细胞培养: 人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7, MDA-MB-231购自国家实验细胞资源共享平台(National Infrastructure of Cell Line Resource, NICR)。 MCF-10A和MCF-7在DMEM/High Glucose培养基中培养, MDA-MB-231则用RPMI 1640培养基培养, 并补充10%无外泌体的胎牛血清和1%青霉素-链霉素, 37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养。

纳米金溶胶(colliodal Au nanoparticles, AuNPs)采用化学还原法合成^[9], 其在532 nm处有最大吸收峰, 金颗粒的平均粒径约为(50± 12) nm。 以金溶胶为增强基底, 采用显微共聚焦拉曼光谱仪(Renishaw, inVia, UK)收集细胞和外泌体的SERS信号。

单细胞SERS检测: 制备细胞悬液滴加至放有石英玻片的培养皿中, 于37 ℃, 5% CO₂条件下培养4 h, 待细胞贴壁后补加新鲜的培养液2 mL。 待细胞密度长至70%左右时, 取出石英玻片并用PBS清冼3遍, 滴加100 μ L AuNPs进行检测。 检测条件为785 nm, 1 200 l· mm^-1光栅, 1% (1 mW)激光功率, 积分时间20 s, 积分1次, 光谱分辨率为2 cm^-1。

外泌体SERS检测: 按常规方法培养细胞, 待细胞长到60%~70%后, 更换新鲜DMEM培养基, 添加10%无外泌体胎牛血清和1%青霉素-链霉素, 在恒温37 ℃、 5% CO₂细胞培养箱中连续孵育48 h。 待细胞铺满瓶壁90%后, 取5 mL细胞培养上清液。 按照差速离心结合超速离心方法进行外泌体收集^[10]。 取3 μ L外泌体提取液与3 μ L AuNPs混合后滴加到石英玻片上立即检测。 检测条件为: 功率0.5% (0.5 mW) , 积分时间为10 s, 其余同上。

原始数据用激光共聚焦拉曼光谱仪(Renishaw)配置的Wire 4.1软件(inVia)进行预处理, 从原始光谱中去除宇宙射线, 并进行基线校正, 以减少荧光背景和仪器噪声的干扰。 通过Savitsky-Golay平滑算法对数据进行平滑处理, 采用Origin (2018)软件进行绘图, 使用SPSS 26.0和SIMCA 14.1软件进行多元统计分析。

采用差速离心结合超速离心的方法获得细胞来源的外泌体, 呈圆盘状, 平均粒径主要为110 nm, 与文献报道一致^{[7, 8]}。 如图1所示, 以AuNPs为增强基底, 将外泌体与AuNPs混合后直接收集其信号, 在10s内可以获得其拉曼图谱, 分别采集了乳腺癌细胞MDA-MB-231、 MCF-7和乳腺上皮细胞M-10A来源的外泌体SERS图谱35张[图2(a)]。 在图2(a)中, 彩色实线为35组数据的平均值, 灰色区域为标准偏差, 三组外泌体的标准偏差分别为2.13%、 3.82%和3.57%, 说明该方法具有较高的重现性。 外泌体在500~1 600 cm^-1波段范围内有特征拉曼信号, 特征峰清晰显著, 不同外泌体的峰形、 峰位置不同, 说明该方法具有较高的特异性和灵敏度。 由于所采用的共聚焦显微拉曼光谱仪的光斑面积为1.8 μ m× 30 μ m, 能覆盖整个外泌体, 因此收集的拉曼光谱信号是外泌体整体信息的呈现。 同样, 分别采集了乳腺癌细胞 MDA-MB-231、 MCF-7和乳腺上皮细胞M-10A的SERS图谱40、 48和59张, 绘制其平均图谱, 标准偏差分别为9.14%、 12.50%和8.37%[图2(b)]。

图1

Fig.1

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	图1 乳腺癌细胞及外泌体SERS检测流程Fig.1 Detection process of breast cancer cells and their exosomes by SERS

图2

Fig.2

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	图2 乳腺癌细胞及外泌体SERS图谱 (a): M-231、 MCF-7和M-10A细胞来源的外泌体的SERS图谱; (b): 三组细胞的SERS图谱; (c): 外泌体与细胞的SERS平均图谱Fig.2 SERS profiles of breast cells and exosomes (a): SERS of exosomes derived from M-231, MCF-7 and M-10A cells; (b) SERS of M-231, MCF-7 and M-10A cells; (c): Average SERS of exosomes and breast cells

为了比较外泌体与细胞的整体特征, 本实验共采集255 780组数据。 将外泌体与细胞的拉曼数据分别取平均值, 绘制SERS平均图谱, 如图2(c)所示, 外泌体与细胞的误差分别是9.97%和11.34%。 从图2中可以清晰地看到, 外泌体在650~760 cm^-1波数范围内, 特征峰信号更强, 峰更加尖锐, 尤其是735 cm^-1, 该特征峰归属于核酸振动。 除此之外, 特征峰963和1 318 cm^-1在外泌体中的信号也较强。 这可能是因为外泌体结构相较于细胞而言更为简单, 生物大分子的信息更容易被展现。 综上, 采用直接检测的方法简单、 无需标记, 显著缩短了SERS信号的收集时间, 短短几十秒即可获得细胞和外泌体的整体生化信息, 且信号稳定, 是所采集

样品的整体信号的呈现, 为肿瘤快检提供一种新的研究思路。

将收集的所有SERS数据进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)和主成分线性判别分析(principal component analysis-linear discrimination analysis, PCA-LDA), 将光谱数据转化成模型更直观地呈现。 OPLS-DA和PCA-LDA均是无监督学习算法。 OPLS-DA将变量从255 780减少到5个预测主成分(t), 占总变量的85.17%。 以t₁(18.21%)和t₂(18.41%)绘制得分散点图, 如图3(a)所示每一个点均代表一个样本, 可以看出三株细胞样本与外泌体样本可以完全区分开来。 同时, 三株细胞来源的外泌体也能够100%区分, 说明将外泌体与细胞的SERS数据混合时, 仍然具有很强的区分度。 从图3(a)中可以看出, 三株细胞样本聚集在了一起, 提示三株细胞的相似性高, 共性更强。

图3

Fig.3

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	图3 乳腺癌细胞及外泌体的散点图分析 (a): 乳腺癌细胞及外泌体的OPLS-DA分析; (b): 乳腺癌细胞与正常细胞的PCA分析; (c), (d): 乳腺癌细胞的PCA分析与OPLS-DA分析Fig.3 Scatter plot of breast cancer cells and their exosomes (a): OPLS-DA model of breast cells and their exosomes; (b): PCA model of breast cancer cells and normal cells; (c), (d): PCA model and OPLS-DA model of different types of breast cancer cells

采用PCA分析, 对非肿瘤细胞(M-10A细胞)和癌细胞(MCF-7和M231)进行进一步的鉴别, 提取特征值大于1的主成分, 以PC3和PC4作图, 可以看出乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞被有效的聚集成两类, 说明该模型能够将乳腺癌细胞与正常细胞区分开来, 准确率为83.7%[图3(b)]。 乳腺上皮细胞主要聚集在PC3大于0且PC4小于1的区域, 根据PC3载荷图提取特征信息, 发现乳腺上皮细胞与乳腺癌细胞在732~738、 753~761、 996~1 037、 1 317~1 367和1 567~1 568 cm^-1等波段存在差异。

为了进一步区分不同类型的癌细胞, 采用PCA-LDA和OPLS-DA分析, 对两株乳腺癌细胞进行建模判别。 以60组拉曼图谱作为训练集建立分类模型, 结果如图3(c)和(d)所示, PCA-LDA和OPLS-DA模型中的大部分样本落在95%的置信区间(椭圆区域), 只有少数几个样本落在置信区间以外。 但在PCA-LDA模型中, 有一些样本存在重叠, 而OPLS-DA模型则将MCF-7和M231细胞100%进行了归类。 以18组MCF-7细胞和10组M231细胞的SERS数据作为测试集, 在上述建立的判别模型中进行Cross-validation验证。 PCA-LDA和OPLS-DA判别模型对MCF-7细胞和M231细胞的判别准确度分别为82.12%和85.71%(表1), 表明两个模型均适用于不同类型乳腺癌细胞的鉴别, OPLS-DA模型的灵敏度和特异度更高。 该结果说明OPLS-DA模型更适合对不同类型的癌细胞进行判别, 同时也提示将SERS技术与OPLS-DA分析相结合有望成为揭示细胞异质性规律的有利工具。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 PCA-LDA和OPLS-DA模型的判别结果 Table 1 Classification results of PCA-LDA and OPLS-DA model 判别模型 实际组 预测组 总数 灵敏度 /% 特异度 /% 准确率 /% MCF-7 M231 PCA-LDA MCF-7 M23 14 1 4 9 18 10 90.00 77.78 82.12 OPLS-DA MCF-7 M231 15 1 3 9 18 10 90.00 83.33 85.71

表1 PCA-LDA和OPLS-DA模型的判别结果 Table 1 Classification results of PCA-LDA and OPLS-DA model

为进一步探索外泌体与其母源细胞SERS图谱的相关性, 将每株细胞及其外泌体进行PCA分析, 提取主成分, 根据PC1载荷图信息, 选取Loading value大于等于0.7的值进行特征提取[图4(a, c, e)], 得出三株细胞与其外泌体的差异波段, 如图4(b, d, f)中的红色标记。 对比分析图4(b, d, f), 不难发现, 在650~760、 1 200~1 300和1 400~1 500 cm^-1等波段, 三组外泌体的SERS信号均相较其细胞更强, 峰更典型, 峰归属见表2。 说明这些波段所代表的核酸、 蛋白质等信息在外泌体里更容易被表征, 这可能与外泌体的结构更为简单有关。

图4

Fig.4

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图4 乳腺细胞及其外泌体的SERS图谱比较 (a) M-10A细胞及其外泌体的PC1载荷图及(b) SERS图谱比较; (c) M-231细胞及其外泌体的PC1载荷图及(d) SERS图谱比较; (e) MCF-7细胞及其外泌体的PC1载荷图及(f) SERS图谱比较Fig.4 Comparison of SERS profiles of breast cells and their exosomes (a) PC1 loading plot and (b) Comparison of Raman spectra between M-10A cell and exosome; (c) PC1 loading plot and (d) Comparison of Raman spectra between M-231 cell and exosome; (e) PC1 loading plot and (f) Comparison of Raman spectra between MCF-7 cell and exosome

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 乳腺细胞与其外泌体的特征峰归属与比较 Table 2 Attribution and comparison of the characteristic peaks of breast cells and their exosomes 特征波段比较/cm-1 M231/MCF-7/M-10A Assignments 外泌体 细胞 差异波段 650~760 735↑ ↓ Adenine ring breathing[11] 940~980 963↑ 限或弱 Adenine C— N deformed vibration[12] 1 200~1 267 1 248↑ 1 248↓ Amine Ⅲ of proteins[13] 1 300~1 336 1 318↑ 无或弱 Amine Ⅲ [7, 13] 1 400~1 500 1 473↑ 1 473↓ C— H2 deformation of lipid[14] 相似波段 506~569 553 554 S— S stretching of disulfide bridges in cysteine[15] 564 568 Tryptophan/Cytosine, Guanine[16] 580~638 625 Deformation vibration of adenine ring, phenylalanine C— C torsional vibration 637 628~637 C— S stretching vibration, L-tyrosine[17] 748~847 755 755 Thymine ring breathing[14] 770 770 C— S bond stretching, O— P— O breathing, Cytosine, Uracil[12] 824 824 Proline, Hydroxyproline, Tyrosine[18] 1 010~1 070 1 026~1 029 1 026~1 029 C— H stretching mode of phenylalanine[19] 1 075~1 122 1 114 1 115 C— N stretching mode of proteins[16], DNA backbone[20], PO2 symmetric stretching[14] 1 237~1 248 1 240 1 240 protein (amide Ⅲ band), Adenine, Thymine[13] 1 430~1 433 1 432 1 432 Phospholipids[14] 1 493~1 522 1 499~1500 Guanine, Adenine[20]

表2 乳腺细胞与其外泌体的特征峰归属与比较 Table 2 Attribution and comparison of the characteristic peaks of breast cells and their exosomes

细胞与外泌体之间存在许多相似的波段, 如506~569、 580~638、 748~847 cm^-1等[图4(b, d, f)黑色标记], 这些波段中既有代表核酸的特征峰, 也有代表蛋白质、 脂质的特征峰, 峰归属见表2, 这些特征峰不是很强, 所代表的物质可能属于细胞和外泌体的基础组成成分, 这些相一致的特征峰说明了外泌体的“ 母源性” 。

外泌体作为肿瘤新型标志物, 在SERS图谱上呈现出与其母源细胞相似的一些信息, 这些信息主要归属于核酸、 蛋白质、 脂质等物质。 外泌体与细胞在650~760、 1 200~1 267、 1 300~1 336 cm^-1等波段呈现出差异。 通过对乳腺癌细胞和外泌体的SERS快速检测与比较, 可以将二者之间的“ 相关性” 更直观地呈现出来, 为探究外泌体在肿瘤微环境以及肿瘤的侵袭与转移中的作用提供新的视角。