影响, 提高光谱数据的有效信息量。

1.3.3 拉曼光谱分析

激光波长为532 nm, 激发功率为3.5 mW, 分辨率为4 cm^-1。

1.3.4 扫描电子显微镜表征

取微量香兰素粉末粘于导电胶上, 经过喷金处理后, 进样观察香兰素的微观形貌。

2.1.1 香兰素的微观结构分析

香兰素具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香, 是从芸香科植物香荚兰豆中提取的一种有机化合物, 为白色至微黄色结晶或结晶状粉末。 香兰素粉末在扫描电镜下观察(如图1所示), 微区形貌中粉末颗粒表面布满规则取向的长条鳞片, 鳞片表面比较光滑, 边缘黏附聚集有球形颗粒, 微珠粒度大小均一。 当光线从合适的角度照射到具有规则排列的片状表面结构的香兰素时, “ 反射式光栅衍射” 的光学效应, 自然就会形成香兰素特有的衍射花样, 这也是香兰素特有的结构“ 指纹” 特征图谱。

图1

Fig.1

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	图1 香兰素微观结构形貌Fig.1 SEM morphology of Vanillin

2.1.2 香兰素的物相结构

香兰素的X射线衍射图谱如图2所示, 结合标准的XRD图谱(PDF 40-1938), 位于13.03° 、 17.24° 、 28.61° 、 39.84° 出现强衍射峰, 属于香兰素典型物相结构。 衍射图谱的结构参数详见表1, 这些谱峰的衍射强度高特征明显, 具备定性定量分析的物理基础。 位于13.03° 的衍射峰具有显著的相对强度, 拥有掩盖完整图谱中其他特征峰的衍射强度, 具备香兰素掺杂快速筛选特征峰的先决条件。

图2

Fig.2

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	图2 香兰素X射线衍射图谱Fig.2 XRD patterns of Vanillin

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 香兰素XRD图谱结构信息列表 Table 1 The structural information for Vanillin XRD spectrum 序号 2 theta /(° ) d value /nm FWHM /cm-1 Intensity I/Io 1 13.03 6.79 0.113 1 614 049.6 100.0 2 17.14 5.17 0.583 10 363.1 0.64 3 28.59 3.12 0.210 12 147.3 0.75 4 39.85 2.26 0.082 43 949.2 2.72

表1 香兰素XRD图谱结构信息列表 Table 1 The structural information for Vanillin XRD spectrum

2.1.3 香兰素的红外光谱和拉曼光谱分析

红外光谱技术以其简便、 高效等优势, 是乳制品和食品检测的最优选的技术之一。 香兰素分子式为C₈H₈O₃, 从结构式可以看出有C— O、 C=O 、— OH及芳香苯环等官能团, 香兰素的红外光谱见图3。 香兰素的红外光谱在3 600~2 500 cm^-1区域内的宽吸收峰, 是芳香苯环与羟基相连的酚特征峰; 在3 030~2 800 cm^-1波段有3个较弱的特征性不强的吸收峰, 与烯烃的C=C— H频率相近; 在1 666 cm^-1处的特征吸收峰为醛基C=O伸缩振动; 在1 589、 1 510、 1 465和1 432 cm^-1处4条谱带为C=C苯环的骨架伸缩振动, 是香兰素结构中苯环的重要体现; 在1 340~900 cm^-1区域内的强吸收峰为香兰素中的醚基团C— O不对称伸缩振动的结果^{[14, 15]}。 香兰素的红外光谱特征明显, 但是谱峰数量多、 分布密集、 谱图复杂, 各吸收峰间不具备显著竞争差异。

图3

Fig.3

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	图3 香兰素红外光谱谱图Fig.3 FTIR spectrum of Vanillin

拉曼光谱通过拉曼散射峰的半宽、 强度、 位置来表征分子振动, 分析化合物分子中不同官能团或化学键的相关信息。 实验中采集的香兰素拉曼光谱如图4所示, 谱图表征了香兰素丰富的组分信息, 结合文献报道, 进行谱峰归属分析^{[16, 17]}。 其中, C=O伸缩振动和C=C伸缩振动是香兰素结构中常见的官能团, 主要出现在1 665 cm^-1, 类似于脂肪的酯基和蛋白质中的酰胺Ⅰ 键, — CH₂的变形振动会产生1 423 cm^-1附近的谱带; 381~950 cm^-1处的连续谱峰是香兰素中苯环C— C— O伸缩及变形振动和常见的C— O— C、 C— O— H变形振动综合作用的散射峰, 以上特征谱峰无法作为香兰素与淀粉、 蛋白质等基质官能团的特征比对区分。 在2 000 cm^-1以下出现的十个以上的特征拉曼谱峰, 散射峰数量较多, 结构复杂, 说明多种化学键叠加; 最强峰强度约26 486.4, 次强峰23 997.6, 谱峰密集峰型尖锐, 强度差异不显著。

图4

Fig.4

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	图4 香兰素拉曼光谱谱图Fig.4 Raman spectrum of Vanillin

淀粉颗粒既有结晶部分也有非结晶部分, 是一种多晶体系, 在15° 、 17° 、 18° 、 23° 处呈现明显的衍射峰, 峰形宽强度低; 乳粉的XRD图谱则呈现非晶的馒头峰。 以淀粉为基质的样品符合食品中添加香兰素的市场规律, 利用X射线衍射快速定性探测香兰素添加的XRD图谱如图5所示。 结合香兰素的衍射图谱, 发现在淀粉中添加香兰素后, 13.03° 出现明显的尖锐的衍射峰, 该特征衍射峰是香兰素的三大强峰之一, 峰形好, 响应值高; 利用X射线衍射花样特征的独具指纹特性, 通过香兰素特征衍射峰13.03° 定性分析香兰素是否存在, 通过13.03° 衍射峰的强度定量/半定量判断香兰素的含量范围。 淀粉、 乳粉等食品乳制品的基质材料在XRD下均不具有复杂的衍射花样, 该检测过程直接取样, 操作简单, 干扰少, 结果可靠, 适用性强。

图5

Fig.5

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	图5 不同香兰素掺杂量样品的XRD检测图谱结果 (a): 淀粉和乳粉; (b): 掺杂不同含量香兰素样品Fig.5 The XRD diffraction patterns of different samples (a): Starch and milk powder; (b): The powder doped with vanillin of different concentrations

我国卫生部的规定, 香兰素在最终加香食品中的建议用量约为0.2~20 000 mg· kg^-1(20 mg· g^-1), 香兰素可用于较大婴儿、 幼儿配方食品和婴幼儿谷类食品(婴幼儿配方谷粉除外)中, 最大使用量分别为 5 mg· mL^-1和7 mg· (100 g)^-1(70 μ g· g^-1)。 本研究中香兰素的最低掺杂量为202 μ g· g^-1(样品1), 市售加香食品中香兰素的含量可以利用本方法进行快速检测, 灵敏度可满足建议用量和超量应用的检测需求; 微量掺杂的检测技术可以结合萃取富集法获得微量相样品; 如无法萃取, 可通过加大辐射功率或延长数据采集时间等方法进行物相分析。

不管是各类食品还是乳制品, 都是多组分并存的复杂的非均匀固体, 可掺杂物质的范围广且浓度分布不均匀, 要求高效的微区分析技术和快速的大面积扫描技术。 红外光谱技术以其简便、 高效等优势, 同样是乳制品和食品检测的最优选的技术之一, 传统的红外光谱技术易受到固体基质的严重干扰, 难以有效检测食品及奶粉体系中的微量香兰素成分。 由图3和图6可知, 淀粉和香兰素的红外光谱在1 800~400 cm^-1区域内均存在大量的红外吸收峰, 重合区域广信噪比低, 谱峰重叠干扰严重, 仪器越灵敏检测筛选的难度越大。

图6

Fig.6

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	图6 不同香兰素掺杂量样品的红外光谱分析结果Fig.6 Infrared spectra of starch powder doped with vanillin of different concentrations

拉曼光谱检测技术是一种无创无损、 灵敏度高的指纹式分析技术, 可在分子水平上给出有关物质的结构信息。 拉曼光谱分析复杂非均匀体系的淀粉和乳粉样品, 采集区域内没有足够代表性的特征图谱, 光谱中谱峰的位置、 数量和强度信息无法反应样品中不同物质分子的组成和结构信息。 图7显示, 淀粉在250~1 500 cm^-1区域内谱峰密集, 与香兰素的特征峰相重叠, 不易分辨; 同时, 在1 500~1 700 cm^-1波段内香兰素的最强特征峰也未被探测到。 本研究中香兰素的掺杂从202到1 000 μ g· g^-1, 可以推测光谱分析均未检测到香兰素的特征红外吸收峰和拉曼谱峰。

图7

Fig.7

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	图7 不同香兰素掺杂量样品的拉曼光谱分析结果Fig.7 Raman spectra of starch powder doped with vanillin of different concentrations

食品掺假及非法添加的检测技术研究, 不断发展了色谱法及各类联用技术, 取得了良好的检测结果。 色谱法均需要通过繁琐的样品前处理进行富集分离, 检测方法复杂且检测时间较长, 致使样品检测通量有限、 难以适应食品安全的严峻形势^[1]。 同时, 大都依赖于高档、 易耗的仪器和设备, 检测成本高难以广泛应用, 监管存在大量盲点。 食品掺杂体系的不确定性和复杂性, 近红外、 拉曼等光谱技术检测的正确率和精度都较低, 难以达到实际应用的要求^[18]。

X射线定量物相分析, 是在已知物相类别的情况下, 通过测量物相的积分衍射强度, 来测算它们的相对含量。 多相材料中物相的含量越多, 其衍射峰强度就越高。 X射线衍射物相定量分析有内标法、 外标法、 绝热法、 增量法和全谱拟合法等常规分析方法^[18]。 近年来, XRD定量分析方法的发展和深入研究及衍射仪探测器技术水平的提高为食品中掺杂掺假的定量分析奠定了基础。