平菇由国家食用菌产业技术体系牡丹江、 延吉、 沈阳、 北京、 唐山、 郑州、 驻马店、 武汉、 随州、 济南、 泰安、 杭州、 丽水、 福州、 漳州、 南昌、 拉萨、 昆明、 新疆等综合试验站提供, 共收集黑龙江、 吉林、 辽宁、 北京、 河北、 河南、 湖北、 山东、 浙江、 福建、 江西、 西藏、 云南、 新疆等14个省份和直辖市的85份样品。 将平菇去除杂质, 干燥, 粉碎, 过200目筛, 样品粉末真空密封, 于低温干燥处保存。

NicoletiS10 傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Scientific), 便携式HY-12型压片机(天津天光光学仪器有限公司), GENESYS 10S UV-Yis紫外可见分光光度计(美国Thermo Scientific), K-375型凯氏定氮仪(瑞士BUCHI), CS-700高速多功能粉碎机(武义海纳电器有限公司), 200目不锈钢筛等。

数据采用Omnic v8.2光谱采集软件、 The Unscrambler X 10.4、 matlab2014b、 origin2019b、 python3.7数据处理软件进行处理。

分别将平菇粉末及溴化钾置于恒温干燥箱中脱水至恒重。 分别精确称量1.8 mg平菇干粉和190 mg溴化钾放入玛瑙研钵中混合研磨, 压片, 使用Omnic v8.2软件采集平菇中红外光谱数据。 波数范围4 000~400 cm^-1, 分辨率为4 cm^-1, 扫描次数为16次, 每个样本重复扫描3次, 取平均光谱。 溴化钾压片扣除背景。 光谱采集过程中, 保持室内温度为25 ℃, 相对湿度为80%。

1.4.1 试样处理

采用凯氏定氮法。 称量平菇干粉0.2 g, 放置于定氮瓶中, 依次加入硫酸铜0.2 g、 硫酸钾6 g及硫酸20 mL, 轻摇后于瓶口放一小漏斗, 放于高温消解炉上, 加热, 待内容物完全炭化, 瓶内液体轻微沸腾并呈现蓝绿色澄清, 继续加热0.5 h, 放置室温冷却。 样品检测过程中, 设置试剂空白组做空白对照。

1.4.2 平菇干粉样品检测

于接收瓶中依次加入硼酸溶液10.0 mL及甲基红乙醇溶液与溴甲酚绿乙醇溶液的混合溶液2滴, 冷凝管下端口调整至溶液液面以下, 定氮仪检测。 盐酸标准滴定液滴定液体颜色由酒红色变为绿色。 样品检测过程中, 设置试剂空白组做空白对照。

1.5.1 样品处理

准确称量0.25 g平菇干粉样品置于250 mL锥形瓶中, 加纯净水50 mL和盐酸50 mL, 冷凝回流3 h。 室温冷却, 过滤并洗涤滤渣, 滤液及洗涤液合并后定容至250 mL, 所得溶液为待检测样品溶液。

1.5.2 葡萄糖标准曲线的绘制

准确量取不同体积标准葡萄糖溶液分别置于10 mL容量瓶, 纯净水定容。 准确量取上述标准葡萄糖溶液1 mL于具塞比色管中, 加入1 mL苯酚溶液, 摇匀, 再分别加入浓硫酸5 mL, 摇匀混合, 室温反应30 min。 设置分光光度计于λ 490 nm, 测定吸光度值, 计算回归方程。

1.5.3 样品检测

准确量取1 mL待测液于具塞比色管中, 加入1 mL苯酚溶液, 摇匀, 再分别加入浓硫酸5 mL, 摇匀混合, 室温反应30 min。 设置分光光度计于λ 490 nm, 测定吸光度值, 依据回归方程计算多糖含量。

1.6.1 数据预处理

扫描得到的红外光谱包含了背景噪声、 仪器噪声以及环境噪声等诸多干扰, 并且红外光谱严重存在的重叠峰, 造成分析困难。 需要对原始红外光谱进行适当的预处理, 以消除噪声干扰、 提取特征变量、 优化光谱范围以减弱或消除各种因素对光谱的影响, 为建立模型奠定基础。 数据预处理方法主要有多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 标准正态变换(standard normal variate transformation, SNV)、 正交信号校正(orthogonal signal correction, OSC)、 光滑加一阶导数(F-G D(1nd, 2.5))、 光滑加二阶导数(S-G D(2nd, 2.5))等, 用以上五种方法进行单独处理, 筛选最优的2种方法进行组合处理, 确定最佳光谱预处理方法^[9]。

1.6.2 训练集和预测集划分

在模型的建立过程中校正集和验证集的选择对于模型的预测能力起到至关重要的作用, 校正集要具有较好的代表性, 防止校正集中自变量的范围不能覆盖验证集中自变量范围的情况出现, 因此利用联合x-y距离的样本集划分(Sample set partiitioning based on joint x-y distance, SPXY)方法对样本进行距离计算^[10]。

1.6.3 LASSO光谱特征数据选择

最小绝对收缩和选择算法(LASSO)不仅能够对全光谱数据进行筛选, 降低输入特征的数目, 以提高建模速度减少光谱信息重叠; 而且通过增加范式函数, 调整参数降低模型的复杂程度可获得有效避免过度拟合的效果^{[11, 12]}。 在线性回归模型的普通最小二乘基础上加入惩罚函数, 具体表示为

$\underset{\beta }{\mathop{\text{min}}}\,-\overset{n}{\mathop{\underset{i=1}{\mathop \sum }\,}}\,{{y}_{i}}\text{ln}\left[ \Lambda \left( x_{i}^{t}\beta \right)\left] -\text{ }\!\!~\!\!\text{ }\overset{n}{\mathop{\underset{i=1}{\mathop \sum }\,}}\,\left( 1-{{y}_{i}} \right)\text{ln} \right[1-\Lambda \left( x_{i}^{t}\beta \right) \right]+\lambda \|\beta {{\|}_{1}}$

其中λ > 0为调整参数, 其大小通过交叉验证或者基于信息准则模型确定, λ 越大对变量较多的线性模型的惩罚力度就越大, 从而最终获得一个变量较少的模型。 采用10次交叉验证的方法对LASSO算法进行训练, 从而寻找最优λ , 最终得到最有效的特征波段。

1.6.4 模型建立及评价

将最优预处理条件下提取的特征波段作为输入变量与化学分析法测定的蛋白质及多糖含量结合, 采用偏最小二乘回归法(PLS)构建校正模型。 以验证集的回归系数(R²)、 校正均方根误差(RMSECV)、 预测均方根误差(RMSEP)和相对分析误差(RPD)评价模型预测能力, 其中R²越接近于1, RMSEC与RMSEP越小, RPD> 3时, 模型具有良好的预测性能、 稳健性好^[13]。

不同来源的平菇红外光谱图显示, 平菇共有20个明显的吸收峰, 其中1 655, 1 651, 1 574, 1 557, 1 404, 1 241, 1 204, 1 079, 1 031, 995和943 cm^-1附近是平菇蛋白质主要识别峰, 3 350, 2 929, 1 150和576 cm^-1附近是平菇多糖主要识别峰^[14](图1)。 不同来源的平菇红外光谱走向及出峰位置基本一致, 无显著差异; 但是, 吸收峰的响应值差异明显。 结果说明, 不同来源的平菇营养成分化学组成相同, 但是同一营养成分在不同来源的平菇中含量存在差异, 为建立定量预测模型提供了理论依据。

图1

Fig.1

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	图1 平菇的红外光谱图Fig.1 FTIR of fruting bodies of Pleurotus ostreatus

2.2.1 校正集和验证集的划分

采用SPXY算法对85份平菇样本的变量X和变量Y进行距离计算, 将计算结果按3∶ 1的比例划分为校正集和验证集, 即用于构建模型的样本64个, 验证集样本21个。 表1所示结果表明, 采用SPXY算法筛选出的校正集样本具有代表性, 其自变量的变化范围可以覆盖验证集自变量的变化范围, 不会出现验证集数据无法外推而造成的模型预测能力低的情况。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 平菇蛋白质和多糖含量样本划分 Table 1 Division of protein and total polysaccharides from Pleurotus ostreatus 蛋白质 多糖 校正集 验证集 校正集 验证集 样品数量/个 64 21 64 21 最低含量/[g· (100 g)-1] 12.7 15.3 1.88 1.96 最高含量/[g· (100 g)-1] 31.4 25.4 10.92 7.63 平均含量/[g· (100 g)-1] 21.79 21.19 5.73 4.47 标准偏差/% 4.06 2.41 2.33 1.86

表1 平菇蛋白质和多糖含量样本划分 Table 1 Division of protein and total polysaccharides from Pleurotus ostreatus

光谱预处理可以优化光谱范围、 消除噪音干扰, 是弥补光谱缺陷的有力工具, 然而不同预处理方式对光谱不同波段的强弱化能力不同, 因此需要进行光谱预处理方法的筛选。 采用单一或组合预处理方法从光谱中提取与平菇蛋白质、 多糖相关的信息, 对比回归系数R²和相对分析误差确定最优预处理方法, 为避免数据过于密集, 最优预处理方法对比仅显示识别率最高的前7个结果。 表2和表3所示结果表明, 平菇蛋白质含量检测的红外光谱最佳预处理方法为OSC with S-G D(2nd, 2.5); 而平菇多糖含量检测的红外光谱最佳预处理方法为OSC with F-G D(1nd, 2.5)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同光谱预处理对蛋白质模型的影响 Table 2 Results of Protein model with different spectral pretreatment methods 光谱范围/cm-1 光谱预处理 校正集 验证集 R2 RMSECV R2 RMSEP RPD 全波段 无 0.536 4 2.518 1 0.359 4 3.004 7 1.071 6 SNV 0.554 9 2.467 4 0.384 0 2.955 3 1.083 0 MSC 0.556 2 2.463 8 0.322 9 3.028 1 1.056 6 OSC 0.552 6 2.473 7 0.531 0 2.563 6 1.180 1 F-G D(1nd, 2.5)① 0.532 8 2.522 8 0.285 8 3.161 2 1.043 5 S-G D(2nd, 2.5)② 0.653 1 2.178 2 0.386 5 2.971 4 1.084 3 OSC with S-G D(2nd, 2.5) 0.886 0 1.248 7 0.500 9 2.659 3 1.155 4 注: ①F-G D(1nd, 2.5)表示: 预处理方法为Savitzky-Golay Derivative, 一阶导数, 二次多项式, 5点平滑, 下同; ②S-G D(2nd, 2.5)表示: 预处理方法为Savitzky-Golay Derivative, 二阶导数, 二次多项式, 5点平滑, 下同

表2 不同光谱预处理对蛋白质模型的影响 Table 2 Results of Protein model with different spectral pretreatment methods

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同光谱预处理对多糖模型的影响 Table 3 Results of total polysaccharidess model with different spectral pretreatment methods 光谱范围/cm-1 光谱预处理 校正集 验证集 R2 RMSECV R2 RMSEP RPD 全波段 无 0.006 1 2.259 0 NA③ 2.370 8 / SNV 0.034 1 2.227 0 NA 2.342 0 / MSC 0.033 9 2.227 1 NA 2.309 9 / OSC 0.559 5 1.503 9 0.267 5 1.961 6 1.037 8 F-G D(1nd, 2.5) 0.532 8 2.527 8 0.346 1 3.020 7 1.065 9 S-G D(2nd, 2.5) 0.082 1 2.171 0 NA 2.309 9 / OSC with F-G D(1nd, 2.5) 0.770 2 1.086 2 0.366 1 1.844 3 1.074 6 注: ③NA 表示没有线性关系

表3 不同光谱预处理对多糖模型的影响 Table 3 Results of total polysaccharidess model with different spectral pretreatment methods

经光谱预处理后, 光谱平滑、 特征峰明显, 且隐藏的重叠峰最大限度被分离出来。 但是, 由于光谱存在7 458个光谱波段, 数据量大、 数据没有代表性, 导致模型过拟合或欠拟合的情况, 模型的准确度和预测性能偏低。 因此, 采用LASSO算法将最优预处理条件下的光谱数据进行特征波段筛选。 λ 参数通过10次交叉验证, 筛选蛋白质含量预测特征波数93个, 多糖含量预测特征波数段92个, 光谱数据点均从7 458个下降到100个以下, 压缩率达到98%, 大大降低了模型的复杂度。 具体主要特征波数及其所对应与官能团分析, 见表4。 目前, 傅里叶变换红外光谱技术在食用菌营养成分定量预测方面的研究报道较少, 并且尚未有将此项技术应用于平菇营养成分含量预测的报道。 仅有朱哲燕等运用红外光谱技术, 采用连续投影算法(SPA)进行特征变量筛选, 建立香菇中蛋白质含量预测模型的验证集回归系数为0.899 5^[15]。 本研究所建立的平菇蛋白质含量预测模型的回归系数为0.987 2, 明显优于已报道的结果。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 选择特征波数的主要官能团信息 Table 4 Main functional group information for selecting characteristic wave number 成分 红外特征波段/cm-1 基团信息 蛋白质 1 204 色氨酸(— CC) 1 241 酪氨酸(— OH) 1 404 谷氨酸(COO-) 1 574 天冬氨酸(COO-) 多糖 536, 575 糖类 1 150 糖类C— O— C伸缩 2 929 糖类CH3和CH2伸缩 3 350 糖类O— H伸缩

表4 选择特征波数的主要官能团信息 Table 4 Main functional group information for selecting characteristic wave number

将LASSO算法筛选的特征波段作为输入变量结合化学分析法测定的蛋白质含量及多糖含量建立PLSR定量预测模型(表5)。 蛋白质模型验证集回归系数为0.987 2, RPD为8.840 6(图2); 多糖模型验证集回归系数为0.980 3, RPD为7.119 8(图3)。 结果表明, LASSO算法选择的特征变量可以代替原始光谱进行建模, 并且与全光谱建模相比所建模型建模速度快, 预测性能较好。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 PLS模型构建 Table 5 PLS Model construction 成分 光谱预处理 波段数 校正集 验证集 R2 RMSECV R2 RMSEP RPD 蛋白质 OSC+S-G D(2nd, 2.5) 93 0.999 8 0.047 7 0.987 2 0.506 8 8.840 6 多糖 OSC+F-G D(1nd, 2.5) 92 0.999 9 0.020 1 0.980 3 0.292 9 7.119 8

表5 PLS模型构建 Table 5 PLS Model construction

图2

Fig.2

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	图2 平菇蛋白质模型Fig.2 Protein model of Pleurotus ostreatus

图3

Fig.3

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	图3 平菇多糖模型Fig.3 Total polysaccharidess model of Pleurotus ostreatus