基于SERS标记免疫分析技术苹果中多菌灵的检测方法
黄晓玮1, 张宁1, 李志华1, 石吉勇1, 孙悦1, 张新爱1, 邹小波1,2,*
1.江苏大学农业工程学院, 食品与生物工程学院, 江苏 镇江 212013
2.江苏高校智能农业与农产品加工国际合作联合实验室, 江苏省教育厅, 江苏 镇江 212013
*通讯作者 e-mail: zou_xiaobo@ujs.edu.cn

作者简介: 黄晓玮, 女, 1988年生, 江苏大学食品与生物工程学院副研究员 e-mail: huangxiaowei@ujs.edu.cn

摘要

多菌灵(Carbendazim, 甲基-1H-2-苯并咪唑氨基甲酸酯)是一种内吸性广谱杀菌剂, 广泛应用于苹果种植过程中的轮纹病和褐斑防治, 若不合理使用会在苹果中残留危害消费者身体健康。 采用表面增强拉曼光谱免疫分析技术(surface-enhance Raman spectroscopy combined immunoassay, SERSIA), 以SERS高灵敏度和分子“指纹”图谱特性为基础, 结合免疫特异选择性, 实现苹果中多菌灵的微/痕量检测。 制备核-分子-壳“三明治式”结构的Au@M@Ag 纳米SERS材料和结合抗原的SERS免疫探针, 在包被抗体的Fe3O4磁性纳米材料可分离功能下, 实现多菌灵的特异性检测。 采用透射电镜(transmission electron microscope, TEM)、 紫外-可见光谱和拉曼光谱等方法对制备的材料进行表征并优化了实验参数。 研究表明多菌灵浓度与标记分子4-巯基苯甲腈的2 227 cm-1处特征峰强度值在0.5~300 nmol·L-1范围内具有良好的线性关系, 同时该免疫探针信号具有良好的稳定性和重现性。 对不同加标浓度的苹果实际样本进行检测, 得到的平均回收率为95.6%~98.3%, 相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为0.15%~0.99%。 该方法操作简单, 检测灵敏度高、 选择性强、 稳定性好, 为苹果中痕量多菌灵的检测提供了新的方法。

关键词: 表面增强拉曼光谱; 免疫分析技术; 多菌灵; 苹果; 快速检测
中图分类号:O657.37 文献标志码:A
Detection of Carbendazim Residue in Apple Using Surface-Enhanced Raman Scattering Labeling Immunoassay
HUANG Xiao-wei1, ZHANG Ning1, LI Zhi-hua1, SHI Ji-yong1, SUN Yue1, ZHANG Xin-ai1, ZOU Xiao-bo1,2,*
1. School of Agricultural Engineering, School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
2. International Joint Research Laboratory of Intelligent Agriculture and Agri-Products Processing, Jiangsu Education Department, Zhenjiang 212013, China
*Corresponding author
Abstract

Carbendazim (Methyl-1H-2-benzimidazole carbamate),a kind of broad-spectrum fungicide, is extensively used in the prevention and treatment of ring rot and brown spot in apple planting. However, excessive use and residue of Carbendazim induce toxic effects on humans.In order to rapidly and accurately detect Carbendazim in apples, the Surface-Enhance Raman Spectroscopy combined immunoassay (SERSIA) was used in this study. This method was based on SERS’s highly sensitive molecular “fingerprint” characteristics, combined with immunospecific selectivity. The core-molecule-shell “sandwich” structure of Au@M@Ag nano SERS material and SERS immune probe binding antigen were prepared. Combined with Fe3O4 magnetic nanomaterial coated antibody,the specific detection of Carbendazim was achieved with the separable function.Transmission electron microscopy (TEM), UV-Vis spectroscopy and Raman spectroscopy were used to characterize the material properties and optimize the experimental parameters.The results showed a good linear relationship between 0.5~300 nmol·L-1 carbendazim concentration and the intensity of Characteristic peak at 2 227 cm-1 of the labeled molecule 4-mercaptobenzonitrile. The average recovery of Carbendazim in apples with different spiked concentrations was 95.6%~98.3%, and the RSD value was 0.15%~0.99%. Itis a sensitive, selective and stable method for detecting Carbendazim in apples without complex pretreatment.

Keyword: Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS); Immunoassay; Carbendazim; Apple; Rapid detection
引言

多菌灵(Carbendazim, 甲基-1H-2-苯并咪唑氨基甲酸酯)是一种内吸性广谱杀菌剂[1], 其杀菌作用机制主要是影响遗传物质的合成及干扰有丝分裂的过程, 对半知菌类中的病原真菌和一些子囊菌纲的菌类有效[2], 广泛应用于苹果种植过程中轮纹病和褐斑病等病害的防治[3]。 多菌灵的主要分子结构苯并咪唑环化学性质稳定在自然环境中不易降解, 过量使用易造成残留。 研究表明环境中的多菌灵残留物会对哺乳动物的生殖系统造成损伤[2], 也会对生物的遗传行为造成不良影响, 同时其降解产物也是有毒有机物。 我国国家标准规定在苹果中多菌灵的最大残留量为5 mg· mL-1[14]。 农产品中多菌灵残留检测分析对于保障农产品安全和人类健康有十分重要的作用。

目前, 多菌灵的检测方法有高效液相色谱法[5]、 液相色谱-质谱联用法[6]、 电化学[3]、 荧光法[7]和SERS[4, 8, 9]等多种方法。 其中色谱法是目前检测多菌灵的主要方法, 该方法具有灵敏度高、 特异性强、 应用范围广等优点, 但是存在设备昂贵、 前处理复杂等问题, 使其在实际检测中受到一定的限制。 SERS是一种分子振动光谱, 能够提供几乎所有分子结构的指纹信息, 但农产品有机质成分复杂, 严重干扰SERS检测的特异性。 近年来以SERS的高灵敏度和分子“ 指纹” 图谱特性[10]为基础, 结合免疫学中抗原抗体的新型现代免疫分析技术-SERS标记免疫技术[11], 广泛应用于生物医学、 微生物和农药残留检测[12]。 Choi Namhyun[13]等开发了以孔雀石绿异硫氰酸(MGITC)为拉曼标记分子的SERS免疫探针材料, 结合微流控平台用于鼠疫耶尔森菌F1抗原的灵敏、 快速和安全的检测。 Zhang[14]等设计了一种以5, 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)为拉曼标记分子的金银核壳复合纳米材料, 结合免疫试纸条检测技术实现了对饮用水中双酚A的快速检测。

本研究开发了一种用于苹果复杂有机质中多菌灵残留物的SERS标记免疫检测方法, 其原理和过程如图1所示。 首先包被抗体的Fe3O4磁性纳米材料作为磁分离物, 然后加入待测样品和Au@M@Ag NPs-多菌灵抗原免疫探针, 溶液中的多菌灵和抗原免疫探针竞争性与抗体结合。 当待测溶液中无多菌灵时, 抗原免疫探针与抗体结合, 经过多次磁分离后, 标记探针的抗原会留在抗体包被的磁性纳米材料上, 此时采集的SERS光谱信号最强。 当待测溶液中含有多菌灵时, 多菌灵会与抗体结合, 由此导致Fe3O4上与标记免疫探针作用的抗体数量减少, 经过多次磁分离洗涤后, 结合到Fe3O4上的标记免疫探针数量也随之减少, 因此采集的SERS信号下降。 其中选用在生物拉曼静默区(1 800~2 800 cm-1)有独特且清晰的拉曼特征峰腈类有机物分子4-巯基苯甲腈作为拉曼信号分子, 同时利用Fe3O4磁性纳米材料的磁分离功能对特异性结合产生的Fe3O4-抗体-抗原-Au@M@Ag NPs产物进行快速分离, 实现了对多菌灵的特异性快速检测。

图1 SERS标记竞争型免疫技术检测原理示意图Fig.1 Schematic illustration of SERS-label based on competitive immunoassay

该SERS标记免疫检测方法具有三个优势: (1) 使用4-巯基苯甲腈的碳氮三键在生物静默区的拉曼特征峰以避免苹果中有机质对SERS信号的重叠干扰, 有效的提高了SERS信号灵敏度。 (2) 合成了以β -巯基乙胺为骨架结构, 4-巯基苯甲腈为标记分子的核-分子-壳的金银复合纳米材料, 有效的提高了SERS的信号稳定性。 (3) 采用Fe3O4磁性纳米材料的磁性功能对特异结合产生的Fe3O4-抗体-抗原-Au@M@Ag NPs产物进行快速分离, 提高了检测方法的便捷性。

1 实验部分
1.1 化学试剂

硝酸银(AgNO3)、 氯金酸(HAuCl4)、 柠檬酸钠(C6H5Na3O7· 2H2O)、 抗坏血酸(ascorbic acid, AA)、 十六烷基三甲基氯化铵(Hexadecyltrimethylammonium chloride CTAC)、 β -巯基乙胺(Cysteamine)、 巯基聚乙二醇羧酸(HS-PEG-COOH)、 吐温-20和牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)购自国药控股化学试剂有限公司(中国)。 4-巯基苯甲腈(4-Cyanothiophenol)购自Sigma-Aldrich公司(美国)。 多菌灵、 毒死蜱、 甲基对硫磷、 乐果、 福美双和马拉硫磷、 N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxy succinimide, NHS)和(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcabodiimide hydrochloride EDC]购自阿拉丁化学有限公司(中国上海)。 25 mg· mL-1羧基修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒购自苏州维度生物技术有限公司(中国苏州)。 多菌灵抗体和抗原由山东绿都生物技术产业(中国滨州)提供。 磷酸缓冲溶液(PBS, 0.01 mol· L-1, pH 7.4)购自上海麦克林有限公司(中国上海), PBST缓冲液的制备: 将0.05%(w/v)吐温-20添加到PBS缓冲液中, 4 ℃保存以备用。 其他试剂均为分析纯, 无需进一步纯化即可直接使用, 所有实验中均使用去离子水。

1.2 仪器

金纳米粒子(AuNPs)和Au@M@AgNPs的尺寸以及微观形貌通过在200 kV的工作电压下的高分辨率透射电子显微镜(FEI TalosF200x, 美国Thermo Fisher Scientific Ltd)(TEM)获得。 紫外可见分光光度计(T6, 北京普析仪器有限公司, 中国北京)用于测量AuNPs和Au@M@AgNPs的紫外消光光谱。 样品拉曼光谱使用激发光源为683 nm的共聚焦拉曼光谱仪(XploRA Plus, HORIBA. Ltd, 法国), 采集参数设置: 激光功率是最大功率的25%, 波数精度为2 cm-1; 积分时间为2 s, 积分次数为10次。

1.3 Fe3O4-多菌灵抗体复合物的合成

Fe3O4-抗体复合物的制备方法[13]: 取50 μ L羧基修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒(1 mg· mL-1), 采用磁性聚集原理用PBST洗涤两次。 将磁性纳米粒子重悬于1 mL的PBS溶液后加入10 μ L EDC(1 mg· mL-1)和NHS(1 mg· mL-1)溶液, 搅拌下孵育活化30 min。 再洗涤两次重新分散于PBS溶液中加入100 μ L多菌灵抗体, 37 ℃下震荡孵育2 h。 再次使用PBST溶液洗涤除去游离的抗体并分散于PBS溶液中加入质量分数为5%的BSA封闭缓冲液并在37 ℃下震荡孵育2 h, 以封闭剩余的活性位点。 最后, 用PBST溶液洗涤制备获得Fe3O4-多菌灵抗体(Fe3O4-Antibody), 4 ℃下保存在PBS缓冲液中备用。

1.4 Au@M@Ag NPs SERS纳米标签的制备

核-分子-壳“ 三明治式” 结构的Au@M@AgNPs(M: 分子)纳米粒子制备方法[15, 16, 17]如下:

合成25 nm AuNPs: 配100 mL(0.25 mmol· L-1)HAuCl4水溶液, 在恒温磁力搅拌器中剧烈搅拌加热至沸腾(设置温度100 ℃), 迅速加入1 mL(质量分数为5%)C6H5Na3O7· 2H2O水溶液, 恒温加热20 min, 待颜色变为酒红色后, 停止反应冷却至室温。 离心洗涤一次(8 500 r· min-1, 15 min)去除上清液, 等体积分散于20 mmol· L-1 CTAC水溶液中, 4 ℃保存备用。

合成Au@M NPs 纳米材料: 取10 mL AuNPs 于烧杯中, 加入适量的β -巯基乙胺(10 mmol· L-1)和4-巯基苯甲腈(10 mmol· L-1)混合液, 在30 ℃下孵育45 min。 在反应结束后, 离心洗涤两次(10 min, 8 000 r· min-1)去掉上清液后, 制备得Au@M NPs重新分散于等体积的20 mmol· L-1 CTAC水溶液中备用。

合成Au@M@AgNPs: 取上述制备的纳米材料10 mL, 在60 ℃剧烈搅拌下, 加入不同体积的AgNO3(2 mmol· L-1), 恒温搅拌20 min后, 加入相同体积的抗坏血酸(0.1 mol· L-1), 70 ℃恒温加热反应60 min, 冰浴以终止反应离心洗涤两次(6 000 r· min-1, 10 min), 最后置于20 mmol· L-1 CTAC溶液中以备后用。

1.5 Au@M@AgNPs-多菌灵抗原免疫探针的制备

1 mL Au@M@AgNPs纳米溶液中加入10 μ L HS-PEG-COOH(10 mmol· L-1)搅拌孵育45 min, 反应结束后, 离心洗涤去除未吸附的HS-PEG-COOH。 重新分散于等体积的去离子水中, 加入5 μ L EDC(1 mg· mL-1)和5 μ L NHS(1 mg· mL-1), 搅拌活化45 min, 将活化产物离心(6 000 r· min-1, 10 min)洗涤去除上清液, 重新分散于去离子水中。 随后, 加入100 μ L多菌灵抗原, 37 ℃下震荡孵育2 h。 最后, 加入100 μ L质量分数为2%的BSA封闭液, 37 ℃下震荡孵育2 h以封闭未结合位点。 反应产物离心洗涤两次(6 000 r· min-1, 10 min)后, 获得Au@M@AgNPs-多菌灵抗原免疫探针, 并将其重悬于PBS溶液中4 ℃保存以备用。

1.6 建立多菌灵SERS标记免疫检测方法

基于以上的检测原理, 用磁体分离反应产物, 并用PBST溶液洗涤2次后用PBS溶液洗涤1次最后浓缩至100 μ L水溶液中, 置于信号检测皿中进行拉曼光谱采集并进行分析。 每个样品采集30次信号, 取其平均值代表样品的SERS。 对于同一浓度下的多菌灵标准品, 重复三次实验以获得稳定性的检测结果, 为4-巯基苯甲腈的2 227 cm-1处的特征峰强度与多菌灵标准品溶液的浓度之间建立关系提供数据支撑。

标准偏差计算公式[18]

S=1N-1i=1N(Xi-X̅)2(1)

式(1)中, S为标准偏差; N为检测次数; Xi为同一样品不同检测点i; X̅为计算平均值。

相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)[19]计算公式, 见式(2)

RSD=(S/X̅)×100%(2)

1.7 苹果中多菌灵含量的测定

将上述建立的SERS标记免疫技术用于含有多菌灵的苹果检测。 将浓度梯度依次为0、 100、 200和300 nmol· L-1多菌灵标准品分别加入苹果中, 将苹果破碎榨汁, Whatman滤纸过滤10 mL鲜榨苹果汁, 取滤液以10 000 r· min-1离心20 min去除较大的颗粒。 0.22 μ m微孔滤膜过滤上清液再次过滤除杂。 最后, 取制备的苹果样品和Au@M@AgNPs-多菌灵抗原免疫探针混合, 再加入包被多菌灵抗体的Fe3O4磁性纳米材料溶液, 通过磁分离获得反应产物。 采集并分析反应产物的SERS特征峰, 取4-巯基苯甲腈在2 227 cm-1处特征峰强度值代入已建立的多菌灵检测回归标准曲线, 计算得到苹果样品中的多菌灵含量, 并计算其相应的回收率。

回收率计算公式

P=c2-c1c3×100%(3)

式(3)中, P为回收率; c1为空白样品的浓度; c2为检测浓度; c3为加标浓度。

2 结果与讨论
2.1 Au@M@Ag纳米材料的表征

研究制备了核-分子-壳“ 三明治式” 结构的金银核壳纳米材料, 其中分子层由4-巯基苯甲腈和β -巯基乙胺组成。 4-巯基苯甲腈为信号标记分子, β -巯基乙胺为骨架分子对AuNPs表面进行氨基化用以调控银壳的生成速率。 在其他合成条件相同时, 选取β -巯基乙胺为表面氨基修饰物, 通过改变两种分子的比例获取最佳的SERS信号。 如图2(a) 所示, 在β -巯基乙胺体积不变时, 改4-巯基苯甲腈加入量, 合成复合纳米材料的紫外可见图。 仅有β -巯基乙胺骨架分子时合成的复合材料中在450 nm处有紫外吸收峰, 其为银壳的紫外吸收峰。 加入4-巯基苯甲腈不同体积以改变两种分子的比例时, 在约510 nm出现金核的紫外吸收峰, 与之前的探究试验结果相一致。 4-巯基苯甲腈中碳氮三键对Ag粒子在金核的表面沉积有阻碍作用。 结合图2(b) SERS光谱图可以表明加入10 μ L(10 mmol· L-1)的4-巯基苯甲腈时, 其标记物在2 227 cm-1处的增强信号最佳。

图2 (a) 在不同4-巯基苯甲腈体积(0、 2、 5、 10、 15和20 μ L)下, Au@M@AgNPs的紫外可见光谱; (b) 对应的Au@M@AgNPs的4-巯基苯甲腈SERS光谱Fig.2 (a) UV-Vis spectra of Au@M@AgNPs with the addition on the different volume (0, 2, 5, 10, 15 and 20 μ L) of 4-Cyanothiophenol; (b) SERS spectra of 4-Cyanothiophenol enhanced by six types of Au@M@AgNPs

通过调节银壳的厚度以控制局部表面等离子体共振特性, 以获得最佳SERS信号。 图3(a)为AgNO3的加入量依次为0、 10、 15、 20、 25和30 μ L时, 其合成Au@M@Ag纳米复合材料的紫外可见吸收光谱。 实验结果表明随着AgNO3加入量的增加, 金核的紫外吸收峰从520 nm逐渐蓝移并逐渐消失; 银壳紫外吸收峰在400~420 nm发生明显变化, 表明银壳厚度逐渐增加。 图3(b)为AgNO3加入量不同时, 对应的SERS信号。 随着AgNO3加入量的增加, 4-巯基苯甲腈在2 227 cm-1处的SERS特征峰逐渐增强, 在加入量为15 μ L时, 达到最佳值; 之后AgNO3继续增加, 其特征峰强度降低并趋于稳定。 试验结果与参考文献中关于SERS增强机理相一致。 图3(c)为AgNO3加入量为15 μ L时, Au@M@Ag纳米复合材料的TEM结果, 表示合成了均匀一致的金银核壳纳米材料。 图3(d)为AgNO3加入量不同时, 4-巯基苯甲腈在2 227 cm-1处的SERS特征峰强度变化曲线, 表明AgNO3加入量为15 μ L时增强效果最佳。

图3 (a) AgNO3不同体积(0、 10、 15、 20、 25和30 μ L)下, Au@M@AgNPs的紫外可见光谱; (b) AgNO3不同体积(0、 10、 15、 20、 25和30 μ L)下Au@M@AgNPs的SERS光谱; (c)在AgNO3体积为15 μ L下, Au@M@AgNPs的TEM结果; (d) AgNO3不同体积(0、 10、 15、 20、 25和30 μ L)下, 4-巯基苯甲腈在2 227 cm-1处的SERS特征峰强度值变化曲线Fig.3 (a) UV-Vis spectra of Au@M@AgNPs with the addition of different volume (0, 10, 15, 20, 25 and 30 μ L) of AgNO3; (b) SERS spectra of Au@M@AgNPs with the addition of different volume (0, 10, 15, 20, 25 and 30 μ L) of AgNO3; (c) TEM image of Au@M@AgNPs synthesized with 15 μ L AgNO3; (d) SERS intensity detected at the 2 227 cm-1 characteristic peak of 4-Cyanothiophenol for different volume (0, 10, 15, 20, 25 and 30 μ L) of AgNO3

2.2 采用SERS标记免疫技术检测多菌灵

图4(a)为Fe3O4磁性纳米材料上包被的多菌灵抗体的浓度为5 μ g· mL-1, 拉曼标记免疫探针连接的多菌灵抗原的浓度为2.5 μ g· mL-1时, 多菌灵标准品溶液的浓度依次为0、 0.5、 1、 5、 10、 20、 50、 100、 200和300 nmol· L-1时, 间接竞争性SERS标记免疫技术测得磁分离反应产物的SERS光谱。 依据该检测方法的实验原理, 多菌灵标准溶液的浓度越高, 与多菌灵抗原的竞争反应越强烈, 从而与磁性抗体结合的抗原越少, SERS信号就越弱。 实验结果与实验设计原理相一致。 图4(b)是以多菌灵标准品溶液的浓度为横坐标, 磁分离后反应产物中4-巯基苯甲腈在2 227 cm-1处的SERS特征峰强度值为纵坐标, 计算间接竞争性SERS标记免疫技术检测多菌灵的标准曲线。 如图4(b)所示, 建立的线性方程为y=-3 189x+7 923, 其中x为多菌灵浓度的对数logc(nmol· L-1), 线性相关性为R2=0.986, 线性范围为0.5~300 nmol· L-1

图4 (a) SERS标记免疫法检测不同浓度多菌灵的SERS光谱; (b)不同浓度多菌灵的SERS光谱在2 227 cm-1处特征峰强度变化图; 插图: 2 227 cm-1处SERS特征峰强度值与多菌灵浓度的关系Fig.4 (a) SERS spectra of different concentrations of carbendazim detected by SERS-label based on competitive immunoassay; (b) SERS signal intensity at peak of 2 227 cm-1 with the increase of carbendazim concentration; Inset: linear calibration of SERS intensity at 2 227 cm-1 versus carbendazim concentration

2.3 选择性、 稳定性和重现性

为了评估该SERS标记免疫检测法的选择性, 研究选取了其他五种常见的农药, 毒死蜱、 甲基对硫磷、 乐果、 福美双、 马拉硫磷及空白用于验证该方法对多菌灵的选择性, 选取2 227 cm-1处特征峰强度值用于后续的数据处理。 结果如图5所示, 在该检测体系中分别加入浓度为20 mmol· L-1的毒死蜱、 甲基对硫磷、 乐果、 福美双、 马拉硫磷和空白样时, 2 227 cm-1处特征峰SERS信号强度均没有发生明显变化, 仅当目标物为多菌灵时, 检测体系中的2 227 cm-1处特征峰SERS强度明显降低。 结果表明加入多菌灵与免疫抗原探针发生竞争性免疫反应, 导致SERS信号降低。 因此, 本实验所构建的SERS标记免疫检测法选择性好, 可以对多菌灵有良好的选择性响应。

图5 在不同农药存在下, 2 227 cm-1处特征峰SERS信号强度值
1: 多菌灵; 2: 毒死蜱; 3: 乐果; 4: 马拉硫磷; 5: 福美双; 6: 甲基对硫磷; 7: 空白样
Fig.5 Inthepresence of different pesticides the SERS signal intensity value of the characteristic peak at 2 227 cm-1
1: Carbendazim; 2: Chlorpyrifos; 3: Dimethoate; 4: Matathion; 5: Thiram; 6: Parathion-methyl; 7: Blank

为了评估该SERS标记免疫检测法的信号稳定性, 研究选取检测体系对多菌灵(10 nmol· L-1)的检测SERS信号的稳定性为对象。 如图6所示, 其为在多菌灵为10 nmol· L-1下对检测样品的同一深度的不同位点, 同一位点的不同聚焦深度共进行25次的SERS信号采集。 取其中2 227 cm-1处特征峰的SERS信号强度值, 计算获得其强度相对标准偏差(RSD)为1.13%, 表明该SERS标记免疫检测方法具有良好的稳定性。

图6 竞争性免疫SERS标记法检测多菌灵的信号稳定性Fig.6 Signal stability of SERS-label based on competitive immunoassay for carbendazim detection

为了评估该SERS标记免疫检测法的信号重现性, 选取同一浓度下检测体系对其检测SERS信号的重现性为标准。 如图7所示, 为10次对同一浓度多菌灵的实验检测SERS信号结果, 其中取2 227 cm-1处特征峰的SERS信号强度值, 计算获得其强度相对标准偏差(RSD)为1.06%, 表明该SERS标记免疫检测方法具有良好的重现性。

图7 SERS标记免疫法检测多菌灵的信号重现性Fig.7 Signal reproduction of SERS-label based on competitive immunoassay for carbendazim detection

2.4 苹果样品中多菌灵检测

采用标准加入法评估SERS标记免疫检测方法在苹果样品中多菌灵检测的可行性。 根据第1.7节制备含有不同浓度多菌灵的苹果进行实际样品检测。 表1显示在不同加标浓度下检测的回收率在95.6%~98.3%之间, RSD值小于1%。 实验数据证实所建立的SERS标记免疫检测方法在实际样品检测中有巨大的应用价值。

表1 检测苹果中的不同农度多菌灵 Table 1 Determination of carbendazim in apple juice samples at different concentration
3 结论

探索了一种新型的SERS标记免疫检测方法, 用于检测苹果中的多菌灵。 以Au@M@AgNPs-多菌灵抗原免疫探针为SERS信号, 其中免疫探针分子(4-巯基苯甲腈)在生物静默区2 227 cm-1处具有一个稳定且明显的SERS信号特征峰, 可以避免苹果中其他有机质干扰。 用包被抗体的Fe3O4磁性纳米材料捕获并富集信号。 根据多菌灵和抗原竞争性结合抗体, SERS信号强度与待测样品中多菌灵的含量为负相关, 从而建立2 227 cm-1特征峰强度值与多菌灵浓度之间相关的标准回归曲线。 建立的线性方程为y=-3 189x+7 923, 其中x为多菌灵浓度的对数logc (nmol· L-1), 线性相关性为R2=0.986, 线性范围为0.5~300 nmol· L-1。 结果表明SERS标记免疫检测方法具有良好的选择性、 稳定性和重现性。 同时, 该检测方法在苹果中多菌灵检测的回收率为95.6%~98.3%之间。 SERS标记免疫检测方法具有良好的选择性、 稳定性和重现性。

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