引用本文
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QIAO Lu, LIU Rui-na, ZHANG Rui, ZHAO Bo-yu, HAN Pan-pan, ZHOU Chun-ya, ZHANG Yu-qing, DONG Cheng-ming. Analysis of Spectral Characteristics of Soil Under Different Continuous Cropping of Rehmannia Glutinosa Based on Infrared Spectroscopy [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(2): 541-548.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)02-0541-08  
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基于红外光谱法对不同连作茬次地黄土壤光谱特征分析
乔璐1, 刘瑞娜1, 张瑞1, 赵博宇1, 韩盼盼1,2, 周春亚1,3, 张雨晴1,4, 董诚明1,*
1.河南中医药大学药学院, 河南 郑州 450046
2.广州中医药大学药学院, 广东 广州 510006
3.江西中医药大学药学院, 江西 南昌 330004
4.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193
*通讯作者 e-mail: dcm88@sina.com

作者简介: 乔 璐,女, 1983年生,河南中医药大学药学院讲师 e-mail: bridgeroad@163.com

收稿日期: 2021-08-24 修回日期: 2022-04-22
基金: 国家重点研发计划项目(2017YFC1702800),河南省重大科技专项项目(171100310500),河南中医药大学博士科研基金项目(BSJJ2014-01),河南省科技攻关基金项目(222102310182)资助
摘要

连作障碍是中药材地黄种植过程中最大的难点, 每茬收获后须隔8~10年后方可再种植, 但连作障碍产生的机理尚不明确。 提出一种基于傅里叶红外光谱技术(FTIR-ATR)和二维红外相关光谱(2D-IR)分析方法。 采集正茬1年(YA-one)、 重茬1年(YA-two)、 10年前种植过(YA-ten)、 空白(CK)4种地黄土壤样品的光谱, 进行Norris滤噪平滑+二阶导数、 二维相关光谱分析处理并提取特征光谱, 分析土壤中化合物的指纹图谱。 结果显示: 不同连作茬次地黄土壤的峰形基本相似, 红外光谱主要特征吸收峰在3 621, 3 439, 2 932, 2 860, 2 513, 1 798, 1 636, 1 433, 1 029, 887, 783, 695, 546和469 cm-1附近。 与CK相比, YA-two的吸收强度最大, 这些吸收峰表征酚酸中羟基—OH、 羰基C=O、 C—O、 苯环的取代吸收等官能团, 说明在重茬的地黄中, 酚酸类物质积累。 在2 925和2 857 cm-1表征是糖苷类中饱和亚甲基—CH2的反对称伸缩振动和对称伸缩振动, YA-two的吸收强度最小, YA-ten的吸收强度最大。 说明重茬土壤中, 糖苷类成分含量下降。 不同连作茬次地黄土壤在920~1 750, 1 490~1 710和1 500~1 548 cm-1中二维红外相关光谱, 自动峰和交叉峰的位置、 个数、 以及强弱都不相同, 清晰地表征出官能团的差异。 结果表明采用傅里叶红外光谱和二维红外相关光谱能够实现土壤中有机化合物的快速检测, 为研究地黄连作障碍研究提供理论依据。

关键词: 地黄土壤; 连作障碍; 衰减全反射傅里叶变换红外光谱; 二维红外相关光谱; 酚酸类; 糖苷类
中图分类号:S153.6 文献标志码:A
Analysis of Spectral Characteristics of Soil Under Different Continuous Cropping of Rehmannia Glutinosa Based on Infrared Spectroscopy
QIAO Lu1, LIU Rui-na1, ZHANG Rui1, ZHAO Bo-yu1, HAN Pan-pan1,2, ZHOU Chun-ya1,3, ZHANG Yu-qing1,4, DONG Cheng-ming1,*
1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China
2. School of Pharmacy, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
3. School of Pharmacy, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
4. The Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
*Corresponding author
Abstract

Continuous cropping obstacle is the greatest difficulty in Rehmannia glutinosa planting. It must be replanted after 8~10 years. However, the mechanism of the continuous cropping obstacles is not clear yet. An analytical method based on Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR-ATR) and Two-Dimensional Infrared Correlation Spectroscopy (2D-IR) is proposed. Collected from the main crop (YA-One), second crop (YA-Two), 10-year-old interval (YA-Ten) and blank (CK) of the spectra of four kinds of Rehmannia glutinos soil samples. Norris noise filtering and smoothing, second derivative and two-dimensional correlation spectrum analysis were performed to extract characteristic spectra, analyzed the fingerprint of compounds in the soil. The results showed that the peaks of different continuous cropping soils were similar, and the main characteristic absorption peaks of spectra were around 3 621, 3 439, 2 932, 2 860, 2 513, 1 798, 1 636, 1 433, 1 029, 887, 783, 695, 546 and 469 cm-1. Compared with CK, the absorption intensity of YA-Two is the strongest, and these absorption peaks mostly represent the functional groups such as hydroxy —OH, carbonyl C=O, C—O, and substituted absorption of the benzene ring in phenolic acids, indicating the accumulation of phenolic acids in Rehmannia glutinos in continuous cropping. The reverse stretching vibration and symmetric stretching vibration of saturated methylene CH2 in the glycosides were observed At t 2 925 and 2 857 cm-1. The absorption intensity of Ya-Two was the smallest, and Ya-Ten was the largest. The results indicated that the glucoside components decreased in continuous cropping soil. The position, number and strength of automatic peak and cross peak were different in the two-dimensional infrared correlation spectra of the soil of Rehmannia glutinos in bands 920~1 750, 1 490~1 710 and 1 500~1 548 cm-1, which clearly showed the difference of functional groups. The results showed that the rapid detection of organic compounds in soil could be achieved by using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and two-dimensional infrared correlation spectroscopy (TD-IR), which provided a theoretical basis for studying Rehmannia glutinos continuous cropping obstacles.

Keyword: Rehmannia glutinosa soil; Continuous cropping obstacle; FTIR-ATR; 2D-IR; Phenolic acids; Glycoside
引言

地黄(Rehmannia glutinosa LiBosch.)是玄参科植物, 以新鲜或干燥块茎入药[1]。 主产于河南焦作的怀地黄, 在种植过程中存在着严重的连作障碍, 每茬地黄收获后须隔8~10年后方可再种植[2]。 早在《本草乘雅半偈》就有记载[3]。 具体表现为病虫害加剧, 块根不能正常膨大, 多须根, 产量和品质下降, 严重影响了地黄药用价值, 并制约了道地产区的经济发展。

目前研究认为, 地黄连作障碍主要由3种原因造成: 一是土壤肥力下降[4, 5, 6, 7]; 二是地黄连作后, 根际土壤中微生物变化, 大量病原菌迅速滋生, 导致病虫害加剧, 地黄产量下降[8, 9, 10, 11, 12]; 三是植物根系的化感自毒作用。 植物连作时, 根系会向土壤中分泌一些次生代谢物质, 这些物质的成分到底是什么, 目前尚无通论。 有学者认为这些次生代谢物质可能是酚酸类成分或者鞣质[11]。 国内外研究地黄连作障碍的手段多聚焦于高效液相色谱法, 微生物培养法以及分子水平研究DNA[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12], 但前期样品需求量大、 处理繁琐、 分析时间长, 成本较高。 红外光谱法可以通过分析吸收峰的吸收强度、 位置和形状, 确定官能团, 直观地反映出地黄土壤的差异信息。 本研究采用傅里叶红外衰减全反射(FTIR-ATR)在4 000~400 cm-1波段对正茬1年(YA-one)、 重茬1年(YA-two)、 10年前种植过(YA-ten)、 未种植过地黄的土壤(CK)进行扫描, 提取特征光谱之间的差异性, 建立二维红外相关光谱, 确定官能团, 分析土壤中化合物的指纹图谱。 为地黄连作障碍研究提供理论依据。

1 实验部分
1.1 材料

土壤样品为2019年4月26日采集于河南省焦作市武陟县地黄种植基地(GPS坐标113°16'40″, 34°59'55″)2009年—2019年间分别种植地黄的土壤, 土壤质地是砂质壤土, 土壤类型为垆土, 属石灰性褐土亚类火褐泥砂土土属。 气候条件: 暖温带大陆性季风气候, 年日照时数2 484 h, 无霜期220 d, 年积温4 714.9(≥ 10 ℃), 湿度45%, 年平均温度18 ℃, 年平均降水量544.96 mm。 去除土壤表面植物、 腐殖质及表面干燥的土壤, 用灭菌铲挖取5~20 cm深的土样, 采用“S”形五点取样法混合, 在4个样地取样, 采集信息见表1。

表1 地黄土壤采集信息 Table 1 Soil collection information of Rehmannia glutinosa
1.2 仪器及试剂

INVENIOS型傅里叶变换红外光谱仪(美国BRUKER公司), 配有DTGS检测器, 衰减全反射(ATR)附件, pH计(上海雷磁pHS-3E)。

1.3 地黄土壤红外光谱数据采集

取表1中4份地黄土壤样品各适量, 风干粉碎, 过筛。 采用傅里叶红外衰减全反射(FTIR-ATR), 仪器分辨率为4 cm-1, 样品扫描时间32 s, 背景扫描时间32 s, 扫描范围4 000~400 cm-1。 将取适量收集到的土壤样品放入ATR附件的红外透光晶体表面, 以空气为参比, 扣除H2O和CO2干涉背景后采集光谱图, 按上述试验条件进行扫描, 每个样品重复扫描3次, 求平均光谱。

1.4 数据处理

OMNIC9.2对不同间隔年限种植地黄土壤的光谱进行Norris滤噪平滑, 求二阶导数, 然后利用Origin2019b作图。

2 结果与讨论
2.1 不同间隔年限种植地黄土壤的光谱

由4种不同间隔年限种植的地黄土壤红外光谱(图1)可知, 不同间隔年限地黄种植土壤的峰位和峰形相似, 除吸光度存在明显差异外, 总体趋势差异不大。 通过与中红外经验吸收光谱可以确定地黄土壤中物质的主要官能团吸收位置。 在4 000~1 500 cm-1范围峰少, 易辨认。 其中, 3 621 cm-1的尖锐吸收峰可表征叔醇中—OH的伸缩振动, 3 439 cm-1的强宽峰可表征酚酸类成分中的羟基—OH的伸缩振动[13], 2 932和2 860 cm-1吸收峰是糖苷类成分中饱和亚甲基—CH2的反对称和对称伸缩振动, 2 513 cm-1表征累积双键—C=C—、 三键—C≡C—, —C≡N的吸收峰, 1 798和1 636 cm-1的吸收峰表征酯类以及有机酸中羰基C=O的伸缩振动[14]。

图1 不同间隔年限种植地黄土壤的光谱Fig.1 Soil spectra of Rehmannia glutinosa planted in different interval years

1 500~400 cm-1属于指纹区, 峰多且密集, 表征C—C, C—O, C—N等键的弯曲振动。 1 500~1 000 cm-1范围中1 433 cm-1的吸收峰表征亚甲基—CH2的面内弯曲振动, 1 029 cm-1吸收峰表征C—O的伸缩振动和C—OH的弯曲振动。 887 cm-1表征C—C键的伸缩振动吸收, 900~500 cm-1是苯环的特征吸收区。 783, 695和533 cm-1附近的吸收峰表征取代芳烃的骨架振动的特征吸收。 由图3还可以看到在3 621, 3 439, 1 798, 1 636, 1 029, 783和695 cm-1处, YA-two的吸收强度比YA-one、 YA-ten、 CK都大, 这些吸收峰多代表羟基—OH、 羰基C=O、 C—O、 苯环的取代官能团。 而官能团都含有酚酸类成分, 结合杜家方[15]关于地黄连作中酚酸的动态变化, 可以判断本实验中地黄连作土壤中酚酸的含量较高。

2.4 不同间隔年限种植地黄土壤的二阶图谱

为了提高光谱分辨率, 区分重叠的特征峰, 增大信息量[15]。 对土壤样品红外光谱进行Norris平滑滤噪+二阶导数处理(图2和图3)。

图2 不同间隔年限地黄种植土壤的二阶光谱(4 000~1 200 cm-1)Fig.2 Second-order spectra of Rehmannia glutinosa planting soils with different interval years (4 000~1 200 cm-1)

图3 不同间隔年限地黄种植土壤的二阶光谱(1 200~400 cm-1)Fig.3 Second-order spectra of Rehmannia glutinosa planting soil at different interval years (1 200~400 cm-1)

二阶导数光谱的极小值点(波谷)对应原始光谱的吸收峰位置, 从图4中可以明显看到在4 000~1 200 cm-1波段中的差异性。 其中, 3 750 cm-1在CK、 YA-one、 YA-ten中都有明显吸收峰, 但在样品编号YA-two中。 在3 652 cm-1附近, CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten曲线都出现了吸收峰, YA-two的吸收峰强度最大。 在2 925和2 857 cm-1吸收位置处是糖苷类中饱和亚甲基—CH2的伸缩振动, CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten在此位置处都有吸收, 但不同的是YA-two的吸收强度最小, YA-ten的吸收强度最大。 说明重茬土壤中, 糖苷类成分下降。 1 743 cm-1吸收区CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten都出现了吸收峰, 而YA-two的吸收强度最小。

图4 YA-one的二维红外相关光谱
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1Fig.4 2D-IR of YA-one
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1

在1 548 cm-1出现芳环和芳杂环的特征吸收峰, CK、 YA-one、 YA-ten有两小吸收峰, 不太明显, 但YA-two在此波段的两个小吸收峰合并成一个。 1 488 cm-1处CK、 YA-one、 YA-ten都出现了吸收峰, 但YA-two的吸收峰不明显几近消失。

1 200~400 cm-1范围(图3), 在1 002和800 cm-1处CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten都出现了吸收峰, 但YA-two的吸收强度最大。 YA-two在937 cm-1处有吸收, CK、 YA-ten没有吸收, YA-one也有吸收, 但吸收强度没有YA-two大。 在844 cm-1处CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten均出现了吸收峰, 但是YA-two的吸收强度最小, 几乎消失。 从红外光谱、 二阶谱图中可以看出, CK、 YA-one、 YA-two、 YA-ten四种土壤在相同的吸收峰位置处, 吸收强度不同。 在3 621, 3 439, 1 798, 1 636, 1 029, 783, 533和472 cm-1处, 以YA-two的吸收强度最大, 这些吸收峰多表征酚酸中羟基—OH、 羰基C=O、 C—O、 苯环的取代吸收等官能团, 说明在重茬的地黄中, 酚酸类物质积累。 在2 925和2 857 cm-1表征糖苷类中饱和亚甲基—CH2的反伸缩振动和对称伸缩振动, YA-two的吸收强度最小, YA-ten的吸收强度最大。 表明重茬土壤中, 糖苷类成分下降。 随着土壤种植地黄的间隔年限增加, 土壤经过十年的自我修复, 糖苷类物质积累, 酚酸类成分逐渐消耗, 经过十年后再次达到可以种植地黄的适宜程度。

2.5 不同间隔种植年限的地黄土壤的二维相关谱

二维相关红外光谱(2D-IR)是利用不同的外界微扰(如温度), 在第二维度上展开FTIR 光谱。 二维光谱可以提高光谱的分辨率, 将重叠峰甚至是被掩盖的一些小峰清晰地显示出来, 可用于研究各组分基团分子振动行为的差异, 简化复杂光谱的重叠峰, 揭示各官能团的相互作用[16]。 原谱图在指纹区重叠峰较多, 为了更明显地提高分辨率, 得到更为细致的光谱图, 以未种植地黄的土壤(CK)为标准, 对样品YA-one、 YA-two、 YA-ten在920~1 750 cm-1波段进行二维红外相关光谱处理, 又进一步选取特征波段1 490~1 710和1 500~1 548 cm-1得到图4, 图5和图6。

图5 YA-two的二维红外相关光谱
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1Fig.5 2D-IR of YA-two
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1

图6 YA-ten的二维红外相关光谱
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1Fig.6 2D-IR of YA-ten
(a): 920~1 750 cm-1; (b): 1 490~1 710 cm-1; (c): 1 500~1 548 cm-1

图4是YA-one的二维红外相关光谱, 在(a)波段920~1 750 cm-1, 有5个自动峰[18]1 033, 1 634, 1 655, 1 679和1 682 cm-1; 1 033和1 655 cm-1这两个自动峰强度最大; 有三组交叉峰, 按照强弱顺序依次为(1 655, 1 033), (1 550, 1 033)和(1 655, 1 550) cm-1。 在(b)波段1 490~1 710 cm-1, 有1 508, 1 542, 1 550, 1 628, 1 634, 1 655, 1 679和1 682 cm-18个自动峰, 其中1 634和1 655 cm-1这两个自动峰最为明显; 在此波段的交叉峰按照强弱顺序依次为(1 655, 1 634), (1 682, 1 655), (1 682, 1 634), (1 655, 1 550)和(1 655, 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500~1 548 cm-1中, 有1 506和1 542 cm-1这2个自动峰; 还有(1 542, 1 524)和(1 518, 1 506) cm-1这2组交叉峰。

图5是YA-two的二维红外相关光谱, 在(a)波段920~1 750 cm-1, 有两个自动峰, 分别为1 033和1 634 cm-1, 1 033 cm-1的自动峰比1 634 cm-1强; 但在此波段没有交叉峰。 在(b)波段1 490~1 710 cm-1, 有1 542, 1 603和1 634 cm-1三个自动峰, 1 603和1 634 cm-1这两个自动峰相对较强; 还有两组交叉峰, 按照强弱顺序依次是(1 634, 1 603)和(1 628, 1 542) cm-1。 在(c)波段1 500~1 548 cm-1中, 出现一个很强的自动峰, 为1 542 cm-1, 一组交叉峰, 为(1 542, 1 524) cm-1。

图6是YA-ten的二维红外相关光谱, 从图中可以看到, 在(a)波段920~1 750 cm-1, 有4个自动峰, 分别为1 033, 1 628, 1 634和1 655 cm-1, 其中1 033和1 634 cm-1这2个自动峰更为明显; 在此波段中还有5组交叉峰, 按照强弱顺序依次为(1 655, 1 628), (1 634, 1 033), (1 655, 1 033), (1 634, 1 550), (1 679, 1 634)和(1 550, 1 033) cm-1。 在(b)波段1 490~1 710 cm-1中, 有5个自动峰, 分别为1 550, 1 628, 1 634, 1 655和1 682 cm-1, 其中1 628, 1 634和1 655 cm-1这3种自动峰较为明显; 在此波段中, 还有3组交叉峰, 按照交叉峰的强弱顺序依次为(1 655, 1 628), (1 682, 1 634)和(1 634, 1 550) cm-1。 在(c)波段1 500~1 548 cm-1中, 有3组自动峰最明显, 分别为1 506, 1 542和1 550 cm-1; 在此波段中, 有6组交叉峰, 按照交叉峰强弱顺序依次为(1 542, 1 506), (1 518, 1 506), (1 548, 1 506), (1 548, 1 542), (1 530, 1 506)和(1 542, 1 518) cm-1。

综上所述, 不同间隔种植年限的地黄土壤在波段920~1 750, 1 490~1 710和1 500~1 548 cm-1中, 自动峰和交叉峰的位置、 个数、 以及强弱都不相同, 说明二维红外相关光谱可以用来区分不同种植茬次的地黄土壤。

3 结论

不同连作茬次地黄土壤的红外峰形基本相似, 红外光谱主要特征吸收峰在3 621, 3 439, 2 932, 2 860, 2 513, 1 798, 1 636, 1 433, 1 029, 887, 783, 695, 546和469 cm-1附近。 且共有峰较多, 可显示地黄土壤的光谱特征。 经二阶求导放大的图谱的差异性后, 部分特征吸收峰表现出位置、 吸收强度的差异。 在波段920~1 750, 1 490~1 710和1 500~1 548 cm-1中二维红外相关光谱, 自动峰和交叉峰的位置、 个数、 以及强弱均不相同, 清晰地显示出官能团的差异。 这些吸收峰多代表酚酸中羟基—OH、 羰基C=O、 C—O、 苯环的取代吸收等官能团, 说明在重茬的地黄中, 酚酸类物质积累、 糖苷类成分减少。 表明经过不同连作茬次的地黄土壤中化学成分和含量发生了变化, 化学成分及其含量的变化可能是引起地黄连作障碍的因素之一。 基于不同连作茬次地黄土壤中化学成分以及含量的变化差异傅里叶红外光谱技术和二维红外相关光谱能够实现土壤中有机化合物的快速检测, 为地黄连作障碍深入研究提供参考。

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