在电击致死案例中, 心脏组织的形态学改变由于电流强度、 电压高低、 通电时间、 机体状态、 电阻大小和所处的外部环境等因素变化而不尽相同。 而实际案件中最常见的致死电压为220 V家用交流电。 为保证实验条件的客观性, 本实验采用220 V电压对样本进行电击处理; 此外, 生物体的心脏部位对电流电击极其敏感, 电击后的主动脉瓣底部内膜会出现斑点或斑块出血, 导致心肌纤维肿胀、 断裂或不规则的波浪状变化^[9]。 因此, 本实验取材于心脏左右心房心室, 取材部位可以使实验应用更加广泛。

选取成年SD大鼠30只, 雌雄不限, 体重180~220 g, 分别经过电击死、 死后电击和对照处理, 每组10只(见表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 样本处理方法统计表 Table 1 Statistics of sample processing methods 死亡方式 死亡过程 样本数量 电击死 动物模型参照文献[10], 电击死组大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后连接自制电击装置, 用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢, 接通电源(220 V, 50 Hz)电击至死 10 死后电击 大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后颈椎脱臼处死, 之后连接自制电击装置, 用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢, 通电2 min(220 V, 50 Hz) 10 对照组 大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后, 连接自制电击装置, 用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢2 min, 不通电, 颈椎脱臼处死 10

表1 样本处理方法统计表 Table 1 Statistics of sample processing methods

各组大鼠处死后取心脏组织, 左右心房心室心肌前壁中央部心肌组织各约10 mg一块, 每只大鼠至少取材四块, -80 ℃低温保存。

将心脏组织通过Vir Tis Wizard 2.0 冻干机冻干后采用溴化钾压片法制备样品, 实验采用VERTEX70型号的傅里叶变换红外光谱仪, 设备的性能参数见表2。 在4 000~400 cm^-1的波数范围扫描, 获得吸收光谱。 每次检测样品前均用不含样品的溴化钾压片采集一次背景光谱。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 设备及参数的基本信息 Table 2 Basic information of equipment and parameters 设备 参数 德国BRUKER布鲁克VERTEX 70傅里叶变换红外光谱仪 (1) 信噪比: 45 000∶ 1 (2) 分辨率: 4 cm-1 (3) 仪器种类: 傅里叶变换型 (4) 仪器类型: 实验室型 (5) 扫描速度: 40张· s-1 (6) 波数范围: 4 000~400 cm-1

表2 设备及参数的基本信息 Table 2 Basic information of equipment and parameters

标准正态变换(standard normal variate, SNV)校正光谱预处理方法用于消除样品颗粒、 表面散射和光程变化对漫反射光谱的影响。 Wu^[11]等利用FTIR-MSP结合化学计量学方法研究不同死因肺水肿液中的生化差异, 在光谱预处理中使用SNV对样本平均光谱进行归一化, 然后使用Savitzky-Golay方法将其转换为二阶导数, 最终提取出15个平滑点作为最小化样本的特征, 减少了特征维度, 从而达到较好的数据降维效果。 特征维度较多不利于后续样本的分类识别, 这样操作可以提升分类器的分类效率, 从而达到较好的分类效果不会丢失关键信息。 最小化样本特征的目的是保留较为重要的信息, 去除非关键信息。 研究结果表明数据维度最终被缩减到生物指纹区域(1 800~900 cm^-1), 该区域提供了有关分子成分的最多信息。 原始光谱预处理的过程包括平滑降噪、 SNV及一阶求导等。 预处理后的光谱数据最大程度地消除了噪声干扰, 突出了光谱的有效特征, 减少了基质的干扰, 预处理后的光谱如图1所示。 电击死组、 死后电击组及对照组各组均表现出相似的红外光谱谱图特征, 谱图中不同峰位的吸收峰反映了对应官能团的振动模式。

图1

Fig.1

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	图1 光谱预处理结果图Fig.1 Spectrum Pretreatment results

竞争性自适应重加权算法(competitive adaptive reweighted sampling, CARS)是一种结合蒙特卡洛采样与PLS模型回归系数的特征变量选择方法, 即保留回归系数绝对值权重较大的点, 去除加权系数小的点, 最终得到最优的变量组合^[12]。 从机器学习的角度分析, 如果直接对数据集进行分析会耗费较长的时间, 由于数据集的冗余性, 使机器难以找到显示解, 最终的分类准确率会偏低。 CARS算法有效地解决了这个问题, 采用搜索绝对回归系数最大的波长及最小交叉验证均方根误差子集的选取方法, 最终找到特征光谱组合。

对变量的选取, 不只一次而是多次的进行特征波长的选取, 选取的都是出现频率高的特征波长。 特征波长提取结果如图2所示, 将提取到的特征波长汇总于表3中。 分析可知, 经过CARS算法提取到的特征波长共计70个; 样本的特征光谱在指纹区范围(1 800~900 cm^-1)内区别最大, 由于该区间可以提供生物样本最多的化合物信息, 因此将预处理后的光谱取1 800~900 cm^-1区间。 结合红外光谱不同区间代表的生化特征汇总表(见表4)可知, 电击致死导致脂质, 酰胺酶Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ , 蛋白质, 脂肪酸和蛋白磷酸化等生物大分子发生结构性特征变化, 而死后电击组组织损伤较轻, 从光谱角度反映出差异。 这是由于电流通过人体产生的强电场, 对细胞膜造成非热性损伤, 细胞膜内外的高电势差会导致电穿孔, 增加细胞膜的渗透性, 使膜蛋白电泳, 改变其功能。 并且电损伤会引起心跳骤停、 呼吸肌痉挛等生理现象, 最终使心肌坏死。 熊鑫等^[13]研究电击死心肌组织磷脂分布, 发现电击会导致心肌纤维断裂, 形成波浪状变化, 而心肌细胞膜磷脂缺乏时, 磷脂缺乏的程度随着时间的推移逐渐加重。 经比对发现, 实验采集的傅里叶变换红外光谱图与病理变化反应一致。

图2

Fig.2

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	图2 特征波长提取Fig.2 Characteristic wavelength extraction

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 特征波长汇总 Table 3 Summary of characteristic wavelengths 特征波长/cm-1 1 801 1 799 1 797 1 795 1 793 1 755 1 753 1 654 1 639 1 637 1 616 1 577 1 496 1 489 1 471 1 469 1 467 1 398 1 396 1 394 1 392 1 390 1 388 1 357 1 355 1 354 1 352 1 350 1 348 1 346 1 344 1 342 1 280 1 278 1 276 1 274 1 272 1 247 1 245 1 244 1 220 1 218 1 217 1 215 1 141 1 139 1 137 1 136 1 122 1 120 1 118 1 116 1 018 1 016 1 014 1 012 1 010 1 008 987 985 983 981 979 977 975 974 972 970 968 966

表3 特征波长汇总 Table 3 Summary of characteristic wavelengths

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同红外光谱区间代表的生化特征汇总表[14] Table 4 Summary of biochemical characteristics represented by different infrared spectral intervals[14] 光谱范围(近似值 cm-1) 生化特征 1 750~1 704 脂质 1 703~1 586 酰胺酶Ⅰ 1 585~1 478 酰胺酶Ⅱ 1 477~1 390 蛋白质 1 389~1 390 脂肪酸和氨基酸 1 304~1 255 酰胺酶Ⅲ 1 250~1 190 DNA/RNA 1 189~1 150 碳水化合物 1 090~1 061 DNA/RNA 1 060~991 糖原 990~940 蛋白磷酸化

表4 不同红外光谱区间代表的生化特征汇总表[14] Table 4 Summary of biochemical characteristics represented by different infrared spectral intervals[14]

随机森林(random forest, RF)模型是机器学习中的常见方法之一, 它将变量(列)和数据(行)随机生成大量分类树, 然后将分类树的结果进行聚合。 RF模型采用多种分类树对数据进行识别和分类, 提高了预测精度。 RF对多元线性数据不敏感, 其结果对缺失和不平衡数据具有稳健性, 而且可以预测多达数千种解释变量的影响, 并被称赞为现有的最佳算法之一。 Tamara Leskovar等^[15]通过FTIR光谱结合数据处理作为评估骨骼遗骸DNA保存的预筛选方法, 通过RF学习算法取得了最佳筛选结果。 Zozan Guleken等^[16]研究了无症状孕妇和症状孕妇感染新冠肺炎后血清水平的差异, 通过RF的机器学习算法计算, 区分准确率达90%以上。 RF的建模过程如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 RF建模过程Fig.3 Stochastic Forest modeling process

经过RF模型处理后的结果如图4和图5所示, 可知特征提取前的RF模型对各样本分类识别率仅为34.9%, 而特征波长提取后的RF模型对各样本预测识别率达到了73.7%。 分析认为, 变量选择算法是法庭科学鉴定中的有效选择, 它可以显著提高数学模型的性能; CARS模型印证了特征提取方法的必要性和有效性, 具有一定的参考价值。

图4

Fig.4

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	图4 特征波长提取前RF模型分类准确率Fig.4 Classification accuracy of random forest model before feature wavelength extraction

图5

Fig.5

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	图5 特征波长提取后RF模型分类准确率Fig.5 Classification accuracy of random forest model after feature wavelength extraction

偏最小二乘法(partial least squares, PLS)是一种多元统计分析方法, 目前在食药环领域都有广泛的应用^[17]。 PLS模型可以用自变量具有多重相关性回归, 且样本点个数少于变量数。 苏承轲^[18]等利用PLS模型来建立安钠咖样品中咖啡因和苯甲酸钠的红外光谱定量模型, 得出咖啡因和苯甲酸钠的PLS定量模型的线性范围分别为10%~80%和20%~90%, 具有较高的实用价值。

支持向量机(support vector machines, SVM)模型是属性空间缺口最大的线性分类器, 主要用于小样本的分类和回归。 传统的SVM模型在处理不同维度的数据时具有良好的分类效果, 但在样本数目却存在内存占用率大、 运行时间长的缺陷。 此外传统的SVM模型对于缺失数据较为敏感, 使用前必须做好特征工程建设。 因此, 设计不同算法模型对传统SVM进行优化, 以期达到最好的分类效果。

粒子群优化(particle swarm optimization, PSO)是一种进化计算方法, 基本思想是通过群体中个体之间的合作和信息共享来寻找最优解。 PSO算法具有收敛速度快, 调整的参数值少的优点, 王小亮^[19]等借助近红外漫反射光谱和化学计量学方法对鲨肝醇片进行研究, 建立PSO-SVM模型对鲨肝醇片进行快速定量分析, 模型预测结果和实测结果基本一致, 在快速药品分析和检测方面有借鉴意义。

灰狼优化算法(grey wolf optimizer, GWO)是一种群体智能优化算法, 具有很强的收敛性能。 由于其参数少、 易于实现的特点, 被广泛应用于化学计量学领域^[20]。 赵昱萱^[21]等利用高光谱技术和化学计量学方法, 开展对薄荷叶上的常见除草剂分类识别工作, 建立GWO-SVM模型进行快速分类, 结果表明测试集的判别准确率达到了100%, 对快速无损识别工作提供了参考。

因此, 实验分别建立PLS模型、 传统SVM模型、 PSO-SVM模型和GWO-SVM模型对经特征提取后的光谱数据进行快速分类识别, 识别的准确率如图6所示。

图6

Fig.6

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	图6 模型分类准确率结果图 (a): SVM分类准确率; (b): PLS分类准确率; (c): PSO-SVM分类准确率; (d): GWO-SVM分类准确率Fig.6 Accuracies of model classification (a): SVM; (b): PLS; (c): PSO-SVM; (d): GWO-SVM

由图6可知, 传统SVM模型分类模型的准确率仅为34.48%, 而PLS模型分类识别的准确率达到61.07%, 这在侧面印证了传统SVM模型对大规模训练样本难以实施, 导致对多分类问题的分类精度达不到理想要求的缺陷。 针对传统SVM模型的不足, 采用了PSO算法和GWO算法对传统的SVM模型进行优化, 结果表明, PSO-SVM模型分类准确率高达100%, GWO-SVM模型的分类准确率达到98.46%, 稍弱于PSO-SVM模型。 为更加直观地看出4种模型对特征提取后光谱数据分类识别准确率的差距, 将各模型对特征提取后的光谱数据分类识别准确率汇总于图7。

图7

Fig.7

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	图7 四种模型准确率的比较Fig.7 Comparison of accuracy of four models

由图7可以看出, PSO-SVM模型的分类识别准确率最高, 达到了100%。 分析可知, 由于PSO算法是从随机解出发, 迭代求解最优解, 该模型以精度高、 收敛快等特点有效弥补了传统SVM模型在解决多分类精度问题上的不足, 具有一定的参考价值, 能够很好地应用于电击死与死后电击的红外光谱鉴别分析。 经PSO-SVM模型分类结果图如图8所示。

图8

Fig.8

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	图8 PSO-SVM模型分类结果图Fig.8 Classification results of PSO-SVM model

由于生物个体死亡(心跳/呼吸停止)后一段时间内, 组成生物个体的不同组织细胞会在死亡后不同的时间内分批停止生理功能(生物学死亡期)。 此时, 组成机体的组织细胞可能仍然存在生理功能, 这种情况下若对一些尚存在生理功能的细胞电击, 它们会出现与生前电击一样的反应(超生反应)。 为保证实验结论的真实性和可靠性, 再取60只成年SD大鼠作实验, 分别进行电击死、 死后电击和对照处理, 每组分别建立死后0.5 h和死后1h 2个亚组, 并对每个亚组各取10只样本, 造模取材方式如同上文。 研究表明, 心脏细胞在15 min左右已基本死亡, 因此死后0.5 h和死后1 h组心脏细胞已没有生理功能, 可以避免超生反应的出现。 由于PSO-SVM模型的能够通过粒子本身寻找到全局最优解, 故PSO-SVM模型对九个亚组的预处理后的光谱进行分析, 结果如图9, 圈与星号重合点的个数与总个数的比值为准确率, 模型分类识别的准确率高达80.85%。

图9

Fig.9

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	图9 九个实验亚组的PSO-SVM模型分类结果图Fig.9 PSO-SVM model classification results of nine subgroups