论文所采用的荧光免疫层析试纸条主要由样品垫、 结合垫、 NC膜、 吸水纸和支持板组成, 结合垫上喷涂有SARS-CoV-2 N蛋白-量子点微球标记物, NC膜上设有含抗人IgG抗体或含抗人IgM抗体的检测线T线和质控线C线^[11]。 样品垫上滴加的血清样本在毛细作用下向吸水垫方向流动, 如果血清样本中含有抗SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体, 在流经结合垫时便会与量子点微球标记物相结合。 当样本流经NC膜时, 抗IgG抗体或抗IgM抗体结合在T线上, 如果样本中不含有抗SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体, 则不会在T线截留量子点微球标记物。 紧接着剩余的混合物会流动到控制线区域。

量子点是目前在生物医学领域前景非常广阔的纳米材料, 其相比于传统的荧光染料, 具有连续且范围宽的激发光谱、 光化学稳定性良好、 受外部因素干扰小。 论文选用了上海昆道生物技术有限公司的免疫层析专用量子点纳米球(QDNBs), 其粒径为(100± 20) nm, 激发波长为365~450 nm, 发射波长为(620± 10) nm。

量子点微球在365 nm紫外激发光下, 会产生红色荧光信号, 量子点标记物浓度不同荧光信号强度也会不同, 如图1所示。 当激发光照射在NC膜上, 且T线上含有量子点微球标记物, 则T线会发出红色荧光变成红色线条, 而无论样本中是否含有IgG和IgM抗体C线都会变成红色, 如果C线未显色则说明本次检测结果无效。 本文所设计的检测仪便是通过检测荧光强度来得知血清中抗SARS-CoV-2 IgG抗体和IgM抗体的浓度, 从而确定样本是否为阳性及其强度。

图1

Fig.1

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	图1 强紫外灯照射下样本浓度不同的试纸条Fig.1 Test strips with different sample concentrations under strong ultraviolet light

采用了一种方波调制与频谱分析相结合的方法, 对测量波长和参考波长的光谱信号使用快速傅里叶变换(FFT)由时域转换到频域进行分析处理, 从而极大地提高了检测仪的灵敏度和信噪比。 首先, CPU获取到经过紫外LED方波调制后激发量子点荧光的多光谱信号, 获取到的多光谱信号为方波信号。 通过串口把测量波长和参考波长的方波信号数据保存到电脑中, 使用MATLAB读取电脑中保存的数据, 用小波滤波算法对读取到的数据进行滤波, 把优化后的小波滤波系数写入CPU的存储模块。 然后, CPU处理模块就可以通过存储的滤波系数对实际测量时采集到的多光谱信号数据进行分块卷积运算以便进行后续信号处理。 经过多次测试表明, 光源噪声和探测器噪声能够被此方法有效滤除, 从而提高检测仪的探测灵敏度^[12]。

通过FFT变换将滤波后的方波信号由时域转换到频域^[13]。 多光谱芯片采集回来的每一个通道的方波信号可由式(1)表示

$\begin{array}{*{35}{l}} {{I}_{\text{in}}}=\frac{4}{\text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }}A\left( \text{sin}\omega t+\frac{1}{3}\text{sin}3\omega t+\frac{1}{5}\text{sin}5\omega t+\frac{1}{7}\text{sin}7\omega t+\ldots \right) \\ =\frac{4}{\text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }}\text{A}\overset{\infty }{\mathop{\underset{n=1}{\mathop \sum }\,}}\,\frac{1}{2n-1}\text{sin}\left[ \left( 2n-1 \right)\omega t \right] \\ \end{array}$(1)

式(1)中, I_in为发射光强, A是幅度常数, ω 为基频。

方波信号的拉普拉斯变换为

$\text{L}\left( {{I}_{\text{in}}} \right)=\frac{4}{\text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }}\text{A}\overset{\infty }{\mathop{\underset{n=1}{\mathop \sum }\,}}\,\frac{\ \ \ \omega \ \ \ \ }{{{s}^{2}}+{{[\left( 2n-1 \right)\omega\ ]}\ ^{2}}}\ \ $(2)

通过传递函数将荧光信号表示为

$\text{Y}\left( \text{s} \right)=\text{G}\left( \text{s} \right)\frac{4}{\text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }}\text{A}\overset{\infty }{\mathop{\underset{n=1}{\mathop \sum }\,}}\,\frac{\omega }{{{s}^{2}}+{{[\left( 2n-1 \right)\omega ]}\ \ ^{2}}}\ \ $(3)

时域输出信号可以表示为

$\text{y}\left( \text{t} \right)=\frac{4}{\text{ }\!\!\pi\!\!\text{ }}\text{A}\overset{\infty }{\mathop{\underset{n=1}{\mathop \sum }\,}}\,\frac{1}{2n-1}\left| G\left( i\left( 2n-1 \right)\omega \right) \right|\cdot \text{sin}\left[ \left( 2n-1 \right)\omega t+{{\varphi }_{2n-1}} \right]$(4)

式(4)中, |G(i(2n-1)ω )|为信号特征量, 使用ST公司提供的DSP库做快速傅里叶变换能够计算出频谱信号。

特征量为频谱信号中基频、 三次谐波和五次谐波的幅度值, 量子点的发射光峰值波长为624 nm, 试验中将多光谱芯片630 nm通道的数据作为测量波长, 将590 nm通道的数据作为参考波长, 求得630 nm通道与590 nm通道的特征量比值, 即

${{R}_{1}}=\frac{{{I}_{\lambda =630\text{nm}}}\ \ \ \ \ \ }{{{I}_{\lambda =590\text{nm}}}\ \ \ \ \ \ }\ \ \ $(5)

荧光强度关系由630 nm通道与590 nm通道的特征量比值标定, 把标定好的系数存于内部存储模块中, 实际测量时, 将测量到的R₁值代入到标定好的荧光强度关系式中, 计算出试纸条C线和T线的荧光强度。 最后将试纸条T线的荧光强度与C线的荧光强度代入到标定好的浓度关系式中得出抗体浓度。

检测仪主要包括CPU信号处理模块、 光源驱动模块、 多光谱探测模块、 电源模块、 显示存储和通信模块, 设计框图如图2所示。 CPU信号处理模块选用了ST公司的STM32F405RGT6微处理器, 将发射角为60° 的紫外LED灯作为光源, 其发射波长为365 nm, 功率为250 mW, 多光谱探测模块选用了艾迈斯半导体的AS7341L多光谱芯片。 检测仪的工作原理为: STM32芯片产生频率为5 Hz的调制方波信号驱动紫外LED灯发射出365 nm的紫外光, 试纸条T线和C线上的量子点标记物被经过调制的紫外光激发产生620 nm左右的红色荧光。 AS7341L将经过滤光片的荧光信号捕获转换成数字信号, 然后通过IIC总线传给STM32芯片。 STM32芯片对读取到的数字信号进行运算得到荧光强度, 结果和检测信息在显示模块上显示出来, 通过存储模块和通信模块进行数据本地存储和云端存储。

图2

Fig.2

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	图2 硬件框图Fig.2 Hardware block diagram

多光谱芯片AS7341L是一款专用于移动设备光谱识别和分析应用的10通道光谱传感器芯片。 其中有1个近红外通道、 1个全光域通道和8个覆盖可见光谱的光学通道, 光谱的响应波长为350~1 000 nm。 其可见光谱范围内的8个光学通道如表1所示, 本文检测仪将F7通道(带宽为50 nm)采集回来的波长信号作为测量波长, 将F6(带宽为40 nm)通道采集回来的波长信号作为参考波长。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 AS7341L光学通道 Table 1 AS7341L optical channel Peak/nm FWHM/nm F1 415 26 F2 445 30 F3 480 36 F4 515 39 F5 555 39 F6 590 40 F7 630 50 F8 680 52

表1 AS7341L光学通道 Table 1 AS7341L optical channel

传统的光学传感器检测方法, 光路设计都十分复杂, 而且会被激发光和背景光等各种光源影响。 本文独创性地设计了一种屋脊形的机械光学系统, 可以有效去除紫外LED背景波长和环境光信号, 同时提高了多光谱探测灵敏度。 检测仪的机械光学系统设计如图3所示。 屋脊形的机械装置包含了发射光路和反射光路。 两个紫外LED灯分别安装在荧光层析试纸条T线和C线的正上方。 发射光路和反射光路呈45° 角, 可有效提高反射光信号的接收效率, 滤光片和多光谱探测模块装在反射导光孔上。

图3

Fig.3

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	图3 光学设计图Fig.3 Optical design drawing

紫外LED灯发射出经过调制的紫外光信号垂直照射在试纸条的T线和C线, 量子点标记物辐射出的荧光在45° 角方向上经过滤光片。 带通滤光片中心波长为(620± 10) nm, 带宽为± 40 nm, 可滤除其他紫外LED光源及环境背景等噪声光信号。 AS7341L将经过滤光片的荧光信号捕获转换成数字信号传给CPU处理模块。

检测仪的UI主界面如图4所示。 当需要测试时, 先填写被测样本所属者的基本信息, 然后扫描试纸条上的二维码获得测试批号并在界面上显示出来。 点击“ 测试” 按钮开始测试, 测试完成后会把结果显示到主界面上, 同时把测试结果上传到云端数据库中, 可以通过PC远程查询历史检测数据, 实现信息化管理。 服务器选用了阿里云, 服务器程序采用开源高性能异步PHP socket框架Workerman进行开发, 服务器数据存储使用MySQL, PC端查询程序使用Qt进行开发。

图4

Fig.4

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	图4 UI主界面Fig.4 UI main interface

将正常人血清进行重复性测试, 连续测试6次, T和C分别表示T线和C线的荧光强度, 测试数据如表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 检测仪重复性测试结果 Table 2 Repeatability test results of the detector 正常人 T C T/C 1 56 844 0.066 2 53 962 0.055 3 54 881 0.061 4 57 1 030 0.055 5 53 907 0.058 6 57 1 071 0.053 平均值 55.00 949.17 0.06 标准差 1.90 88.35 0.00 CV值 3.45% 9.31% 8.30%

表2 检测仪重复性测试结果 Table 2 Repeatability test results of the detector

使用变异系数(CV)来评价检测仪的重复性, CV值为标准差与平均值的比值。 从表2可以看出, 检测仪的检测结果CV值在0~8.30%之间, 其中T线的CV值仅为3.45%。

为了测试检测仪的线性度, 将含有IgG与IgM抗体的溶液, 梯度稀释后得到72.5、 36.25、 18.125、 9.06、 4.13、 2.27、 1.13、 0.57、 0.28、 0.14、 0.071、 0.035和0.018 ng· mL^-1等不同质量浓度的样品溶液。 将不同质量浓度的溶液加样在荧光免疫层析试条上, 经过特定反应时间后, 用本检测仪依次进行测试。 以标准样品中IgG和IgM抗体的浓度(ng· mL^-1)为横坐标, T线与C线的比值为纵坐标, 对测试结果进行线性拟合, 结果如图5所示。 其中线性拟合度> 0.99, 实验结果表明, 在该浓度范围内, 仪器的线性度良好。

图5

Fig.5

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	图5 检测仪的检测结果线性度Fig.5 Linearity of the test result of the detector

从山西瑞豪生物科技有限公司选取36名已接种两剂新冠疫苗的员工, 其中18名为男性18名为女性, 大部分员工接种疫苗的时间不相同。 从这些员工身上采集36份血清样本使用本文所设计的检测仪进行检测, 检测时间为2021年7月30日。 由于IgM抗体具有维持时间短的特点, 本文只对维持时间长且浓度更高的IgG抗体进行检测, 与正常人血清的测试结果相比较判定阴性与阳性, 检测结果如表3所示。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 正常人血清样品IgG抗体检测 Table 3 IgG antibody detection in normal human serum samples 样本 阴性 阳性 数量 9 27 百分比 25 75

表3 正常人血清样品IgG抗体检测 Table 3 IgG antibody detection in normal human serum samples

9份阴性样本的员工信息如表4所示, 其中5名员工的接种时间均已超过半年, 1名员工第二剂接种时间未超过一周, 剩余3名员工在IgG抗体产生的时间范围内, 但用本文检测仪检测为阴性。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 IgG抗体阴性样本信息 Table 4 IgG antibody negative sample information 员工 性别 年龄 第一剂疫苗 第二剂疫苗 1 男 39 2020.10.10 2020.10.26 2 男 28 2021.01.07 2021.01.25 3 男 53 2021.01.07 2021.01.25 4 男 24 2021.01.07 2021.01.25 5 男 39 2021.01.07 2021.01.25 6 男 26 2021.04.30 2021.05.28 7 男 37 2021.05.19 2021.06.10 8 女 48 2021.05.31 2021.07.07 9 女 46 2021.07.04 2021.07.25

表4 IgG抗体阴性样本信息 Table 4 IgG antibody negative sample information