二水合柠檬酸三钠, 硝酸银均购自国药集团化学试剂有限公司, 试剂均为分析纯; 电阻率18.2 MΩ 的超纯水从Milli-Q Plus水净化系统(Millipore Corporation)获得。 紫外可见分光光度计(SHIMADZU UVmini-1280)用于分析银纳米溶胶的消光光谱; 便携式拉曼光谱仪(厦门赛纳斯科技有限公司, SHINS-P785X)用于采集待测尿液的拉曼信号。

银纳米粒子的合成采用柠檬酸钠还原法, 将100 mL 1.5 mmol·L^-1硝酸银溶液加热煮沸, 再一次性快速加入5 mL 1 Wt%的柠檬酸钠溶液, 继续煮沸冷凝回流3 h, 待银溶胶冷却到室温后, 置于4 ℃冰箱中保存待用。 银溶胶的紫外可见吸收光谱通过紫外-可见分光光度计测试。

志愿者状态: 选择志愿者7名, 均为中国男性公民, 年龄29~45岁, 身高165~180 cm, 体重指数(BMI)18.5~24, 高中及以上文化程度, 无政治性问题, 身体健康, 不嗜烟酒, 有一定锻炼习惯, 无药物依赖, 无心理疾病、 精神、 遗传病和传染病病史, 无器质性疾病(特别关注骨骼和心血管系统疾病)和地域性疾病, 无严重过敏史, 体内无金属植入物, 无营养不良。 受试者事先接受实验背景和意义的培训和教育, 以提高受试者的依从性。

志愿者分组尿液样品收集: 为了降低个体代谢差异对实验结果的影响, 7名志愿者均参与三组能量摄入量的实验, 即依次参与1 500组, 2 030组, 2 700组实验。 具体能量摄入量及营养摄入比例见表1。 每组实验为期3天, 每天收集受试者晨尿, 每份3 mL。 每组实验间隔一周洗脱期, 避免组间相互干扰。 洗脱期膳食条件为2 030 千卡·日^-1标准摄入量。 整个实验总共收集63份尿液样品, 所有样品收集后立即保存于-20 ℃, 测试前恢复到室温, 避免多次冻融。 尿液无需任何前处理, 可直接用于后续的检测。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 能量摄入量分组情况及营养摄入比例 Table 1 Energy intake and nutrient intake rations of three groups 分组 摄入能量 /(千卡·日-1) 碳水化合物 /% 脂肪 /% 蛋白 /% 参试 人数 1 500组 1 500±15 63±0.5 25±0.5 12±0.5 7 2 030组 2 030±20 63±0.5 25±0.5 12±0.5 7 2 700组 2 700±27 63±0.5 25±0.5 12±0.5 7

表1 能量摄入量分组情况及营养摄入比例 Table 1 Energy intake and nutrient intake rations of three groups

采用便携式拉曼光谱仪对尿液样品进行信号采集。 具体步骤如下: 用移液枪吸取80 μL尿液与210 μL银纳米溶胶混匀, 利用尿液中含有的盐离子诱导银纳米溶胶的团聚。 使用便携式拉曼光谱仪采集团聚后的银溶胶拉曼信号, 即可获得尿液的表面增强拉曼光谱。 测试参数为: 激发光波长为785 nm、 激光功率100 mW、 采集的波数范围为300~2 000 cm^-1、 积分时间3~8 s、 累积次数2次。 每分样品平行测试3次, 总共采集189条光谱。

谱峰分析: 求每组光谱特征谱峰波段的峰面积。 将求得的峰面积值数据集采用箱线图分析, 分别计算其数据的最小值, 第一四分位数(25百分位数), 中位数, 第三四分位数(75百分位数)和最大值。

主成分分析(PCA): 对收集到的尿液SERS谱图进行主成分分析, 建立分类模型。 为了避免采集过程的信号波动带来偏差, 需要对所有光谱数据进行归一化, 即将光谱强度值除以采集时间、 除以采集功率。 计算得到的光谱数据集可进行主成分分析。 下面是具体的计算过程:

(1)对所有的光谱计算一阶导差分谱, 以消除荧光背景干扰;

(2)利用MATLAB R2017a软件中的统计和机器学习工具包对上述的一阶导差分谱(1 500组、 2 030组和2 700组)进行主成分分析;

(3)绘制主成分1(PC1)和主成分3(PC3)的散点图, 计算两个主成分的贡献率;

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA): 将采集的尿液SERS光谱进行归一化处理, 然后合并成为一个数据集并对每个样本做好归类标签。 将得到的样本数据矩阵导入到SIMCA-P(版本14.1)软件中进行OPLS-DA分析。 在建立模型过程中, 不断增加引入主成分的个数, 直到模型的解释方差(R²)或者模型的预测方差(Q²)增长率不超过2%, 建立模型的有效性通过置换检验(200次迭代)来确认, 特异性和敏感性通过ROC分析进行检验。

图1为银溶胶的紫外可见吸收光谱图。 从图中可以看到, 未团聚的银纳米溶胶在402 nm处有吸收峰, 该峰为银纳米粒子的偶极吸收峰。 银纳米粒子团聚后在725 nm处新增一峰, 该峰是银纳米团聚体的共振峰, 峰很宽主要是由非均匀加宽效应引起的, 团聚后的银纳米溶胶在402 nm处仍然有微弱的吸收峰, 该峰可能是由于团聚过程仍然有部分银纳米粒子没有团聚所引起的。 700~800 nm的宽吸收峰可以与785 nm激发光匹配, 有利于实现最大化的拉曼信号增强。

图1

Fig.1

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	图1 银溶胶的团聚前后的紫外可见吸收光谱图Fig.1 UV-Vis absorption spectra before and after agglomeration of silver sol

用便携式拉曼光谱仪采集三个分组的SERS光谱, 原始谱图中带有部分荧光背景。 为了观察组间差异, 对每个分组内所有光谱取平均后采用B样条插值拟合法校正基线, 三组平均谱图对比展示于图2。

图2

Fig.2

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	图2 三组SERS数据的平均光谱(基线校正)Fig.2 Average spectra of three groups of SERS data (baseline-corrected)

尿液中含有大量的盐离子, 可以破坏银溶胶的介稳性, 使其发生团聚。 在银纳米粒子团聚的过程中受到激光辐照时, 粒子与粒子间隙处可以形成等离激元热点。 间隙处的分子的拉曼信号被急剧放大。 因此从光谱图上, 可以观察到很多谱峰特征。 如图2所示, a所指的谱峰, 如375, 485和567 cm^-1等峰归属于乳糖分子^[7]。 b所指的谱峰1 003和1 560 cm^-1等峰归属于尿素^[8]。 c所指的谱峰718 cm^-1归属于次黄嘌呤^[8]; d所指的谱峰855 cm^-1归属于肌酐^[11]; e所指的谱峰650和1 350 cm^-1归属于黄嘌呤^[9]; f所指的谱峰1 218 cm^-1归属于黄蝶呤^[9]。 据报道不同膳食条件下, 志愿者群体的尿液表现出不同的代谢物比例^[12]。 但是由于SERS 光谱是在复杂的尿液基质中获得的, 通过候选分子的拉曼光谱与尿液样本的SERS光谱比对可以进行初步成分分析。 虽然可以分析候选的成分, 但很难清楚地解析出具体的物质比例, 因为具有相似化学结构的分子可以在相似的光谱范围内产生谱峰, 从而掩盖了精确的成分比例。

在平均光谱图的比较中, 组别之间差异较大的谱峰波段位于538~588和835~869 cm^-1。 我们对这两个波段展开统计分析(如图3所示)。 分别计算每组样本光谱在此两波段的谱峰面积, 并采用T检验计算组间的p值。 从538~588 cm^-1波段统计分析中看出, 1 500组与2 030组、 2 030组与2 700组的p值小于0.05, 存在显著统计学差异。 1 500组与2 700组的p值过大, 统计学上无显著差异。 在835~869 cm^-1波段, 仅仅2 030组与2 700组之间存在统计学上差异。 然而从箱线框分析, 组与组存在许多重叠分布, 很难找到可以清楚区分三组的阈值。

图3

Fig.3

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	图3 不同波段不同分组的峰面积统计分析Fig.3 Statistical analysis of peak areas of different bands and groups

对于SERS光谱的多变量分析, 采用在波长范围为300~2 000 cm^-1的光谱数据集进行无监督的PCA和有监督的OPLS-DA建模。 在进行PCA分析之前, 对所有光谱数据求一阶差分谱, 以排除背景信号的干扰。 对数据集开展主成分分析后, 绘制散点分布图(如图4所示)。 图4(b)展示了基于第一主成分(PC 1)和第三主成分(PC 3)的散点分布图, 低、 中、 高能量摄入量的三组之间具有一定分类趋势。 三组的PCA结果表明, 所有变量的60.3%可以通过PC 1和PC 3解释, 其中PC 1占总数的58.1%, PC 3占2.2%。 三个不同能量摄入量的分组主体能进行区分, 但是存在部分的散点交叠, 比如1 500组与2 700组。 另外2 030组的散点分布范围较宽, 与1 500组、 2 700组存在较大重叠。 从直观上看散点分布, 三组的区分效果一般。 为了获得>80%的原始数据集的主变量, 对于此三组的比较需要使用前33个主成分(数据未展示)。 为了比较, 原始SERS光谱也进行了PCA分析[如图4(a)所示], 三组的PCA散点分布图彼此存在大量重叠。 因此, 基线校正的SERS光谱比原始SERS光谱进行PCA更有效。

图4

Fig.4

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	图4 三组数据的主成分分析得分散点图Fig.4 Score scatter plotsof the three groupsgenerated by PCA

为了进一步有效地区分, 我们采用了有监督的分类算法——正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。 PCA仅使用独立变量(X)计算获得新的主成分, 而OPLS-DA通过建立新的变量阐释独立变量和依赖变量(Y)之间的相关性, 用于阐释光谱的之间的关联性。 我们采用原始SERS光谱进行OPLS-DA建模, 三组的散点分布图如图5(a)所示, 可视化的分类结果非常好。 所有的189份SERS光谱均能被正确分类。 为了检验分类模型的准确性, 对模型进行ROC(receiver operating characteristic)分析, 从图6(b)中可以看出, 三个分类的AUC(area under curve)均为1, 说明模型具有100%的敏感性, 100%特异性, 100%准确性。 在OPLS-DA分析模型中, R²=1表示模型的完美拟合, Q²=1表示完美的可预测性, 通常Q²接近R²Y较佳, Q²值≥ 0.4的生物模型通常被认为是可靠且可接受。 此三分类的模型中R²Y(拟合性能)和Q²(预测性能)分别为0.961, 0.691。 两者差值为0.27, 小于0.3。 说明此模型拟合效果很好, 预测效果良好并且模型是可靠的。 为了进一步区分, 对每两个实验组都进行OPLS-DA分析, 得到的散点分布图如图5(b, c, d)所示, 其R²Y和Q²分别为0.938, 0.792; 0.995, 0.853和0.956, 0.764。 从数据中可以看出二分类的拟合效果都非常好, 预测能力较三分类的有所提升。 说明采用OPLS-DA模型, 二分类的效果较佳。 此外, 为了检验三分类模型的有效性, 我们开展了置换检验。 置换检验图[图6(a)]可以检查OPLS-DA模型的有效性, 评估标准是左侧R²和Q²的值低于右侧原始点的值。 其中, R²表示由Y预测解释的训练集中的变化百分比, Q²表示基于交叉验证模型预测的训练集中的变化百分比。 经过200次置换试验后, 三组的初始R²和Q²均低于原始R²和Q²值, 表明模型是可靠有效的。 因此, 本研究中的OPLS-DA模型表现出对不同能量摄入量尿液SERS谱图的高预测性和高可靠性。

图5

Fig.5

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	图5 OPLS-DA分析三组与每对分组的散点分布图Fig.5 Scatter plots of three groups and each pair of groups generated by OPLS-DA

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 (a)三组分类模型的置换检验散点图; (b)三组分类模型的ROC分析曲线Fig.6 (a) Permutation test of three-group classification model; (b) ROC analysis curve of three-group classification model

分析结果表明, 使用银溶胶进行非侵入性的能量摄入量尿液SERS分析是可行的。 虽然在本研究中只分析了小规模的样本数据, 但这些结果很有指导意义, 今后需要拓展更大数量的样品研究。 与传统的膳食回顾法相比, 使用银溶胶的SERS能量摄入量分析具有成本低, 简单快速准确的优点。 该方法如果与手持式拉曼光谱仪结合使用, 可以在家中实现每日能量摄入量的分析, 为合理安排膳食提供指导性意见。