引用本文
任丽磊, 彭玉苓, 王树军, 张成根, 陈钰, 王昕彤, 孟晓宁. 荧光光谱法研究三种金属卟啉与人血清白蛋白的结合反应[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(3): 806-813.
REN Li-lei, PENG Yu-ling, WANG Shu-jun, ZHANG Cheng-gen, CHEN Yu, WANG Xin-tong, MENG Xiao-ning. Fluorescence Spectroscopy for Studies on the Interaction Between Three Metalloporphyrins With Human Serum Albumin[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(3): 806-813.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)03-0806-08  
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荧光光谱法研究三种金属卟啉与人血清白蛋白的结合反应
任丽磊, 彭玉苓, 王树军*, 张成根, 陈钰, 王昕彤, 孟晓宁
廊坊师范学院化学与材料科学学院, 河北 廊坊 065000
*通讯作者 e-mail: d022036@mail.nankai.edu.cn

作者简介: 任丽磊, 女, 1982年生, 廊坊师范学院化学与材料科学学院讲师 e-mail: renll1409@163.com

收稿日期: 2022-01-14 修回日期: 2022-06-20 接受日期: 2022-06-20
基金: 国家自然科学基金项目(22103030), 廊坊市科技局项目(2020011042)资助
摘要

近年来, 卟啉及金属卟啉在光动力疗法、 抗癌药物研究方面备受关注, 有些已被批准临床使用。 人血清白蛋白(HSA)能结合、 运输许多药物活性分子, 详细研究金属卟啉与HSA的结合机制, 对阐明卟啉类药物的作用机制具有重要的意义。 研究合成了3种新型6-氯烟酸修饰的自由卟啉(4, 5, 6)及锌卟啉(4-Zn, 5-Zn, 6-Zn), 并通过测试表征和理论计算的方法进行了结构确定。 理论计算结果表明: 3种锌卟啉中的侧链6-氯烟酸基团均远离卟啉环平面; 4-Zn构型比连有取代基的5-Zn、 6-Zn构型更稳定。 在模拟生理条件下, 采用荧光光谱法研究了3种锌卟啉与HSA之间的键合方式, 通过Stern-Volmer方程、 双对数方程和Van’t Hoff方程对测定结果进行计算。 结果表明: (1)3种锌卟啉均能有效猝灭HSA的荧光, Stern-Volmer方程计算得到锌卟啉与HSA在不同温度下的 Kq值均大于2.0×1010 L·mol-1·s-1, 表明猝灭类型为静态猝灭; (2)采用双对数方程得到锌卟啉与HSA的结合常数, 除5-Zn在318 K时外, 其他温度条件下的结合常数 KA均大于103 L·mol-1, 结合位点数 n均接近1, 说明形成了1∶1的复合物; (3)根据Van’t Hoff方程计算, 3种锌卟啉与HSA结合的热力学参数均小于0, 如4-Zn与HSA结合的热力学参数为Δ H=-123.9 kJ·mol-1, Δ S=-322.9 J·mol-1·K-1, Δ G=-27.7 kJ·mol-1(298 K), 由此得出反应过程为自发进行, 反应的主要作用力为范德华力和氢键。 实验获得的数据可以为研究金属卟啉与生物小分子的作用机制提供一些有用的信息。

关键词: 金属卟啉; 烟酸; 人血清白蛋白; 荧光光谱
中图分类号:O621.22 文献标志码:A
Fluorescence Spectroscopy for Studies on the Interaction Between Three Metalloporphyrins With Human Serum Albumin
REN Li-lei, PENG Yu-ling, WANG Shu-jun*, ZHANG Cheng-gen, CHEN Yu, WANG Xin-tong, MENG Xiao-ning
Faculty of Chemistry and Material Science, Langfang Teachers University, Langfang 065000, China
*Corresponding author
Abstract

In recent years, porphyrins and metalloporphyrins have attracted much attention in photodynamic therapy and anticancer, and some have been approved for clinical use. Human serum albumin(HSA) can bind and transport some drug molecules. A detailed study of the binding mechanism of metalloporphyrins and HSA is of great significance in clarifying the action mechanism of porphyrin drugs. This study synthesised three kinds of novel free porphyrins modified with 6-chloronicotinic acid(4,5,6) and their Zn complex(4-Zn, 5-Zn, 6-Zn) and characterized by UV-Vis, IR,1H NMR, elemental analysis, fluorescence spectra and theoretical calculations. The theoretical calculation results showed that the 6-chloronicotinate moieties in the three zinc porphyrins were far away from the porphyrin ring plane. The 4-Zn configuration was more stable than the 5-Zn and 6-Zn configurations with substituents. Under simulated physiological conditions, the bonding modes between three zinc porphyrins and HSA were studied by fluorescence spectra, and the results were calculated according to the Stern-Volmer equation, double-logarithmic equation and Van’t Hoff equation. The experimental results indicated: (1) Three zinc porphyrins could all quench the fluorescence of HSA and the values of Kq calculated by the Stern-Volmer equation were much larger than 2.0×1010 L·mol-1·s-1. Thus the quenching type was static quenching. (2) The binding constants were calculated by a double-logarithmic equation. Except for the 5-Zn at 318 K, other binding constants were all greater than 103 L·mol-1, and the binding sites were close to 1, indicating the formation of a 1∶1 complex. (3) According to the Van’t Hoff equation, the thermodynamic parameters Δ H, Δ S, Δ G were all less than 0, eg. those of 4-Zn were calculated to be Δ H=-123.9 kJ·mol-1, Δ S=-322.9 J·mol-1·K-1, Δ G=-27.7 kJ·mol-1 (298 K), indicating that the reaction process was spontaneous and the predominant forces between zinc porphyrins and HSA were vander waals force and hydrogen bond. The experimental data obtained in this experiment can provide useful information for studying the interaction mechanism between metalloporphyrins and biological small molecules.

Keyword: Metalloporphyrin; Nicotinic acid; Human serum albumin; Fluorescence spectra
引言

卟啉及金属卟啉由于具有独特的光化学和光物理性质, 在光动力疗法、 光催化、 抗癌药物研究等方面备受关注, 其中一些已被批准临床使用[1, 2, 3]。 血清白蛋白是一种非特异性载体蛋白质, 是血浆的主要成分, 能结合、 运输许多药物活性分子, 实验表明: 金属卟啉可与血清白蛋白结合, 产生药效, 如Sandland等[4]提出将人血清白蛋白与叠氮金属卟啉偶联, 该偶联物对癌细胞(HT-29)具有良好的光动力活性。 因此, 研究金属卟啉及其他活性分子与血清白蛋白的结合机制, 对分析药物的作用机制、 改进现有药物具有很好的指导意义[5, 6], 如Chaves等[5]通过光谱技术并结合理论计算研究了HSA与2种四阳离子基卟啉(4-PtTPyP和4-MeTPyP)的相互作用, 实验数据证实2种卟啉与HSA之间存在静态猝灭效应, 圆二色光谱显示4-PtTPyP会干扰人血清白蛋白的热稳定性; 有研究将水溶性羧酸型卟啉锌配合物与HSA的相互作用, 结果显示两者之间的结合以静电作用为主, 主要结合位点在HSA亚结构域的疏水腔内。

Wang等[7, 8]曾将烟酸及其衍生物2-氯烟酸通过取代反应与卟啉环连接, 再络合锌离子形成锌卟啉, 并研究了锌卟啉与HSA的相互作用。 为了研究烟酸分子中氯原子的位置以及侧链长短对锌卟啉与HSA相互作用的影响, 本工作将6-氯烟酸通过1, 4-二溴丁烷连接到卟啉环上, 合成了3种6-氯烟酸修饰的自由卟啉及对应的锌卟啉。 通过荧光光谱法确定锌卟啉与HSA之间的键合方式, 猝灭类型及主要作用力。 研究结果可以为药物结构与疗效之间的关系提供一些有用的信息。

1 实验部分
1.1 仪器和试剂

BRUKER-400核磁共振仪(德国布鲁克); Shimadzu 2550紫外-可见分光光度计(日本岛津); CE-440元素分析仪(美国加联); Hitachi F-4600荧光分光光度计(日本日立); HH-501恒温水浴锅(常州国华); Prestige-21傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津)。

吡咯(上海科丰实业有限公司, 使用前重蒸); p-羟基苯甲醛、 p-甲氧基苯甲醛、 p-氯苯甲醛(北京百灵威科技有限公司); 6-氯烟酸(天津市凯通化学试剂有限公司); Br-(CH2)4-Br(中国上海试剂一厂); 硅胶(于成化工(上海)有限公司); HSA(美国Equitech-Bio公司); 实验用水为二次蒸馏水, 其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

用二次蒸馏水溶解三(羟甲基)氨基甲烷(Tris), 配制浓度为0.1 mol· L-1的溶液, 滴加HCl, 调节pH值到7.4即为Tris-HCl缓冲溶液; HSA(相对分子质量: 66 500), 用二次蒸馏水配制成2.0× 10-4 mol· L-1的储备液, 使用时稀释至2× 10-5 mol· L-1; 3种锌卟啉用二甲基亚砜(DMSO)溶解, 配制浓度为2.0× 10-4 mol· L-1的溶液。

在10 mL容量瓶中依次加入1 mL Tris-HCl缓冲溶液、 2 mL 2× 10-5 mol· L-1的HSA溶液和不同体积的2.0× 10-4 mol· L-1的锌卟啉溶液, 二次蒸馏水定容, 然后置于288, 298, 308和318 K的恒温水浴中10 min, 测量各体系的荧光光谱。 设定激发波长286 nm, 负高压375 V, 1 cm× 4 cm× 1 cm石英池。

1.3 目标化合物的合成

锌卟啉的合成路线如Scheme1所示。

Scheme 1 目标化合物的合成路线Scheme 1 The synthetic route of the target compounds

化合物1, 2, 3和6-氯烟酸钠参照文献[8, 9]合成。 6-氯烟酸钠的IR (cm-1): 3 026.3, 1 722.4, 1 581.6, 1 454.3, 1 355.9, 619.2。

1.3.1 化合物4的合成

将0.1 g化合物1和0.332 g 6-氯烟酸钠加入到干燥的反应瓶中, N, N-二甲基甲酰胺溶解, 于75 ℃搅拌1 h, 饱和氯化钠溶液盐析, 抽滤, 水洗, 粗产物以柱色谱分离(硅胶为固定相, 三氯甲烷为流动相), 收集第二色带, 蒸干溶剂得紫色固体, 即为化合物4, 产率65.0%。 为了验证6-氯烟酸成功连接到卟啉环上, 以CDCl3为溶剂, 扫描化合物4的核磁共振氢谱, 数据如下: 1H NMR(CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : -2.775(s, 2H, porphyrin, N-H), 2.147~2.178(m, J=12.4 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.318~4.346(t, J=11.2 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.562~4.592(t, J=12 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.264~7.286(d, J=8.8 Hz, 2H, ArO-m-H), 7.439~7.460(d, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 7.726~7.783(m, J=22.8 Hz, 9H, 3Ar-m, p-H), 8.110~8.132(t, J=8.8 Hz, 2H, ArO-o-H), 8.205~8.228(m, J=9.2 Hz, 6H, 3Ar-o-H), 8.296~8.323(m, J=10.8 Hz, 1H, Py-4-H), 8.839~8.878(m, J=15.6 Hz, 8H, porphyrin H), 9.073~9.079(t, J=2.4 Hz, 1H, Py-2-H)。 C54H40ClN5O3元素分析实测值(理论值, %): C 76.68(76.99), H 4.56(4.79), N 8.17(8.31)。

采用同样的方法合成化合物5(紫色固体)和6(紫色固体), 产率分别为46.5%和73.1%, 以4的测定方法, 扫描5和6的核磁共振氢谱, 数据如下。

5: 1H NMR(CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : -2.839(s, 2H, porphyrin, N— H), 2.165~2.174(d, J=3.6 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.329~4.356(t, J=10.8 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.569~4.599(t, J=12 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.276~7.298(d, J=8.8 Hz, 2H, ArO-m-H), 7.446~7.467(d, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 7.736~7.752(t, J=6.4 Hz, 6H, 3Ar-m-H), 8.097~8.148(m, J=20.4 Hz, 8H, 4Ar-o-H), 8.303~8.329(m, J=10.4 Hz, 1H, Py-4-H), 8.815~8.832(d, J=6.8 Hz, 6H, porphyrin H), 8.889~8.901(d, J=4.8 Hz, 2H, porphyrin H), 9.077~9.082(d, J=2.0 Hz, 1H, Py-2-H)。 C54H37Cl4N5O3元素分析实测值(理论值, %): C 68.31(68.58), H 3.76(3.94), N 7.24(7.41)。

6: 1H NMR(CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : -2.758(s, 2H, porphyrin, N— H), 2.159~2.170(d, J=4.4 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.030~4.102(t, J=28.8 Hz, 9H, 3OCH3), 4.321~4.350(t, J=11.6 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.565~4.596(t, J=12.4 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.279~7.301(t, J=8.8 Hz, 8H, 4Ar-m-H), 7.446~7.467(d, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 8.107~8.137(m, J=12 Hz, 8H, 4Ar-o-H), 8.301~8.307(d, J=2.4 Hz, 1H, Py-4-H), 9.078(s, 8H, porphyrin H), 9.083(s, 1H, Py-2-H)。 C57H46ClN5O6元素分析实测值(理论值, %): C 73.08(73.42), H 4.76(4.97), N 7.39(7.51)。

1.3.2 锌卟啉4-Zn的合成

用20 mL二氯甲烷溶解0.1 g 4, 再加入10 mL饱和醋酸锌的甲醇溶液, 回流1 h后, 加入蒸馏水洗涤、 分液, 有机相经浓缩干燥得粗产物。 粗产物以柱色谱分离(硅胶为固定相, 二氯甲烷为流动相), 收集主色带, 蒸干溶剂得紫红色固体, 即为化合物4-Zn, 产率为92.4%。 为了证实合成了4-Zn, 以CDCl3为溶剂, 扫描其核磁共振氢谱, 数据如下: 1H NMR(CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : 2.137~2.171(t, J=13.6 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.330~4.357(t, J=10.8 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.559~4.590(t, J=12.4 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.288(s, 2H, ArO-m-H), 7.437~7.458(d, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 7.725~7.782(m, J=22.8 Hz, 9H, 3Ar-m, p-H), 8.115~8.137(d, J=8.8 Hz, 2H, ArO-o-H), 8.211~8.231(t, J=8.0 Hz, 6H, 3Ar-o-H), 8.289~8.316(m, J=10.8 Hz, 1H, Py-4-H), 8.943~8.986(m, J=17.2 Hz, 8H, porphyrin H), 9.045~9.050(d, J=2.0 Hz, 1H, Py-2-H)。 C54H38ClN5O3Zn元素分析实测值(理论值, %): C 71.71(71.61), H 4.08(4.23), N 7.58(7.73)。

采用同样的方法合成5-Zn(紫红色固体)和6-Zn(紫红色固体), 产率分别为91.6%和88.5%。 同4-Zn的测定方法, 扫描5-Zn和6-Zn的核磁共振氢谱, 数据如下。

5-Zn: 1H NMR (CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : 2.159~2.174(d, J=6.0 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.328~4.356(t, J=11.2 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.551~4.581(t, J=12.0 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.271~7.293(d, J=8.8 Hz, 2H, ArO-m-H), 7.423~7.444(d, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 7.733~7.753(t, J=8.0 Hz, 6H, 3Ar-m-H), 8.098~8.151(m, J=21.2 Hz, 8H, 4Ar-o-H), 8.272~8.299(m, J=10.8 Hz, 1H, Py-4-H), 8.919~8.934(d, J=6.0 Hz, 6H, porphyrin H), 8.989~8.994(d, J=2.0 Hz, 2H, porphyrin H), 9.005(s, 1H, Py-2-H)。 C54H35Cl4N5O3Zn元素分析实测值(理论值, %): C 64.01(64.27), H 3.39(3.50), N 6.72(6.94)。

6-Zn: 1H NMR (CDCl3, 400 MHz, 计量单位: ppm), δ : 2.165~2.173(t, J=3.2 Hz, 4H, — CH2CH2— ), 4.106(s, 9H, 3OCH3), 4.330~4.357(t, J=10.8 Hz, 2H, Ar— O— CH2), 4.563~4.594(t, J=12.4 Hz, 2H, CH2— OOC— ), 7.278~7.299(d, J=4.9 Hz, 8H, 4Ar-m-H), 7.442~7.463(m, J=8.4 Hz, 1H, Py-5-H), 8.111~8.140(m, J=11.6 Hz, 8H, 4Ar-o-H), 8.295~8.322(t, J=10.8 Hz, 1H, Py-4-H), 8.953~9.058(m, J=42 Hz, 8H, porphyrin H), 9.063(s, 1H, Py-2-H)。 C57H44ClN5O6Zn元素分析实测值(理论值, %): C 68.55(68.75), H 4.39(4.45), N 6.79(7.03)。

2 结果与讨论
2.1 目标化合物的结构表征

为了确定目标化合物的合成, 分别采用紫外-可见吸收光谱、 核磁共振氢谱、 红外光谱、 荧光光谱表征了4, 5, 6和4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的结构, 并通过理论计算确定了4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的稳定构型。

2.1.1 紫外-可见吸收光谱

为了确定化合物4, 5, 6和4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的合成, 以DMSO作溶剂, 分别配制了浓度为2.0× 10-6和2.0× 10-5 mol· L-1的溶液, 测定其紫外-可见光谱, 如图1和图2所示, 结果见表1。 可以看出: (1)化合物4, 5和6的Soret带均在420 nm左右, Q带在500~650 nm之间。 与化合物4相比, 当苯环上连有— OCH3(6)时, Soret带和Q带均发生红移; 而当苯环上连有— Cl(5)时, 紫外吸收峰位置变化不大。 (2)形成金属卟啉后, Soret带均发生红移约1 nm, 而Q带吸收峰从4个减少到2个, 符合金属卟啉的特征[8]。 同时Q带较自由卟啉发生蓝移3~5 nm, 与2-氯烟酸键连卟啉形成锌卟啉的实验数据变化趋势一致[7], 与烟酸键连卟啉形成锌卟啉的实验数据变化趋势相反[8]。 分析原因可能是2-氯烟酸和6-氯烟酸分子中氯原子的引入, 改变了分子中电荷的分布, 从而引起Q带蓝移。

图1 4, 5和6的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectra of 4, 5, 6
Soret band: 4(A), 5(B), 6(C); Q band: 4(a), 5(b), 6(c)

图2 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-Vis absorption spectra of 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn
Soret band: 4-Zn(A), 5-Zn(B), 6-Zn(C); Q band: 4-Zn(a), 5-Zn(b), 6-Zn(c)

表1 紫外-可见吸收光谱数据 Table 1 Data of UV-Vis absorption spectra

2.1.2 核磁共振氢谱

为了确定6-氯烟酸分子是否键连到卟啉环上, 用CDCl3作溶剂, 测定4, 5, 6和4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的1H NMR谱, 数据见1.3节。 可以看出: (1)自由卟啉4, 5, 6中化学位移值在-2.775, -2.839和-2.758 ppm处的峰在锌卟啉中消失, 证实锌离子的确与氮原子发生了配位作用。 (2)自由卟啉4, 5和6分别在7.439~7.460(Py-5-H), 8.296~8.323(Py-4-H), 9.073~9.079(Py-2-H); 7.446~7.467(Py-5-H), 8.303~8.329(Py-4-H), 9.077~9.082(Py-2-H)及7.446~7.467(Py-5-H), 8.301~8.307(Py-4-H), 9.083(Py-2-H) ppm处出现了吡啶环上H的化学位移值, 说明6-氯烟酸分子成功连接到卟啉环上。

2.1.3 红外光谱

为了确定目标化合物是否含有酯基官能团, 测定了4, 5, 6和4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的红外特征吸收光谱, 数据见表2。 由数据可知, (1)6-氯烟酸钠的红外吸收峰出现在3 026.3(ν C=C— H), 1 722.4(ν C=O), 1 581.6(ν C=C), 1 454.3(ν C=N), 1 355.9(ν C— O)和619.2(ν C— Cl) cm-1处, 而在自由卟啉4, 5和6的红外光谱中也观察到了这些数据, 同时出现了羰基(1 722.4, 1 741.4和1 735.1 cm-1)和酯基(1 350.2, 1 343.7和1 339.6 cm-1)的吸收峰, 这些均可证明6-氯烟酸负离子以成酯的形式连到卟啉环上。 (2)4, 5和6中3 493.1, 3 444.9和3 439.1 cm-1处卟啉环内N— H键的吸收峰, 在4-Zn, 5-Zn和6-Zn中消失, 同时在980~1 100 cm-1之间出现N— Zn键的吸收峰, 证明形成了金属锌卟啉[10]。

表2 红外光谱数据(cm-1) Table 2 Data of IR spectra (cm-1)

2.1.4 荧光光谱

为了测定目标化合物S1→ S0的荧光光谱数据, 以DMSO为溶剂, 扫描4, 5, 6和4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的荧光光谱, 数据列于表3。 可以看出, 自由卟啉4, 5, 6的发射峰分别在654.8和718.0 nm, 655.9和718.0 nm, 657.6和720.4 nm, 而锌卟啉4-Zn, 5-Zn, 6-Zn的发射峰分别在577.0和647.0 nm, 599.4和647.6 nm, 603.0和653.4 nm。 与自由卟啉相比, 锌卟啉的荧光发射峰峰位蓝移50~70 nm, 其原因是, 锌离子的引入, 使得卟啉的最低空轨道(LUMO)与最高占据轨道(HOMO)的能级差增大, 在发射谱中表现为蓝移。 再对比三种锌卟啉的荧光发射峰, 苯环上没有取代基的4-Zn较连有取代基时有更显著的蓝移, 蓝移约77 nm。

表3 荧光光谱数据 Table 3 Data of fluorescence spectra

2.1.5 量子化学计算

为了进一步确定4-Zn (a), 5-Zn (b)和6-Zn (c)的稳定构型, 同时验证实验研究结果, 参照文献[8], 采用密度泛函理论B3LYP方法, 6-31G(d)计算基组[11]进行计算。 采用G09程序包[12], 对4-Zn, 5-Zn, 6-Zn进行频率分析, 得出3种锌卟啉势能面上的稳定构型如图3(a, b, c), 量子化学计算结果列于表4。

图3 4-Zn (a), 5-Zn (b), 6-Zn (c)的稳定构型Fig.3 Stable configurations of 4-Zn (a), 5-Zn (b), 6-Zn (c)

表4 量子化学计算结果 Table 4 Calculation results of quantum chemistry

表4中, ETotal是4-Zn, 5-Zn, 6-Zn稳定构型的能量, EHOMO是最高占据轨道的能量, ELUMO是最低空轨道的能量, Δ ELUMO-HOMO是最低空轨道和最高占据轨道的能级差, QZn是锌离子上的电荷, Qporphyrin-H是卟啉环上氢原子上的电荷。

结合图3和表4数据可以看出: (1)3种锌卟啉中的侧链6-氯烟酸基团均远离卟啉环平面。 (2)根据前线轨道理论, 体系的最低空轨道和最高占据轨道的能级差Δ E越大, 体系越稳定[11]。 且能级差越大, 荧光发射峰蓝移幅度越大。 从表4数据可知, 4-Zn构型比连有取代基的5-Zn和6-Zn构型更稳定。 由于4-Zn的能级差最大, 在荧光光谱中表现为蓝移幅度最大, 而6-Zn的蓝移幅度最小, 这与2.1.4节荧光光谱数据结论一致。 (3)从电荷分布情况考虑, 与4-Zn构型相比, 当连有吸电子基Cl时, 5-Zn构型中Zn和卟啉环上H的正电荷均增多; 而当连有供电子基CH3O时, 6-Zn构型中Zn和卟啉环上H的正电荷均减少。

2.2 荧光光谱滴定实验

2.2.1 荧光猝灭机制

图4是308 K时固定HSA的浓度为4.0× 10-6 mol· L-1, 逐渐增大锌卟啉4-Zn, 5-Zn和6-Zn的浓度所测得的荧光发射光谱。 由图4(a)可知, 波长286 nm光激发下, HSA的最大荧光发射峰出现在346 nm; 当逐渐增大4-Zn的浓度, 体系的荧光强度逐渐降低(从220.3到80.9), 而发射峰位置基本不变, 说明4-Zn与HSA之间发生了反应, 且产生了荧光猝灭。 以同样方法测定288, 298和318 K时, 逐渐增大4-Zn的浓度对HSA荧光强度的影响, 得到了相同的结论。 按照同样的方法, 研究了5-Zn和6-Zn与HSA相互作用的光谱, 同样有荧光猝灭效应, 见图4(b)和(c)。

图4 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn与HSA相互作用的荧光光谱图(308 K)Fig.4 Fluorescence spectra between 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn and HSA at 308 K
(a): 4-Zn-HSA(a: cHSA=4.0× 10-6 mol· L-1; b— i: c4-Zn/cHSA=0.5, 1.2, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0); (b): 5-Zn-HSA(a: cHSA=4.0× 10-6 mol· L-1; b— i: c5-Zn/cHSA=0.4, 1.0, 1.4, 2.0, 3.0, 3.5, 5.0, 6.0); (c): 6-Zn-HSA(a: cHSA=4.0× 10-6 mol· L-1; b— j: c6-Zn/cHSA=0.4, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0

2.2.2 猝灭常数的计算

锌卟啉对HSA的猝灭机制, 通过Stern-Volmer: F0/F=1+Kqτ 0[Q]=1+KSV[Q]方程确定。 式中F0为HSA的荧光强度, F为混合体系的荧光强度; [Q]为锌卟啉的浓度; τ 0为生物大分子的荧光寿命; Kq为猝灭速率常数。 以F0/F对[Q]进行线性拟合, 计算结果列于表5, 锌卟啉对HSA的Stern-Volmer曲线图见图5。 观察表5, 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn与HSA混合体系的KSV随温度的升高而降低, 且不同温度下的Kq值均大于2.0× 1010 L· mol-1· s-1。 由此判断, 3种锌卟啉与HSA产生静态猝灭且形成了稳定复合物[13]。 同时, 在不同温度下, 6-Zn与HSA的KSV均大于4-Zn及5-Zn与HSA的KSV, 说明6-Zn对HSA的荧光猝灭程度较大。

表5 不同温度下锌卟啉对HSA的荧光猝灭常数 Table 5 Fluorescence quenching constants of Zn porphyrins-HSA interaction at different temperatures

图5 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn对HSA荧光猝灭的Stern-Volmer曲线
(a): 4-Zn-HSA; (b): 5-Zn-HSA; (c): 6-Zn-HSAFig.5 The Stern-Volmer curves of fluorescence quenching of HSA by 4-Zn, 5-Zn, 6-Zn
(a): 4-Zn-HSA; (b): 5-Zn-HSA; (c): 6-Zn-HAS

2.2.3 结合常数、 结合位点和热力学参数

结合常数KA和结合位点数n可根据双对数方程lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]计算[14]。 以不同温度下的lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图, 结果列于表6。 可以看出, (1)除5-Zn在318 K时外, 3种锌卟啉与HSA的结合常数KA数量级均达103 L· mol-1, 属于较强的结合, 且随着温度的升高不断减小, 符合静态猝灭的特征; 结合位点数n近似为1, 说明二者形成了1∶ 1的复合物。 (2)3种锌卟啉相比, 6-Zn与HSA的结合力最强, KA达到104以上; 5-Zn与HSA的结合作用受温度影响较大, 说明二者形成复合物的稳定性受温度影响较大。

表6 锌卟啉对HSA的结合常数、 结合位点及热力学参数 Table 6 Binding constants, number of binding sites and thermodynamic parameters of Zn porphyrins-HSA

通过Van’ t Hoff方程lnK=-Δ H/RT+Δ S/R, 计算反应的Δ S和Δ H, 吉布斯自由能Δ G通过公式Δ G=Δ H-TΔ S得到, 结果列于表6。 由数据可知, 不同温度下的Δ G< 0, 说明锌卟啉与HSA的反应是自发进行的。 再根据Ross等理论[14], 各混合体系的Δ H和Δ S均小于0, 说明氢键和范德华力是锌卟啉与HSA 之间的主要作用力。

与已合成其他锌卟啉相比, 本研究中锌卟啉与HSA之间的主要作用力为氢键和范德华力, 这一结果与文献[8]一致, 而与文献[7]的结果: 锌卟啉与HSA的主要作用力为疏水作用不同, 对比锌卟啉的结构, 原因可能是侧链长短的不同或者烟酸分子中氯原子位置的差异。

3 结论

合成了3种6-氯烟酸修饰的自由卟啉及锌卟啉, 并通过多种方法进行了结构确定。 采用荧光光谱法研究了3种锌卟啉与人血清白蛋白(HSA)之间的作用机制。 测试图谱和实验数据分析结果表明: 3种锌卟啉对HSA的荧光猝灭类型是静态猝灭; 除5-Zn在318 K时外, 其他温度条件下3种锌卟啉与HSA的结合常数KA均大于103 L· mol-1, 属较强的结合; 结合位点数n均接近1, 说明形成了1∶ 1的复合物; 热力学参数计算确定了主要作用力, 反应过程为自发进行。

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