Nicolet Summit PRO型FT-IR 光谱仪(美国Thermo Fisher公司, 配备Omni iD5-ATR型号金刚石附件); SCDEALL VX-Ⅲ 型多管涡旋振荡器(北京安简科技有限公司); TDL-60B型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

牛复合预混料(北京精准动物营养研究中心), 盐酸土霉素原药(98%, W/W, 大连荣海生物科技有限公司); 纯净水, 无水乙醇(分析纯, 北京化工厂)。

The Unscrambler X(10.3版), Matlab(R2020b 版), OMNIC(9.7版), Origin(2019b版)

1.3.1 样品

经高效液相色谱鉴定确保饲料中未添加盐酸土霉素。 在1.00 g牛预混料加入不同质量的98.00%(W/W)盐酸土霉素原药, 配制成盐酸土霉素浓度为0.00%~5.00%的混合样品共113个, 样品质量百分数均值为2.49%。 分别采用乙腈、 甲醇和纯水3种溶剂对适量盐酸土霉素原药进行溶解, 其中纯水溶剂的红外光谱较为干净且与盐酸土霉素原药吸收峰存在不重叠区域, 盐酸土霉素在纯水中的溶解度高, 故选用纯水作为固体样品的萃取溶剂。 在配制好的混合样品中加入1.00 mL纯水, 置于涡旋振荡器上振荡2 min, 振荡完毕后置于4 000 r· min^-1离心机中离心5 min, 取上清液过0.45 μ m水系聚醚砜(PES)滤膜后, 置于2 mL密封小试管中待转移。 在洁净铝箔上轻压出直径约1.5 cm, 深度约1.5 mm的半圆形凹槽, 将上述上清液及时转移至铝箔凹槽内, 在红外灯下烤干。

1.3.2 光谱采集

采用ATR-FTIR光谱仪采集113个烤干样品的中红外光谱图, 仪器参数设置为扫描范围4 000 ~650 cm^-1, 分辨率4 cm^-1, 扫描次数32次, 每个样品采集3条光谱。 采集时使样品充分接触ATR晶体, 拧紧压力旋钮挤压固定, 保证每个样品受到的压力相同。 光谱采集完成后用无水乙醇充分清洁并吹干ATR晶体, 每40分钟进行一次背景校正。 整个实验过程保持室内温度为25 ℃左右。

1.3.3 数据处理

以盐酸土霉素在牛预混料中的含量作为化学值分析指标, 对烤干样品的光谱数据建立定量模型。 所有光谱经基线校正后对每个样品重复采集的三条光谱求平均, 采用3种预处理方法(S-G平滑、 SNV、 MSC)结合3种变量选择方法(iPLS、 MWPLS、 BOSS)对定量模型进行优化。 光谱的基线校正过程在The Unscrambler 软件中进行, 用于调整光谱偏移, 方法是对于每条光谱, 将所有变量减去光谱中最低点的值, 以达到将倾斜的基线都转化为水平基线的目的。 在Matlab 软件中进行光谱的平均、 预处理、 变量选择以及PLS模型建立等步骤。

土霉素是四环素类药物, 其结构中四个环、 双— CO系统、 酰胺基(— CONH₂)等集团是发挥抗菌作用的必需活性基团。 盐酸土霉素红外光谱如图1(a)所示, 最有特征的红外吸收波段在1 700~1 100 cm^-1。 1 673和1 525 cm^-1的峰值分别为(A)环中酰胺基团的— C=O基团的伸缩振动和— NH₂基团的伸缩振动。 1 612和1 587 cm^-1的峰值则分别来自于(C)环中的— C=O基团伸缩振动和酰胺中— NH基团的面内振动, 而1 451 cm^-1的峰值则源自于苯环骨架中C=C基团的伸缩振动。 位于3 500和3 300 cm^-1之间的强烈的伸缩振动谱带则是由于醇羟基和酚羟基中的O— H基团所引起的。 此外, 2 926 cm^-1处产生亚甲基C— H的伸缩振动吸收峰; 1 455~1 300 cm^-1波数范围内存在中等强度红外吸收带, 由— CH₃的对称变形振动产生; 而1 017 cm^-1处的强吸收峰, 峰形比较尖锐, 由C— O的伸缩振动引起。

图1

Fig.1

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	图1 (a) 98%盐酸土霉素原药红外光谱; (b) 牛预混料经水萃取残渣红外光谱Fig.1 (a) ATR-FTIR spectra of 98% Oxytetracycline Hydrochloride; (b) ATR-FTIR spectra of blank control feed sample residues after water extraction

图1(b)为空白牛预混合饲料经水萃取, 并将上清液烤干后所得残渣的光谱图。 其中, 波数1 700~1 600 cm^-1区域主要与C— H, C— N和N— H基团有关^[73]; 1 500 cm^-1处主要由O— H和N— H基团引起; 波数1 200~800 cm^-1区域内存在C— O和C— H的伸缩振动, C— C的单键骨架振动, 以及C— OH的弯曲振动。

样品经过烤干处理后, 红外光谱中一些溶剂峰消失, 如图2所示, 3 600~3 120 cm^-1处的水峰强度明显减弱并趋于平缓, 1 500 cm^-1附近的尖峰经过烤干后几乎消失。 同时, 盐酸土霉素的部分特征波段如2 926, 1 650和1 017 cm^-1处的吸收峰增强。 由此可见, 通过对萃取液进行烤干处理, 能够有效去除溶剂对光谱的大部分影响, 使有效成分的峰更加明显, 有利于后续定量研究。

图2

Fig.2

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	图2 2%样品萃取上清液烤干前后ATR-FTIR光谱对比Fig.2 Spectra comparation of 2% samples before and after drying

基于113个样本对应的113条光谱, 以牛预混料中盐酸土霉素含量作为化学值, 通过KS法划分样本集: 校正集共有84个样本, 其余29个样本作为验证集。 采用PLS法建立盐酸土霉素含量的红外光谱定量校正模型, 并通过内部交叉验证, 以最小内部交叉验证均方根误差(RMSECV)作为判断指标, 对不同光谱预处理方法进行对比, 确定最佳因子数, 选出光谱特征变量区间, 建立校正模型。

图3(a)为113个盐酸土霉素饲料样品的原始光谱, (b)为基线校正后的光谱图。 为了尽可能减小样品光谱信号基线漂移的影响, 采取基线校正处理, 由图3(b)可以看出, 波数1 700~1 170 cm^-1波数范围内的峰形和峰位基本相似, 而吸收峰强度根据盐酸土霉素浓度的变化表现出明显的差异。

图3

Fig.3

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	图3 113个盐酸土霉素样品的衰减全反射傅里叶红外光谱图 (a): 原始光谱; (b): 基线校正后的光谱Fig.3 ATR-FTIR spectra of 113 Oxytetracycline Hydrochloride samples (a): Original spectra; (b): Spectra after baseline correction

进一步地消除随机噪声干扰, 采取三种预处理方法(S-G卷积平滑、 SVV、 MSC)结合三种变量选择算法(iPLS、 MWPLS、 BOSS)对模型进行优化。 iPLS和MWPLS作为基于光谱波长区间的变量选择方法, 一般具有较好的波长选择稳定性, 然而不能很好地解决红外光谱谱峰重叠严重造成的波长多重共线性问题。 而BOSS作为基于光谱波长的变量选择方法, 采用模型种群分析(MPA)和加权自举采样(WBS)建立搜索策略, 能够更加充分全面地理解数据, 因此, 与其他变量选择方法相比, BOSS方法解决了由于信息变量之间协方差不为零而导致模型预测不准确的问题, 预测能力显著提高^[16]。 由表1可以看出, BOSS变量选择与不同预处理结合所得到的模型都有着优异的表现。 其中, SNV预处理结合BOSS变量选择算法取得了最佳的模型效果: RMSECV=0.337, RCV2=0.947, RMSEP=0.317, Rpre2=0.935。 模型预测值与实际化学值的关系图见图4。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 盐酸土霉素模型参数及优化结果 Table 1 Parameters and optimization results of PLS models for Oxytetracycline Hydrochloride 预处理 方法 变量选 择方法 最佳 因子数 RMSECV RCV2 RMSEP Rpre2 None None 8 0.63 0.79 0.67 0.79 iPLS 8 0.61 0.81 0.71 0.76 MWPLS 4 0.56 0.84 0.83 0.68 BOSS 4 0.51 0.86 0.67 0.78 Smoothing None 8 0.63 0.79 0.67 0.79 iPLS 8 0.61 0.81 0.71 0.76 MWPLS 4 0.56 0.84 0.82 0.68 BOSS 4 0.52 0.86 0.67 0.78 SNV None 10 0.51 0.88 0.33 0.93 iPLS 10 0.54 0.87 0.40 0.90 MWPLS 5 0.56 0.85 0.59 0.78 BOSS 4 0.34 0.95 0.32 0.93 MSC None 7 0.49 0.88 0.52 0.85 iPLS 9 0.49 0.88 0.53 0.85 MWPLS 5 0.58 0.84 0.63 0.78 BOSS 5 0.37 0.93 0.53 0.85 注: 最佳方法和参数以下划线标记; RMSECV: 交叉验证的均方根误差; RCV2: 交叉验证的相关系数; RMSEP: 预测集的均方根误差; Rpre2: 预测集的相关系数 Note: The best methods and parameters are underlined; RMSECV: root-mean-square error of cross-validation; Rcv2: coefficient of determination of cross-validation; RMSEP: root-mean-square error of prediction; Rpre2: coefficient of determination for prediction set

表1 盐酸土霉素模型参数及优化结果 Table 1 Parameters and optimization results of PLS models for Oxytetracycline Hydrochloride

图4

Fig.4

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	图4 SNV结合BOSS的定量校正模型效果图 (a): SNV结合BOSS的校正集数据模型; (b): SNV结合BOSS的验证集数据模型Fig.4 Quantitative modeling results of SNV combined with BOSS (a): Calibration set data; (b): Validation set data

在SNV方法预处理的基础上, 所使用的3种变量选择方法对应选出的变量区间范围展示在图5中。 BOSS算法选取的波数变量区间为3 517、 2 328、 2 277、 1 767、 1 674和1 175 cm^-1处, 体现出了盐酸土霉素红外光谱中的C=O伸缩振动、 — NH面内振动(1 674~1 593 cm^-1)以及C— O伸缩振动(1 175~1 017 cm^-1)随着含量增高而红外吸收增强, 很好地解释了BOSS算法对波数区间的选择。 iPLS算法选取的变量区间为980~668 cm^-1, MWPLS算法选取的变量区间为812~770 cm^-1, 二者选择的波段均无法从盐酸土霉素的特征吸收角度解释, 因此得到的模型效果相较于BOSS算法更差。 变量选择的结果再次证明了BOSS算法在变量选择上的优势, 即在确保回归系数绝对值较大的变量被纳入子模型的概率较高的基础上, 赋予贡献较小的变量以较小的权重, 并令其与其他变量迭代, 这样可以达到进一步优化的目的, 获得更多的特征信息, 更大程度上保留有意义的信息变量。

图5

Fig.5

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	图5 SNV预处理后三种变量选择算法选出的变量范围 (a): iPLS; (b): MWPLS; (c): BOSSFig.5 Range of variables selected by three algorithms after SNV pretreatment (a): iPLS; (b): MWPLS; (c): BOSS

以KS分集法选出的29 个样品作为验证集, Rpre2为0.935, 预测均方根误差RMSEP为0.317, 每个样品的具体预测情况见于表2。 验证集29个样品的预测平均相对误差为0.127。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 盐酸土霉素PLS模型验证结果 Table 2 Validation results of PLS model for Oxytetracycline Hydrochloride 样品编号 化学值/% 预测值/% 绝对误差 25 2.99 3.33 0.34 65 1.89 2.54 0.65 49 0.60 1.16 0.56 6 1.00 0.92 -0.08 63 1.70 1.77 0.07 38 4.67 4.78 0.11 69 2.34 3.03 0.69 86 3.96 4.09 0.13 73 2.72 2.54 -0.18 37 4.57 4.18 -0.39 113 4.23 4.14 -0.10 17 2.00 2.49 0.49 28 3.22 3.14 -0.08 99 0.94 0.63 -0.31 21 2.35 2.05 -0.30 14 1.81 2.23 0.42 66 1.97 2.33 0.36 107 2.27 2.10 -0.17 79 3.30 3.67 0.37 31 3.81 4.07 0.26 54 0.93 1.02 0.09 48 0.53 0.55 0.02 10 1.30 1.29 -0.01 27 3.10 3.14 0.04 88 4.12 4.15 0.03 71 2.53 2.79 0.26 60 1.35 1.61 0.26 13 1.73 2.21 0.48 36 4.56 4.45 -0.11

表2 盐酸土霉素PLS模型验证结果 Table 2 Validation results of PLS model for Oxytetracycline Hydrochloride

依据1.3.1中途述的样本制备条件进行重复性实验, 平行制备5个盐酸土霉素添加浓度均为2%的牛预混料样品, 采集光谱, 计算两两样品之间的相似度, 结果见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 重复性实验光谱的相似度计算结果 Table 3 The similarity calculation of 5 parallel experiments 样品编号 a b c d e a 1 0.981 0.987 0.985 0.99 b 0.981 1 0.989 0.989 0.979 c 0.987 0.989 1 0.996 0.993 d 0.985 0.989 0.996 1 0.997 e 0.99 0.979 0.993 0.997 1

表3 重复性实验光谱的相似度计算结果 Table 3 The similarity calculation of 5 parallel experiments