用纯水和99%酒精交替冲洗金芯片, 洗去机械加工芯片时残存在表面的油污和尘埃, 用氮气吹干。 取0.01 g NH₂-PEG-SH(MW: 1 000)粉末放入10 mL纯水中, 配制浓度为1 mmol· L^-1的PEG溶液, 在培养皿中将清洗干净的金芯片浸入到配制好的PEG溶液中, 在氮气环境下隔夜浸泡; 浸泡后的芯片用纯水冲洗, 洗去未结合的PEG并用氮气吹干备用。 NH₂-PEG-SH是一种长直链高聚物, 两端含有氨基(— NH₂)和巯基(— SH)两种官能团, 能够避免在检测蛋白质时产生非特异性吸附, 对金底芯片形成一种封闭保护, 可以极大地降低芯片生物检测时嘈杂背景信号的影响。

NH₂-PEG-SH中的— SH极易与芯片上的金发生反应形成一种牢固的共价力, 另一端高度自由的— NH₂则与GO层中的— COOH脱水缩合形成酰胺键, 这样GO膜就可以通过一种化学方法固定在金芯片的表面, 如图1所示。 在记录GO改性效果之前, 利用纯水和磷酸盐缓冲液(PBS)的不同折射率, 分别记录下每组芯片的原始数据, 以便作为对照实验。 分别使用0.1、 0.25、 0.25、 0.75、 1和1.25 mg· mL^-1 GO水溶液, 通过流动方法来实现GO对金芯片的改性。 把前期准备好的芯片固定在SPRi设备上, 通过进样系统以5 μ L· s^-1的流速将GO溶液泵入到微通道内, 使GO溶液对芯片表面进行冲刷, 同时观测反射率信号变化直到曲线不再变化为止, 随后泵入纯水洗去未结合的GO, 由于不存在GO结合与解离的过程, 所以SPR信号不会回归基线位置, 整个改性过程大概持续10~20 min之间, 随后取下改性完全的芯片, 并用氮气吹干。

图1

Fig.1

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	图1 NH2-PEG-SH修饰SPR金芯片表面后与GO结合示意图Fig.1 Schematic diagram of binding to GO after NH2-PEG-SH modified SPR gold chip surface

PBS主要以水为溶剂, 少量的Na₂HPO₄、 KH₂PO₄、 NaCl和KCl为溶质, 这使得PBS与纯水的折射率相近但又略有差异。 本研究中所用PBS为实验室配制, pH 7.4浓度为10 mmol· L^-1, 实测折射率为1.340 9, 纯水折射率1.333 5, 棱镜折射率1.732 1, 设备工作中心波长为800 nm。 图2所示为流动结合GO对芯片折射率变化信号响应的影响。 以纯水为基线, 以PBS作为折射率变化, 对芯片结合GO前后对折射率变化信号做了对比, 通过数据的归一化后发现, 0.1 mg· mL^-1浓度GO已经能够对芯片信号产生增益作用, 此后随着GO浓度的增加, 这种增益作用随之增加, 并在GO浓度为0.5 mg· mL^-1时, 增益效果达到了一个极大值, 随后在0.75 mg· mL^-1浓度时GO对芯片的增益效果出现了下降, 但信号增益仍然是正反馈。 0.75~1.25 mg· mL^-1浓度的GO对芯片信号的增益效果持续下降并在GO浓度为1.25 mg· mL^-1时, 芯片在修饰GO前后信号对比基本持平或略有降低。

图2

Fig.2

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	图2 不同浓度GO溶液对金芯片修饰后的增敏强度对比图 红线和绿线分别代表GO修饰前后芯片对纯水和PBS信号响应, 基线为纯水信号Fig.2 Comparison of the sensitization intensity of different concentrations of GO solution on gold chips after modification The red and green lines represent the response of the chip to pure water and PBS before and after GO modification, respectively. (Baseline is pure water signal)

图2中红线与绿线的变化斜率是不同的, 曲线的倾斜角度越大则代表传感器对折射率变化响应时间越长, 反之则代表传感器越灵敏。 由此可以看出GO层不仅改变了传感器检测能力, 同时也对传感器的响应时间有影响, 即提升了灵敏度。 不同浓度GO对芯片的平均增益效果百分率如表1所示。 从表1中可以看出, 0.5 mg· mL^-1浓度的GO溶液可以将金芯片检测能力提高了22.1%, 而当GO浓度到1.25 mg· mL^-1时, GO对芯片的增益效果出现了负反馈, 分析认为不同浓度的GO与芯片表面结合量不同, 致使GO层厚对共振波传导系数的影响也不同。 图3为0.5 mg· mL^-1浓度GO修饰芯片表面形貌5 000倍电镜扫描(scanning electron microscope, SEM)图。 图中可以很明显的观察出芯片表面附着有GO单层, 并在边缘处有部分褶皱现象。 图4为不同浓度下GO对芯片增益效果的标准差折线图。 从整体来看, 增益效果呈现出类似开口向下的二次函数形状, 并且在极大值点左右两连续点增幅较大, 在其他连续点变化比较平缓, 并且极大值点上下标准偏差与其他各点各不衔接, 因此可以确定当流动结合GO溶液浓度为0.5 mg· mL^-1左右时, 对芯片的增益作用有最好的效果, 这一浓度值在文献中鲜有出现, 并且比现有报道浓度值低2~4倍, 能够极大的降低GO-SPR传感芯片的成本。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 流动结合GO对SPR芯片的平均增益值(%) Table 1 Average gain value (%) of flow-bound GO to SPR chip GO浓度/(mg· mL-1) 平均增益率/% 0.1 6.1 0.25 7.4 0.5 22.1 0.75 5.7 1 1.8 1.25 -0.6

表1 流动结合GO对SPR芯片的平均增益值(%) Table 1 Average gain value (%) of flow-bound GO to SPR chip

图3

Fig.3

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	图3 0.5 mg· mL-1浓度GO修饰SPR芯片表面形貌SEM图Fig.3 SEM image of surface morphology of 0.5 mg· mL-1GO modified SPR chip

图4

Fig.4

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	图4 不同浓度GO对芯片增益效果标准差折线图Fig.4 Line chart of the standard deviation of the chip gain effect with different concentrations of GO

SPR现象的产生伴随着在金属与介质界面处倏逝场的增强。 高折射率的棱镜对不同波长的光折射作用不同, 由此产生的倏逝场也不相同。 倏逝场的变化影响着界面处电场的变化, 传感器对分析物扰动的灵敏度取决于该区域的场分布。 入射光波经过高折射率的棱镜折射后形成倏逝波, 倏逝波会渗入到介质约波长量级单位的距离, 以此来影响界面处的电场强度。 入射波长与渗入深度的关系式可由式(1)计算得出^[13]

δd=λ4πεα+εmr-εα2(1)

式(1)中, δ _d为分析物层内的穿透深度, λ 、 ε _α 、 ε _mr分别为入射波长、 分析物介电常数和金属实部介电常数。 由式(1)可以推断出, 当被测物质与芯片结构不变时, 倏逝波的渗透深度与入射光波的波长成正比例关系。 因此, 在上述研究的基础上, 对GO-SPR芯片工作波长进行了改变, 以进一步探究芯片在近红外波段下的使用性能。

图5为800~950 nm波长下GO-SPR芯片共振角度以及共振深度的变化。 随着波长的增加, 共振角度也发生了改变, 呈现出逐渐变大的趋势, 其与波长变化关系遵循线性拟合方程为, 其中R²=0.988 8。 对不同波长共振曲线积分可以发现, 共振曲线的半高峰宽(full width at half maxima, FWHM)也是随着入射波长的增加而变宽, 其具体数值对照见表2中。 除去共振角度以及FWHM的变化, 共振深度也随着波长的增加而增加, 从图5中纵坐标灰度值变化情况可以看出, 入射波长的增加, 使得共振曲线在共振峰处的灰度值逐渐变小, 表明SPR的强度也在随着波长的增大而增大, 这种情况的发生与式(1)的设定相吻合。

图5

Fig.5

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	图5 800~950 nm光波段下, GO-SPR芯片共振角度和深度的变化对比Fig.5 Comparison of the changes in the resonance angle and depth of the GO-SPR chip under the light band of 800~950 nm

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同波长共振曲线对应的FWHM值 Table 2 FWHM values corresponding to resonance curves of different wavelengths 波长/nm FWHM/Deg 800 1.94 850 2.37 870 2.43 900 2.66 950 3.48

表2 不同波长共振曲线对应的FWHM值 Table 2 FWHM values corresponding to resonance curves of different wavelengths

共振强度随波长变化现象的发生是因为金属在红外波长处折射率的实部和虚部都相应的变大, 而金属折射率虚部的增加使其对光波具有更强的吸收能力, 此时倏逝场在整个系统传播的过程中有更大的衰减, 而GO镀层的存在就是将这种衰减进一步增强。 与此同时, GO-SPR芯片共振深度随波长变化的这一规律, 也从侧面印证了利用本文所述方法制备的GO镀层在金属表面呈均匀分布状态或者单层状态。

SPR传感器性能一般以灵敏度S以及品质因数(figure of merit, FOM)综合评价。 对于以角度变化为计量基准的传感器其灵敏度由如式(2)定义^{[14, 15]}

S=ΔθΔn(2)

式(2)中, S为灵敏度, Δ θ 为折射率变化前后共振角度的变化值, Δ n为介质折射率的变化值。 而FOM则定义为S与FWHM的比值^[16]。 由式(2)可以看出, 共振角度的变化与灵敏度S之间呈现出正比例关系, 对于传感器进样前后共振角度变化越大, 折射率变化越小传感器灵敏度越高, 因此为了获得更大的角度动态范围, SPR传感器一般期望小角度共振。

对2.2节波长变化前后GO-SPR综合性能进行了测算。 图6(a)、 (b)分别为800和950 nm通样PBS前后共振角度变化对比。 经过计算可得入射波长800 nm时, 共振角度变化为1.35° , 结合实测PBS与纯水折射率变化Δ n=0.007 4, 最后计算得到灵敏度为182.4° · RIU^-1, FOM值为60.4 RIU^-1。 而将入射波长改为950 nm后, 共振角度变化为1.80° , 经计算得到灵敏度为243.2° · RIU^-1, FOM值为82.2 RIU^-1。 与800 nm入射波长对比可以看出波长增加之后, 传感器灵敏度提升了33.3%, 而FOM值提升了36.1%。 图6(c)、 (d)为未结合GO的Au-SPR芯片在800和950 nm波长下S和FOM值。 800 nm下裸金芯片S为60.8° · RIU^-1, FOM值24.1 RIU^-1。 与之相比, GO的加入可在同波长下使芯片S值提升300%左右, 而FOM值提升250%左右; 在950 nm波长下, S值提升400%左右, FOM值提升341.1%左右。 另一方面, 当入射波长增加至950 nm时, Au-SPR芯片的S值达到了121.6° · RIU^-1, 比800 nm下提升了一倍, FOM值也达到了40.9 RIU^-1, 提升169.7%左右。 通过横纵对比GO-SPR和Au-SPR的S和FOM值可以发现, GO的引入对SPR芯片的性能带来了巨大的提升; 同时入射波长的改变不仅能影响SPR共振强度, 也会对倏逝场的强度造成影响, 增加入射波的波长, 对SPR传感器的灵敏度有着积极的作用。

图6

Fig.6

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	图6 入射波长在800和950 nm时GO-SPR和Au-SPR芯片传感性能变化对比Fig.6 Comparison of sensing performance changes of GO-SPR and Au-SPR chips when the incident wavelength is 800 and 950 nm